معلومة

تفسير منحنيات qPCR: كيف أجد قيمة Ct في حالتي؟

تفسير منحنيات qPCR: كيف أجد قيمة Ct في حالتي؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أنا أقرأ نتائج qPCR الخاصة بي وليس لدي أي فكرة عن سبب إرجاع قيمة Ct على النحو التالي:

هذا هو منحنى qPCR لعيناتي ، وقد أعاد البرنامج قيم Ct لمعظم المنحنيات كما هو موضح: 33.99-38.4 للمنحنيات ذات خط الأساس السفلي. المشكلة هي المنحنيات 2 (البحرية والأسود) مع خط أساس أعلى في المقام الأول. قرأت قيم Ct لهذه المنحنيات على أنها 32-33 ، لكن البرنامج يقول أن قيم Ct هي 35.4 لهذه المنحنيات.

ماذا يمكن أن تكون المشكلة وما هي الإجابة الصحيحة ، قيمي أو البرامج؟ شكرا لك مقدما!


البرنامج صحيح. تم اختيار قيم $ C_t $ لتكون أعلى من الخلفية بدرجة كافية. كما ترى ، يختلف مستوى الخلفية اختلافًا كبيرًا بالنسبة لاثنين من المنحنيات ، لذلك لا يمكنك استخدام نفس حد الإشارة لتحديد $ C_t $ الخاصين بهم.


تفسير أشكال منحنى qPCR.

في فحص هذا الشهر للموضوعات ذات الأهمية في مختبر التشخيص الجزيئي ، سنلقي نظرة على العمود الفقري للعديد من طرق الإرسال المفرد أو تعدد الإرسال منخفض التعقيد - تفاعل البلمرة المتسلسل في الوقت الفعلي (PCR) - وننظر في أي نوع من المعلومات التي يمكننا الحصول عليها من شكل منحنى التضخيم. الملاحظات التي سننظر فيها صالحة أيضًا لكل من طرق الوقت الفعلي القائمة على المسبار والملزمة القائمة على الصبغة ، وكما سنكتشف أدناه ، يمكن أن توفر درجة ملحوظة من البصيرة لما قد يحدث في التفاعل جيدًا.

لنبدأ بالنظر في شكل منحنى تضخيم qPCR الكلاسيكي "العادي" كما هو موضح في الشكل 1. كما هو موضح بشكل عام ، هذا شكل سيني مع ما سنشير إليه على أنه ثلاث مراحل أو مناطق ظاهرة واضحة بصريًا. تكون المرحلة الأولى (حتى حوالي الدورة 15 أو نحو ذلك في الشكل 1) بالقرب من خط الأساس مع وجود اتجاه تصاعدي بطيء في الخط. المرحلة الثانية هي تأرجح صعودي قوي في الخط ، بين الدورة 15 تقريبًا والدورة 30 من شكل بياناتنا التخيلي. أخيرًا ، المرحلة الثالثة ، بدءًا من الدورة 30 تقريبًا فصاعدًا ، هي هضبة حيث تنخفض إشارة التضخيم تدريجياً وتتوقف عن النمو.

نقطتان على المنحنى تهمنا بشكل خاص. إحداها هي قيمة CT على الرغم من أن التعريف الدقيق لهذا يعتمد على خوارزميات برنامج الأداة ، فهذه هي النقطة التي يرتفع فيها المنحنى بوضوح أولاً عن خط الأساس إلى درجة ذات دلالة إحصائية. (اعتمادًا على أداتك وبرامجك ، قد يُشار إلى هذا بدلاً من ذلك باسم CP). إن عبور عتبة الضوضاء الإحصائية هذه هو الأساس لاستدعاء عينة إيجابية في اختبار نوعي ، ورقم الدورة التي يحدث فيها هو الأساس لتوليد منحنى معياري وتحديد كمي لقالب البداية في PCR الكمي. النقطة الثانية - ليست ذات أهمية خاصة في المختبر الإكلينيكي اليومي ، ولكنها ذات صلة هنا - هي نقطة في منتصف الطريق إلى "المرحلة الثانية" الظاهرة من المنحنى ، حيث يوجد تغيير غير محسوس من المنحنى المتزايد في المنحدر في كل دورة ، إلى التناقص في المنحدر كل دورة ، أو ما يشير إليه عالم الرياضيات على أنه نقطة انعطاف.

بعد ذلك ، من المهم أن تدرك أن منحنى التضخيم المعروض على شاشتك ليس (بشكل عام) بيانات خام. تمت معالجتها من خلال برنامج الجهاز لتطبيق مرشحات قناة خاصة بالفلور أو تعويض وإزالة ضوضاء الخلفية ، وربما تخضع لخوارزميات تنعيم. المحاور العمودية هي الأكثر شيوعًا ليست الفلورة الكاملة ولكن التغيير لكل دورة في التألق. في الواقع ، إذا كان بإمكانك إلقاء نظرة على بيانات الفلورة الخام الخالصة مقابل بيانات الدورة (وفي معظم الأنظمة ، هناك طرق للقيام بذلك) ، فإن البيانات لن تشبه إلى حد كبير منحنىنا السيني الجميل. تساعد المعالجة المتنوعة التي يتم إجراؤها على البيانات الخام لجعل منحنىنا التقليدي في جعله أكثر قابلية للتفسير ، ولكن يجب أن يؤخذ في الاعتبار لأنه في بعض الحالات يمكن أن يؤدي إلى استنتاجات خاطئة.

