معلومة

ما هو الببتيد التربتيك C- محطة؟

ما هو الببتيد التربتيك C- محطة؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

كتب لي عالم أحياء:

... C- أو N-terminus ، ... على سبيل المثال ، سيكون الببتيد التجريبي ذو الطرف C مثل AGWRGSDSHSR ...

ليس لدي أي فكرة عن ماهية ذلك. عندما بحثت في جوجل عن المصطلح ("C-terminal tryptic peptide") ، لم يظهر شيء واضح. ما هذا؟ لماذاAGWEGSDSHSRهو "C- محطة تربتيك الببتيد"؟


الأمر بسيط للغاية إذا نظرت إلى الأساسيات! دعنا نلقي نظرة على التسلسل الذي تقدمه:

AGWRGSDSHSR

اكتب ذلك في شكل 3 أحرف1:

علاء-غلي-ترب-أرج-غلي-سير-اسب-سير-صاحب-سر-أرج

انتبه إلى الطرف C. آخر بقايا حمض أميني في التسلسل هو أرجينين. الآن ، ثبت جيدًا أن التربسين يشق بولي ببتيد بعد، بعدما (أي باتجاه الجانب C الطرفي من) ليسين وأرجينين2.

وبالتالي ، فإن الببتيد التجريبي C-terminal هو الببتيد الذي يبقى بعد معالجة عديد الببتيد مع التربسين.


ما لم يكن مراسلك بعيدًا عن الروك (أو أنا) ، فهذا يشير بشكل لا لبس فيه إلى الببتيد المنطلق من الطرف C من عديد الببتيد عن طريق الهضم التجريبي.

هذا يعني أن الأرجينين النهائي في التسلسل الخاص بك كان من الممكن أن يكون الطرف C لبولي ببتيد الأصلي ، وليس موقع انقسام التربسين. هذا يعني أيضًا أن تسلسلك قد سبقه R أو K.


تفاعلات البروتين بين الطرف C لببتيد Aβ و phospholipase A2 - نهج قائم على البيولوجيا الهيكلية لتحديد علاجات الزهايمر الجديدة

يلعب عديد الببتيد أميلويد بيتا (Aβ) دورًا رئيسيًا في تحديد حالة تراكم البروتين في مرض الزهايمر. يعتبر الجزء الطرفي C الكاره للماء من ببتيد Aβ أمرًا بالغ الأهمية في تحفيز التحول من هيكل α-helical إلى هيكل-صفيحة. افترضنا أن فسفوليباز A2 (PLA2) قد يمنع تراكم ببتيد Aβ من خلال التفاعل مع الببتيد والحفاظ على سلسلتي الببتيد منفصلين. من أجل فحص طبيعة التفاعلات بين PLA2 و Aβ peptide ، قمنا بإعداد وبلورة مجمع Naja naja sagittifera PLA2 مع ببتيد سباعي C- الطرفية Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala. تم جمع بيانات شدة الأشعة السينية إلى دقة 2.04 A وتم تحديد الهيكل عن طريق الاستبدال الجزيئي وصقله إلى عامل R البلوري 0.186. كشف التحليل الهيكلي أن الببتيد يرتبط بـ PLA2 في تجويف ربط الركيزة الكارهة للماء مكونًا ما لا يقل عن ثمانية روابط هيدروجينية وما يقرب من عشرين تفاعلات Van der Waals. يشير عدد وطبيعة التفاعلات إلى أن التقارب بين PLA2 و hepta-peptide أكبر من التقارب بين سلسلتي ببتيد Aβ. لذلك ، يُقترح PLA2 باعتباره يجندًا محتملاً لمنع تراكم ببتيدات Aβ.


تطبيقات الببتيدات الاصطناعية

حفز اختراع تخليق الببتيد في الخمسينيات والستينيات من القرن الماضي على تطوير مجالات تطبيق مختلفة تُستخدم فيها الببتيدات الاصطناعية الآن ، بما في ذلك تطوير أجسام مضادة خاصة بالحلقة ضد البروتينات المسببة للأمراض ، ودراسة وظائف البروتين وتحديد وتوصيف البروتينات. علاوة على ذلك ، تُستخدم الببتيدات الاصطناعية لدراسة تفاعلات الركيزة الإنزيمية ضمن فئات الإنزيمات المهمة مثل الكينازات والبروتياز ، والتي تلعب دورًا مهمًا في إرسال الإشارات الخلوية.

في بيولوجيا الخلية ، غالبًا ما يمكن دراسة ارتباط المستقبلات أو خصوصية التعرف على الركيزة للأنزيمات المكتشفة حديثًا باستخدام مجموعات من الببتيدات الاصطناعية المتجانسة. يمكن أن تشبه الببتيدات الاصطناعية الببتيدات التي تحدث بشكل طبيعي وتعمل كأدوية ضد السرطان والأمراض الرئيسية الأخرى. أخيرًا ، يتم استخدام الببتيدات الاصطناعية كمعايير وكواشف في تطبيقات قياس الطيف الكتلي (MS). تلعب الببتيدات الاصطناعية دورًا رئيسيًا في الاكتشاف القائم على التصلب المتعدد وتوصيف وتقدير البروتينات ، خاصة تلك التي تعمل كمؤشرات حيوية مبكرة للأمراض.