مع وضع كل ذلك في الاعتبار ، دعنا نفكر في الأسباب التي تجعل المنحنى المعالج له الشكل المميز للشكل 1. المرحلة الأولى الظاهرة - إشارة قليلة أو معدومة - تنشأ بشكل أساسي بسبب حدود حساسية الجهاز. حتى في تفاعل PCR المثالي الافتراضي مع تضخيم مثالي مزدوج لكل دورة بدءًا من نسخة قالب واحد ، لا تستطيع الأدوات "رؤية" إشارة الفلورسنت من التضخيم حتى تصل إلى مستوى معين. هذا لا يعني أنه لا توجد إشارة فلورية في الخلفية يتم اكتشافها في هذه الدورات المبكرة ، وأنها تتقلب ، ولكن إشارة المنتج "الحقيقية" هي مكون صغير جدًا لهذه الإشارة.

هذا الضجيج في الخلفية مفيد في الواقع في العديد من الأدوات ، ويستخدم قياس ذلك لتعيين عتبة التصوير المقطعي المحوسب مع زيادة ذات صلة إحصائيًا خارج نطاق الضوضاء. (أي أن أي إشارة أعلى بكثير من هذا المستوى من الإشارة تؤخذ على أنها قادمة من amplicon.) لذلك نتوقع أن تكون مرحلة الدورة المبكرة هذه "مسطحة" بشكل أساسي في منحنى التضخيم ، وفي بعض الأنظمة ، نطبق هذا التوقع باعتباره الأداة: يُفترض أن أي اتجاه انجراف صغير في ضوضاء الخلفية يرجع إلى التغيرات في الفلوروفورات نفسها (اضمحلال المراسلين أو المبردات بسبب التدوير الحراري). تعمل خوارزميات الطرح في الخلفية بشكل عام لضمان أن هذه المرحلة المبكرة من منحنى التضخيم تبدو مسطحة. حتى أن البعض يذهب إلى أبعد من ذلك لتصحيح أي اتجاهات في الإشارة المكتشفة في هذه المرحلة بشكل فعال ، مضيفًا أو يطرح هذا المقدار من أجل "تسطيح" منطقة المنحنى المبكر.

تحدث المرحلة الظاهرة الثانية عندما تصبح إشارة الفلورسنت المشتقة من الأمبليكون قوية بدرجة كافية ليتم اكتشافها بشكل موثوق بواسطة الجهاز. في مرحلة مبكرة من ذلك ، يتم تجاوز قيمة التصوير المقطعي المحوسب ، وتكون نتائج الفحص لدينا إيجابية (ونحصل على رقم الدورة المقطعية مفيدًا للتقدير الكمي ، إذا رغبت في ذلك). عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عبارة عن نمو أسي مضاعف لكل دورة ويؤدي اكتشاف ذلك إلى مرحلة "نمو منحنى" قوية ومستقيمة في معظم أشكال مخططات التضخيم الشائعة.

تمامًا كما هو الحال في أي اقتصاد ، ومع ذلك ، فإن استخدام الموارد المحدودة (المواد الأولية ، والنيوكليوتيدات ، وحتى نشاط الإنزيم المتاح) في وعاء التفاعل يبدأ في النهاية في الحد من النمو ، حيث لم يعد بإمكان PCR العمل بأقصى كفاءة نظرية غير محدودة للموارد (مهما كان ذلك) 2.0 مثالي لكل دورة ، أو أي شيء أقل). هذه النقطة التي يبدأ فيها الحد من الموارد أولاً ، ببطء ، هي نقطة انعطافنا المذكورة أعلاه ، ومع تزايد حدّة الحد من الموارد بشكل تدريجي ، يتلاشى منحنى التضخيم وأخيراً الهضاب في مرحلتنا الثالثة ، مستنفدة للموارد بشكل فعال وغير قادر على النمو أكثر.

يعتبر منحنى تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يبدو مثل الشكل 1 بشكل عام علامة على تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل "الصحي". كمقياس مباشر لذلك ، يمكننا بالفعل الدخول وقياس ميل المنحنى خلال الجزء المبكر (نقطة الانقلاب) من طور المنحنى الثاني. اعتمادًا على الشكل الدقيق لمحور المنحنى ، يتم إجراء رياضيات مختلفة ، ولكن النتيجة هي قياس "N" في المعادلة N ^ (رقم الدورة) ، حيث يكون PVR الفعال تمامًا N = 2 (مضاعفة كل دورة) تقع فحوصات العالم الجيدة عمومًا في نطاق N & gt1.9. يمكن أن تزود العديد من حزم البرامج المستخدم بشكل مباشر بـ N لمقايسة PCR معينة ، إما من منحنى واحد (كما هو موضح هنا) أو خارج منحنى التخفيف القياسي.

المقياس الثاني الذي يمكننا اتخاذه من منحنى التضخيم الصحي هو قيمة CT كما تمت مناقشته أعلاه ، أو في الواقع مدى التأخر في بدء دورة منطقة المرحلة 2. يجب علينا بالطبع عدم تعيين أي ارتباط بين قيمة التألق في منطقة هضبة المرحلة 3 وتركيز قالب البداية. (إذا تحدث مؤلفك عن هذه النقطة على مدار ثلاث سنوات من هذه السلسلة ، فذلك لأنها لا تزال فكرة خاطئة شائعة جدًا!)

في حين أن معرفة رقم المنحدر الدقيق مفيد (إذا وجدت أنه 1.6 ، فإن الفحص الخاص بك يحتاج إلى تحسين الظروف) ، حتى المقارنة "بالعين" لشكل المنحنى مفيدة. إذا كان المنحنى الخاص بك يحتوي على منحدر ضعيف (منخفض) أو حتى مرحلة 2 لا يمكن تمييزها مثل الشكل 2 ، فهناك شيء غير صحيح. إذا كانت هذه ملاحظة عامة للمقايسة الخاصة بك على مواد قياسية نظيفة ، فإن أول شيء يجب مراعاته هو قيمة Tm للدورة. إذا كان هذا مرتفعًا جدًا ، فلن تتمكن البادئات المكبرة من الارتباط بمواقعها الأولية بأكبر قدر ممكن من الفعالية ، مما يقلل من الكفاءة القصوى لكل دورة ويؤدي إلى منطقة المرحلة 2 "البطيئة" (منخفضة الانحدار). إذا كانت هذه ملاحظة لمرة واحدة على عينة واحدة ، وأظهرت مادة التحكم الخاصة بك مرحلة 2 "قوية" (منحدر حاد) بالمقارنة ، فمن المرجح أن يكون لديك مثيل لتثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بعينة ، عند مستوى مرتفع بما يكفي للتدخل في الكفاءة (بمعنى أن أي بيانات كمية تحاول تفسيرها من التصوير المقطعي على تلك العينة ربما تكون خاطئة ، مع التصوير المقطعي المحوسب المتأخر عما هو متوقع) ولكن من الواضح أنه ليس بمستوى عالٍ بما يكفي لتحقيق نتيجة سلبية تمامًا.

يمكن أن يحدث منحنى مشابه أيضًا لأسباب مختلفة جدًا. إذا كانت بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الخاصة بك ذات نوعية رديئة للغاية (ربما بسبب انخفاض Tm ، مما يسمح لها بالارتباط العشوائي) ، فمن الممكن في نفس الوقت الحصول على العديد من الأمبليكونات "العشوائية" المختلفة ذات الكفاءات المتفاوتة التي يتم إجراؤها مرة واحدة في التفاعل. تؤدي هذه المنافسة بين التفاعلات ، و "مراحل" رد فعلها الفردي المختلفة في أوقات مختلفة ، إلى شكل منحنى أشبه بالشكل 2 ، حيث تغرق إشارات الفلورسنت الإجمالية الخاصة بها في مناطق المرحلة 2 والمرحلة 3 المتميزة.

(لاحظ أنه في معظم الحالات ، قد تكون هذه ملاحظة محتملة في المقايسات القائمة على الصبغة الملزمة ، والتي ، على عكس المقايسات القائمة على المسبار ، ليست محددة في الإشارة فقط من تسلسل الهدف المرغوب ، وهذا أحد الأسباب المهمة لتفضيل المسبار المقايسات القائمة على أساس الصبغة الملزمة ، حيث أن هذا النوع من الخطأ يتم بشكل فعال "مسحه تحت السجادة". في بعض الحالات المؤسفة ، على الرغم من ذلك ، قد تحتوي المنتجات الجانبية على تجانس تسلسلي كافٍ للتحقيقات لإحداث إشارة بحيث يمكن لهذا النوع من الملاحظة تحدث ، وإن كانت أقل تواترًا ، في المقايسات القائمة على المسبار ، وبالتالي ، وبغض النظر عن المنهجية ، ينبغي النظر مع بعض الشك في صحة تفسير منحنى التضخيم بمنطقة المرحلة الثانية الضعيفة.)

أخيرًا ، ماذا عن شكل المنحنى كما هو موضح في الشكل 3؟ على الرغم من أنه قد يبدو غريبًا للوهلة الأولى ، إلا أن شكل المنحنى هذا ليس نادرًا ما يكون مميزًا للغاية في الواقع لحالة رد فعل محددة للغاية: عند تطبيق خوارزميات برمجية معينة. بينما ينتهي هذا المنحنى أسفل عتبة التصوير المقطعي المحوسب وقد يميل المرء إلى استدعاء رد الفعل سلبيًا ، في الواقع العكس تمامًا هو الصحيح: ينشأ هذا المنحنى بسبب تركيز قالب هدف البداية المرتفع للغاية.

تذكر من الأعلى أن بعض البرامج تجبر منطقة المرحلة الأولى على الظهور بشكل مسطح ، عن طريق إضافة أو طرح أي اتجاهات منحنى تم اكتشافها في الدورات المبكرة على افتراض أنها تنشأ من تغييرات الخلفية إلى الفلوروفور وأن كل إشارة الدورة المبكرة هي ضوضاء. إذا بدأ التفاعل بدلاً من ذلك بحمل قالب مرتفع مثل وجود إشارة حقيقية يمكن اكتشافها بالفعل في هذه الدورات المبكرة (أي ، اجتاز الاختبار فعليًا صورة مقطعية حقيقية في دورة مبكرة جدًا) ، فإن خوارزميات تصحيح الخلفية هذه تزيل الآن إشارة حقيقية مستمدة من الهدف.

هذا الطرح للإشارة الحقيقية له نتيجة رسومية لتدوير منحنى التضخيم بشكل فعال حول أصل المحور. المرحلة الأولى ، التي يجب أن تنحدر لأعلى ، تبدو الآن مسطحة أو حتى تتناقص قليلاً. تظهر المرحلة الثانية ، ولكن نظرًا لأن معدل النمو الفعلي لم يتم الإبلاغ عنه بشكل كافٍ ، فإنها تبدو "ضعيفة" وقد تفشل في بعض الحالات في تجاوز خط التصوير المقطعي المحوسب. أخيرًا ، تبدو المرحلة 3 ، حيث يحدث الثبات الفعلي ، الآن كمنطقة منحدر سلبي ، نظرًا لعدم وجود نمو مطروحًا منه "خلفية" متنامية ينتج عنها قيمة سلبية.

في حين أن شكل منحنى التضخيم هذا وحده نهائي تقريبًا ، إذا كان برنامج الأداة المستخدم يحدد قيم التصوير المقطعي المحوسب الخاصة بالتفاعل ، فإن التلميح الثاني أن هذا يحدث عندما تكون عتبة التصوير المقطعي عالية جدًا مقارنة بعناصر التحكم أو العينات الأخرى حسنة التصرف ، إشارات الخلفية أعلى بكثير من المعتاد. لحسن الحظ ، إذا لوحظ هذا الشكل المنحنى الذي يمكن تمييزه بسهولة ، فإن إثبات السبب الجذري يتم بسهولة عن طريق تكرار الاختبار على عينة مخففة إلى حد كبير (1/10000 سيكون اختيارًا معقولًا). بدلاً من ذلك ، تسمح بعض حزم البرامج للمستخدم بالدخول وإيقاف تصحيح الخلفية يدويًا ، وفي هذه الحالة يوفر على الفور منحنى تضخيم "حقيقي" (يتم تمثيله في الشكل 3 ، خط غير مصحح). لاحظ أن قيم CT الصالحة للتقدير الكمي لا يمكن تحقيقها إلا من خلال التخفيف وإعادة الاختبار ولكن للحصول على نتيجة نوعية بحتة ، قد يكون تعطيل تصحيح الخلفية كافياً لاستدعاء النتيجة المناسبة.

في حين أن ما سبق لا يشكل سوى مجموعة فرعية صغيرة من بعض الأشياء التي يمكن أن تخبرنا بها منحنيات تضخيم PCR في الوقت الفعلي ، فمن المأمول أن تكون هذه المراجعة مفيدة ومثيرة لاهتمام القارئ. إذا كان الأمر كذلك ، يمكن أن يكون تعليميًا للغاية أن تأخذ مجموعة بيانات تشغيل PCR في الوقت الفعلي و (حيثما يدعمها برنامج معين) ، جرب تغيير معلمات تصحيح الخلفية (دورات البداية والنهاية ، أو تشغيل الخلفية أو إيقاف تشغيلها تمامًا) أيضًا كخيارات تجانس المنحنى مثل متوسط ​​عربة الصندوق ، ومعرفة التأثيرات التي تحدثها على أشكال المنحنى المعروضة. يمكن أن تكون الألفة الناتجة عن ذلك مفيدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها في المرة التالية التي يظهر فيها منحنى تضخيم غير عادي لـ qPCR - وهناك احتمالات ، هذا ليس بعيدًا جدًا في مستقبلك.

جون برونشتاين ، دكتوراه ، هو عضو في المجلس الاستشاري للتحرير MLO. يشغل منصب الرئيس وكبير مسؤولي العلوم في شركة PathoID، Inc. ومقرها كولومبيا البريطانية ، والتي تقدم الاستشارات لتطوير الاختبارات الجزيئية والتحقق منها.


تحقق من طريقتك

هناك طريقتان رئيسيتان لتحليل بيانات qPCR: تحليل دلتا مزدوج وطريقة المنحنى القياسي النسبي (طريقة Pfaffl). كلتا الطريقتين تضع افتراضات ولها حدودها ، لذا فإن الطريقة التي يجب أن تستخدمها لتحليلك ستعتمد على تصميمك التجريبي.

يفترض تحليل دلتا المزدوج أن:

  • هناك كفاءة متساوية بين مجموعات البرايمر (أي في حدود 5٪)
  • هناك فعالية تضخيم تقترب من 100٪ للجينات المرجعية والجينات المستهدفة
  • يتم التعبير عن جينات الضبط الداخلي باستمرار ولا تتأثر بالعلاج.

تلبي الطريقة عمومًا التجارب مع عدد كبير من عينات الحمض النووي وعدد قليل من الجينات المراد اختبارها.

تفترض طريقة المنحنى المعياري النسبي ما يلي:

تعمل هذه الطريقة بشكل أفضل إذا كان لديك عدد أقل من عينات الحمض النووي ولكن لديك عدد أكبر من الجينات للاختبار.


طرق التحليل

على النقيض من التقدير الكمي المطلق لمقدار mRNA في عينة ، يستخدم التقدير النسبي عنصر تحكم داخلي (جين مرجعي) و / أو مجموعة تحكم (مجموعة مرجعية) لتحديد كمية الرنا المرسال ذات الأهمية بالنسبة لهذه المراجع. هذا التقدير الكمي النسبي كافٍ لاستخلاص النتائج في معظم التطبيقات الطبية الحيوية التي تتضمن qPCR. تم تطوير عدد قليل من الطرق لأداء هذه الكميات النسبية. تتطلب هذه الأساليب افتراضات ونماذج مختلفة. يتم شرح أكثر الطريقتين شيوعًا هنا.

طرق المقارنة

تفترض طرق (C_T ) المقارنة أن قوالب (كدنا) للجين / الجينات المعنية بالإضافة إلى جين التحكم / المرجع لها كفاءة تضخيم مماثلة. وأن كفاءة التضخيم هذه قريبة من الكمال. بمعنى ، عند عتبة معينة أثناء الجزء الخطي من تفاعل PCR ، تضاعف كمية الجين المعني والمراقبة كل دورة. الافتراضات الأخرى هي أنه يمكن التقاط اختلاف التعبير بين جينين أو عينتين بطرح أحدهما (جين أو عينة مهمة) من آخر (مرجع). يتطلب هذا الافتراض النهائي أيضًا أن هذه المراجع لا تتغير مع العلاج أو الدورة التدريبية المعنية.
تم وصف الاشتقاق الرسمي لنموذج دلتا المزدوج (C_T ) هنا (Livak and Schmittgen 2001). موجز،
يتم إعطاء ( Delta Delta C_T ) بواسطة:

[ Delta Delta C_T = Delta C_ - دلتا سي_ ]

والتعبير النسبي عن طريق:

  • ( دلتا سي_) هو الفرق في (C_T ) (أو هم) من أ الجين من الفائدة و أ المرجعي الجين في مجموعة من المصالح
  • ( دلتا سي_) هو الفرق في (C_T ) (أو هم) من أ الجين من الفائدة و أ المرجعي الجين في المرجعي مجموعة

ومصطلح الخطأ هو:

طرق المنحنى القياسية

بالمقارنة ، لا يفترض هذا النموذج تضخيمًا مثاليًا ولكنه يستخدم التضخيم بنشاط في حساب التعبير النسبي. لذلك عندما تكون كفاءة التضخيم لجميع الجينات 100٪ ، يجب أن تعطي كلتا الطريقتين نتائج مماثلة. يتم تطبيق طريقة المنحنى القياسية باستخدام خطوتين. أولاً ، يتم استخدام التخفيفات التسلسلية من الرنا المرسال من العينات ذات الأهمية كمدخل لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم استخدام الاتجاه الخطي لمقدار إدخال السجل والقيم (C_T ) الناتجة لكل جين لحساب التقاطع والانحدار. ثانيًا ، تُستخدم هذه الاعتراضات والمنحدرات لحساب كميات mRNA للجينات ذات الأهمية والمراقبة / المرجع في عينات الاهتمام وعينة التحكم / المرجع. يتم استخدام هذه المبالغ أخيرًا لحساب التعبير النسبي بطريقة مشابهة للطريقة اللاحقة ، فقط باستخدام القسمة بدلاً من الطرح.
الاشتقاق الرسمي للنموذج موصوف هنا (Yuan et al.2006). موجز،
يتم إعطاء كمية الحمض النووي الريبي في العينة من خلال:

ويتم التعبير عن التعبير النسبي من خلال:

(C_T ) هو عتبة دورة الجين

ومصطلح الخطأ هو:

(cv ) هو الانحراف المعياري النسبي


كيف يكتشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بالفعل COVID-19؟

كما ذكرنا سابقًا ، تم تصميم اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للبحث عن الفيروس والمواد الوراثية. نظرًا لأن الفيروسات التاجية لا تحتوي على الحمض النووي و rsquot ، فإن الخطوة الأولى في اختبار PCR هي تحويل الفيروس و rsquos RNA إلى DNA في عملية تسمى النسخ العكسي. هذا لأن الحمض النووي أكثر استقرارًا من الحمض النووي الريبي. تقوم آلة PCR بعد ذلك بعمل ملايين النسخ من الحمض النووي عن طريق تشغيل دورات متعددة & ldquocycles & rdquo (مثل الغسالة). تسمى هذه العملية بالتضخيم وهي مهمة للغاية في العثور حتى على أصغر كميات من الحمض النووي. مع تشغيل المزيد من الدورات ، يتم عمل المزيد من نسخ الحمض النووي ومضاعفة كل مرة يتم نسخها و mdashand مما يسهل العثور عليها. إذا تعذر نسخ قطعة الحمض النووي ، فلا يوجد فيروس في العينة ، أو توجد كمية قليلة لدرجة أن هذا الاختبار شديد الحساسية لا يمكنه اكتشافه.


ما هي قيمة CT في اختبار Covid-19 RT-PCR | كل شيئ ترغب بمعرفته

في الآونة الأخيرة ، في رسالة إلى وزير الصحة في ولاية ماهاراشترا ، قال رئيس المجلس الهندي للبحوث الطبية (ICMR) الدكتور بالرام بهارجافا إن عتبة تحديد العينة على أنها Covid إيجابية من شأنه أن يزيد من معدل انتقال المرض.

في مواجهة زيادة غير مسبوقة في حالات Covid-19 ، طلبت ولاية ماهاراشترا من المركز إعادة النظر في معايير اختبار Covid. كتب ICMR مرة أخرى قائلاً إن المراجعة المقترحة في معايير الإيجابية ستؤدي إلى تفويت الكثير من الإصابات وتزيد من نقل المرض.

وفقًا لـ ICMR ، تعتمد معايير الإيجابية الحالية على عتبة الدورة (CT) ، وهي مقياس لمدى السرعة بعد اختبار RT-PCR ، يتم اكتشاف SARS-CoV-2 في عينة.

عندما تتحرك العينات خلال الدورات ، كلما تم اكتشاف الفيروس بشكل أسرع ، من المفترض أن يكون الحمل الفيروسي أعلى.

"يمكن اعتبار جميع المرضى الذين لديهم قيمة مقطعية محوسبة تساوي أو تقل عن 35 إيجابيًا ، في حين يمكن اعتبار المرضى الذين لديهم قيمة مقطعية محوسبة أكبر من 35 سلبية. جميع العينات ذات قيمة التصوير المقطعي المحوسب تساوي أو تقل عن 35 ، والتي يُنظر إليها على أنها منحنى سيني ضعيف ، يجب إعادة اختباره بشكل أساسي. لا يُنصح مطلقًا بتطبيق حد لقيمة التصوير المقطعي المحوسب البالغ 24 لأن هذا سيؤدي إلى فقدان العديد من المرضى المصابين بالعدوى وزيادة انتقال المرض "، تنص الرسالة المؤرخة في 5 أبريل.

تنص ICMR على أن الحد الأقصى المقبول عالميًا لقيمة CT لـ Covid-19 يتراوح من 35-40 اعتمادًا على التعليمات التي تضعها الشركات المصنعة الفردية.

ما هي قيمة CT؟

يشير التصوير المقطعي المحوسب إلى عدد الدورات اللازمة لتضخيم الحمض النووي الريبي الفيروسي إلى مستوى يمكن اكتشافه

كيف يتم تحديد قيمة CT؟

قد يصبح هذا تقنيًا بعض الشيء -

بمجرد جمع العينة ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي ومعالجته باستخدام إنزيم النسخ العكسي.

يتم استخراج الحمض النووي المكمل من الحمض النووي الريبي الأولي

الآن يمكن تضخيم الحمض النووي بسهولة باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل لعمل بلايين من النسخ من جزء.

يتم تضخيم الحمض النووي في كل دورة
كل دورة تضخم الحمض النووي بمقدار ضعفين

كيف يتم قياسها؟

يتم قياس الحمض النووي في الوقت الحقيقي عن طريق إشارات صبغة الفلورسنت. يساعدنا هذا في حساب قيمة CT VALUE

يتم ملاحظة بيانات الإشارات الفلورية التي تم جمعها في المرحلة الأسية - هذه هي كمية البداية من الحمض النووي المستهدف

على سبيل المثال فقط ، إذا كانت هناك عينتان: واحدة تحتوي على 100ng من cDNA - عدد أقل من الدورات لجعلها قابلة للاكتشاف - ستعطيني قيمة أقل

آخر مع 25 نانوغرام (كدنا) - - يحتاج إلى المزيد من الدورات - قيمة أعلى.

LOWER CT VALUE = حمل فيروسي أعلى
أعلى قيمة CT = حمولة فيروسية أقل

لماذا يجب علي الاهتمام؟

قال الدكتور سميران باندا ، رئيس قسم علم الأوبئة والأمراض المعدية في المركز الدولي لطب الأمراض المعدية ، "في حالة المرض إذا أظهرت العينة التي تم جمعها أن الحمل الفيروسي منخفض ، فإن قيمة التصوير المقطعي المحوسب لها علاقة عكسية. مع دورة تشغيل منخفضة ، يمكنك الحصول على نتيجة إيجابية إذا كان حمل القيمة مرتفعًا. إذا خفضت قيمة التصوير المقطعي المحوسب ، فسيشكل ذلك مشكلة خطيرة لأن الشخص لا يزال مصابًا ، سيكون لديه حمولة فيروسية منخفضة - سيكون الشخص سلبيًا. على الرغم من أنه قد يكون مصابًا بمرض ، وقد لا يطلب العلاج. قد تؤدي النتائج السلبية الكاذبة إلى نقل العدوى إلى الأسرة والمجتمع ".

"لا يعني الشخص أنه سيكون مريضًا بشكل رهيب. لا يزال بإمكاني أن أكون في عزلة منزلية ، لكنني أراقب صحتي. إذا واصلنا اليقظة بشأن تشبع الأكسجين ، فإن العلامات والأعراض السريرية ستساعد الأطباء في اتخاذ قرارات سريرية جيدة. وقال الدكتور سميران باندا "إنها إحدى الأدوات السريرية المصاحبة للأعراض الأخرى"

إذن لماذا تنظر ولاية ماهاراشترا إلى خفض قيمة التصوير المقطعي المحوسب؟ "معظم مصنعي مجموعات RT-PCR ، أو أولئك الذين يعيدون إنتاج مجموعات ، 35-40 هو الحال ، أي شيء فوق 40 يعتبر سلبيًا. هذه ليست ممارسة صحية حكيمة للغاية: سيتم اكتشاف الحمل الفيروسي العالي ولن يتم اكتشاف الحمل الفيروسي المنخفض قال الدكتور باندا: "في وقت العطس ، سيكون قادرًا على نشر العدوى".

هل يجب على الأطباء أخذ قيمة التصوير المقطعي المحوسب على محمل الجد عند وصف علاج كوفيد 19 للمرضى؟ "إنه مرتبط بخطورة المرض؟ لا على الإطلاق. إنه مرتبط فقط بخطورة المرض. يمكن أن يكون لدى المريض قيمة عالية للتصوير المقطعي المحوسب ولكن لا يزال لديه مستوى كبير جدًا من عدوى covid19 ، ويمكن أن يكون المريض مصابًا قال الدكتور ديرين جوبتا ، أخصائي أول في العناية المركزة في مستشفى سير جانجا رام .

تشير بعض الدراسات إلى أن قيم التصوير المقطعي المحوسب المنخفضة قد تترافق مع تفاقم الأعراض ، على الرغم من أن العديد من الخبراء يقولون إن مثل هذا الارتباط الخطي يصعب إثباته.


أساليب

شروط التربية وأخذ العينات

تم الحصول على بيض الطربوت المخصب عن طريق تهجين أنثى مع اثنين من الذكور وتربيتها في أحواض في معهد Oceanográfico de Vigo عند ثلاث درجات حرارة مختلفة (15 درجة مئوية ، 18 درجة مئوية ، 23 درجة مئوية). تم أخذ العينات في المراحل التالية: 30 ، 45 ، 60 ، 75 ، 90 ، 105 ، 120 و 135 يومًا بعد الإخصاب (dpf). في كل نقطة أخذ عينات ، تم أخذ 10 أفراد لكل درجة حرارة (3 × 10) وتم استئصال مناسلهم بأكبر قدر ممكن من الدقة. كان العدد النهائي للعينات المختبرة 240: ثماني مراحل نمو مختلفة ، وثلاثون عينة من الغدد التناسلية لكل مرحلة (عشرة لكل درجة حرارة). تم دمج العينات على الفور في RNAlater للحفظ (Qiagen ، فالنسيا ، كاليفورنيا). يمكن تمييز الغدد التناسلية للذكور والإناث عند 90dpf عن طريق الأنسجة (Cal R ، Lluch N ، Martínez P. تمايز جنس الغدد التناسلية في الترس (Scophthalmus maximus). قيد التحضير) و ميكروأري (Ribas L، Robledo D، Viñas A، Martínez P، Piferrer F. أيضا، cyp19a يمكن لقيم التعبير الخام بواسطة qPCR أن تميز تمامًا الإناث عن الذكور بدءًا من 105 dpf (ملف إضافي 2: الشكل S1).

تم التعامل مع الحيوانات وفقًا للتوجيه 2010/63 / UE الصادر عن البرلمان الأوروبي والمجلس بتاريخ 22 سبتمبر 2010 بشأن حماية الحيوانات المستخدمة في التجارب والأغراض العلمية الأخرى. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها في جامعة سانتياغو دي كومبوستيلا (إسبانيا).

عزل الحمض النووي الريبي وتوليف (كدنا)

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي عن طريق التجانس في TRIZOL (Invitrogen ، بيزلي ، المملكة المتحدة) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة. تمت معالجة إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام RNase خالية من المؤتلف DNase I (Roche Diagnostics ، Mannheim ، DE) وتم تقييم تركيز RNA عن طريق القياس الطيفي وفحص جودته باستخدام Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، الولايات المتحدة). تم نسخ إجمالي الحمض النووي الريبي (1.2 ميكروغرام) بواسطة الاشعال العشوائي باستخدام مجموعة توليف (كدنا) لدرجات الحرارة المتعددة من AffinityScript (Agilent Technologies) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ثم تم تخفيفه بنسبة 1: 2 بالماء الخالي من نوكلياز.

الوقت الحقيقي PCR

تم إجراء PCR في الوقت الحقيقي على جهاز تدوير حراري Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies) باستخدام Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green qPCR Master Mix بحجم نهائي قدره 12.5 ميكرولتر بعد بروتوكول الشركة المصنعة مع 1 ميكرولتر من (كدنا) لكل تفاعل. البادئات الخاصة بالجينات للجينات المرجعية RPL17 (بروتين ريبوسوم L17) ، B2M (Beta-2-microglobulin) و ACTB (بيتا أكتين) تم الحصول عليها من [5] والبادئات لـ UBQ (يوبيكويتين) ، RPS4 (بروتين الريبوسوم S4) و جابده تم تصميم (نازعة هيدروجين الغليسيرالديهيد -3 فوسفات) في مختبرنا (الجدول 11). تم فحص خصوصية كل زوج تمهيدي أولاً عن طريق ملف تعريف منحنى الانصهار ثم تم تأكيدها بواسطة تسلسل منتج PCR. RPL17, B2M و ACTB تم اختيارهم كجينات مرجعية مفترضة لأنها كانت من بين الجينات الأكثر استقرارًا في دراسة سابقة باستخدام أنسجة مختلفة في الترس [5] ، بينما UBQ, RPS4 تم اختيار و GAPDH بسبب استخدامها العام في العديد من الدراسات في الأنواع الأخرى وثبت أنه يتم التعبير عنها بثبات في دراسة ميكروأري أجريت في مختبرنا (بيانات غير منشورة). تم تصميم بادئات خاصة بالجينات أيضًا في مختبرنا لستة جينات مستهدفة تشارك في التمايز الجنسي (CYP19a و AMH و SOX9 و SOX19 و SOX17 و VASA) (الجدول 11) ، وتم إجراء التضخيم باتباع نفس الإجراء. كان تركيز التمهيدي 300 نانومتر وتم تشغيل كل عينة في نسختين. كانت معلمات ركوب الدراجات هي: 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، تليها 40 دورة تضخيم عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. أخيرًا ، تم إجراء خطوة التفكك بعد التضخيم لضمان وجود منتج تضخيم واحد. تم فحص جميع العينات (240) لكل جين. تم تنفيذ استراتيجية تعظيم العينة ، مما يعني أنه تم تشغيل أكبر عدد ممكن من العينات في لوحة واحدة ، وبالتالي ، تم اختبار كل جين في أقل كمية ممكنة من اللوحات. في كل لوحة PCR ، تم تضمين عناصر تحكم غير قالب لتأكيد عدم وجود تلوث. بالإضافة إلى ذلك ، تم تشغيل ثلاث عينات (معايرة بينية) في ثلاث نسخ في كل لوحة من أجل تصحيح تباين المقايسة البينية ، وتم تصحيح كل قيمة Cq في اللوحة عن طريق إضافة أو طرح الفرق بين متوسط ​​معايرة الصفائح في اللوحة وإجماليها يعني القيمة لجميع اللوحات [38]. تم الحصول على بيانات PCR في الوقت الحقيقي بواسطة برنامج MxPro (Agilent Technologies) وقيم دورة القياس الكمي (Cq) المحسوبة لكل تكرار ثم تم حساب متوسطها للحصول على قيمة Cq النهائية. كانت عتبة مضان تحديد Cq هي نفسها بالنسبة للجينات الستة ، وتم تحديد عتبة تستند إلى الخلفية للجينات الستة بشكل منفصل وأعلى عتبة مطبقة على الجينات الستة.

تحليل الجينات المرجعي

تم اختيار ما مجموعه ستة جينات مرجعية لتحليل التعبير الجيني في الغدد التناسلية التوربينية (الجدول 1). تم تحليل ثباتها باستخدام طريقة delta-Ct المقارنة [6] و BestKeeper [7] و GeNorm [3] و NormFinder [8] ، والتي تستخدم طرقًا مختلفة لإثبات استقرار الجينات ، ولكن في كل منها ، انخفضت قيمة يكون الجين أكثر استقرارًا. تم استخدام برنامج R v. 3.0.2 [37] مع الحزم "psych" و "gclus" و "fBasics" لعمليات إحصائية أخرى وتوليد الرسوم. تم إجراء مقارنات بين الأساليب مع مجموعة البيانات بأكملها وأيضًا مع مجموعات فرعية من العينات. قارنا 25 مجموعة فرعية مع 3 عينات لكل مجموعة تجريبية (72 عينة في إجمالي 24 مجموعة) و 25 مجموعة فرعية مع عينتين لكل مجموعة تجريبية (48 عينة في إجمالي 24 مجموعة) لتقييم متانة كل طريقة. علاوة على ذلك ، تعرضت ستة جينات مستهدفة تشارك في التمايز الجنسي للتطبيع بواسطة مجموعات جينية مرجعية مختلفة.

تحليل الكفاءة

تم فحص كفاءة كل زوج من البادئين لكل جين مرجعي بأربع طرق مختلفة: LinRegPCR [14] ، LREanalyzer [15] ، DART [10] و PCR-Miner [16]. تحسب كل طريقة قيم الكفاءة الفردية لكل تفاعل qPCR ثم يتم حساب متوسطها للحصول على قيم الكفاءة المتوسطة لكل جين. تم استخدام قيم التألق الخام (بدون تصحيح خط الأساس) كمدخلات لكل طريقة لتحديد الكفاءة.

التطبيع وتصحيح الكفاءة على الجينات المستهدفة

تم الحصول على قيم Cq المصححة بكفاءة بواسطة LinRegPCR و PCR-Miner للجينات المستهدفة الستة ، باتباع الصيغة "مصححة الكفاءة Cq = Cq * (log (E) / log (2))" [38]. تم بعد ذلك تطبيع هذه Cqs المصححة بواسطة UBQ + RPS4 و B2M ثم يعني التوسيط. أنتج هذا أربع مجموعات بيانات. تم الحصول على المتوسط ​​والانحراف المعياري لدرجات الحرارة (عالية ، طبيعية ومنخفضة) ومجموعات الجنس (ذكور وإناث) لكل جين في كل مجموعة بيانات.


تفسير منحنيات qPCR: كيف أجد قيمة Ct في حالتي؟ - مادة الاحياء

إرشادات للتحقق الداخلي والمختبر من طرق qPCR النوعية.

قبول الطريقة ومعلمات الأداء المراد تقييمها.

يجب استيفاء معايير القبول للمعلمات المذكورة أعلاه.

الإعداد التجريبي التفصيلي للتحقق الداخلي وبين المختبرات.

بالنسبة للعديد من مجالات الاختبار الجزيئي ، يعتمد اكتشاف الكائنات المعدلة وراثيًا (GMO) على تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (qPCR). نظرًا للعدد المتزايد من الكائنات المعدلة وراثيًا ، فقد أصبح نهج الفحص باستخدام طرق الفحص النوعي جزءًا متكاملًا من اكتشاف الكائنات المعدلة وراثيًا. ومع ذلك ، لا توجد إرشادات محددة للتحقق من صحة هذه الأساليب. هنا ، تم اقتراح نهج عملي لإجراء دراسات التحقق الداخلية وبين المختبرات لطرق فحص الكائنات المعدلة وراثيًا. يمكن تكييف هذه الإرشادات مع المجالات الأخرى حيث يتم استخدام طرق qPCR النوعية للاختبار الجزيئي مما يسمح بتنفيذ مرحلة فحص أكثر موثوقية بسهولة عند الضرورة.


ما هي قيمة CT هذه؟ هل لن يكون الشخص ذو القيمة المقطوعة المحوسبة المرتفعة معديًا؟

كشف الدكتور شهيد جميل ، عالم الفيروسات ومدير كلية تريفيدي للعلوم البيولوجية ، جامعة أشوكا ، في محادثة مع لائق بدنيا, that the RT-PCR test, ie, polymerase chain reaction test, examines the viral DNA or RNA to check the amount of molecules in it. There are many cycles in this test. DNA or RNA molecules are doubled in every cycle.

These tests are amplification tests - because the molecules in the sample are very small, the virus can be detected only after amplification in some cycles.

The CT value indicates the number of cycles needed for the virus to be detected. Due to amplification, a negative sample also starts giving non-specific positive signals in 40 cycles. Therefore, if the number is less than 40, the sample is considered positive.


False security

Patients in early symptomatic phase may have relatively less viral load and hence have high Ct value, which may subsequently change. “In such cases, high Ct values will give a false sense of security,” Dr. Bhargava says. “Viral loads will increase with time and then go down. It would be a sort of bell-shaped curve,” elaborates Dr. Jameel.

Besides the amount of virus present in a person, disease severity depends on host factors. “Some patients with low viral load may suffer from very severe disease due to triggering of the immunological responses. Hence high Ct values [reflecting low viral load] may give a false sense of security,” the Dr. Bhargava adds.

The high sensitivity and the nature of PCR test that looks only at the genetic material and not the virus itself can produce false positives even when the person has fully recovered as seen in over 260 people in South Korea who tested positive after recovering. But later studies found that PCR was detecting just the dead viral fragments. High Ct values may thus mean either low levels of virus or fragments of viral RNA.