يتعلم أكثر

حدد المنتجات


الببتيدات: التعريف والبنية والتوليف

يتكون الببتيد من اثنين أو أكثر من الأحماض الأمينية المرتبطة برابطة الببتيد المتكونة بين مجموعة الكربوكسيل لحمض أميني واحد ومجموعة أمينية أخرى مع إزالة مول واحد من الماء أثناء رابطة الببتيد.

تتكون البولي ببتيدات من سلاسل طويلة من الببتيد تحتوي على عدد كبير من روابط الببتيد. البوليمرات التي تصل إلى 100 من الأحماض الأمينية تسمى عديد الببتيدات وتلك التي تحتوي على أكثر من 100 تسمى بشكل عام بروتينات.

2. الهيكل الأساسي للببتيدات:

يشار إلى تسلسل الأحماض الأمينية في بولي بيب وشيتيد على أنه هيكلها الأساسي. مطلوب طرق كيميائية لتحديد الهيكل الأساسي و shyture.

يتم استخدام التقنيات الفيزيائية مثل الأشعة السينية crystallogra و shyphy للحصول على ترتيب أعلى من هيكل البروتين والغلاف.

يظهر دائمًا الحمض الأميني N-terminal (المحطة الأمينية) على اليسار والحمض الأميني C (car & shyboxyl terminal) على يمين سلسلة polypeptide.

حتى التغييرات الصغيرة في البنية الأولية للبروتينات قد تنتج تأثيرات فسيولوجية ملحوظة.

قد يؤدي استبدال حمض أميني واحد بأخرى خجولة في تسلسل من 100 أو أكثر من الأحماض الأمينية إلى إلغاء النشاط البيولوجي مع عيوب وخجل (على سبيل المثال ، مرض الخلايا المنجلية).

يُعرف الأساس الكيميائي الحيوي للعديد من الأمراض الأيضية الموروثة بسبب إدخال طرق كيميائية وفيزيائية جديدة لتحديد بنية البروتينات.

3. تحديد الهيكل الأساسي للببتيدات:

يتم تنقية A. الببتيدات قبل التحليل:

أنا. إجراءات التنقية التقليدية في & shyclude الترسيب بتركيزات ملحية متفاوتة (الأمونيوم أو كبريتات الصوديوم) أو المذيبات (الأسيتون أو الإيثانول) ، والطرد المركزي المختلف ، والترشيح الهلامي ، والكهرباء والرحلان الشعاعي.

2. كان الامتصاص الانتقائي والتخلص من pro & shyteins من مبادل أنيون السليلوز ثنائي إيثيل أمينو إيثيل (DEAE) السليلوز ومبادل الكاتيون carboxymethyl cel & shylulose (CMC) ناجحًا للغاية في التنقية المفرطة والسريعة للبروتين.

ب- تقدير الأحماض الأمينية جإغفال:

أنا. يتم كسر رابطة الببتيد التي تربط بقايا الأحماض الأمينية أولاً عن طريق التحلل المائي.

ثانيا. يتم بعد ذلك فصل الأحماض الأمينية المتحررة وتحديدها بواسطة HPLC أو كروماتوغرافيا التبادل الأيوني.

جيم تحديد تسلسل عديد الببتيد بواسطة سانجر:

أنا. كان نهج Sanger & # 8217s أولاً لفصل سلسلتي عديد الببتيد A و B من inn و shylin ثم تحويلها عن طريق الانقسام الأنزيمي المحدد إلى ببتيدات أصغر تحتوي على مناطق متداخلة.

باستخدام 1 فلورو -2 ، 4-ثنائي نيتروبنزين ، قام بعد ذلك بإزالة وتحديد ، واحدًا تلو الآخر ، بقايا الأحماض الأمينية الطرفية لهذه الببتيدات - وبالتالي كان قادرًا على استنتاج بنية أولية لا لبس فيها لكل من السلسلتين A و B.

يتم تحديد الهياكل الأساسية بواسطة تقنية Edman الآلي:

أنا. نظرًا لأن العديد من البروتينات تتكون من أكثر من سلسلة بولي ببتيد واحدة مرتبطة بالقوى غير التساهمية أو جسور ثاني كبريتيد. الخطوة الأولى لفصل سلاسل البولي ببتيد الفردية وفصلها.

ثانيا. عوامل التحوير (اليوريا ، الجوانيدين هيدرو والشيكلوريد) تعطل الروابط الهيدروجينية وتفصل وتتلاشى الببتيدات المتعددة غير المرتبطة تساهميًا.

ثالثا. عوامل الأكسدة والاختزال تعطل جسور ثاني كبريتيد. ثم يتم فصل البولي ببتيدات عن طريق الفصل الكروماتوجرافي.

رابعا. في هذه التقنية الآلية ، يكون كاشف إدمان هو فينيل أيزوثيوسيانات. يطلق تسلسل الاسترداد والخجل الأحماض الأمينية الأمينية وشينال كمشتق من فينيل ثيوهيدانتوين والذي يتم تحديده بعد ذلك بواسطة HPLC.

v. ثم يتم اشتقاق الحمض الأميني التالي على التوالي وإزالته ، ثم تتكرر العملية.

السادس. تحدث تفاعلات Edman إما في غشاء رقيق على جدار حجرة تفاعل الكوب الدوارة أو على مصفوفة صلبة تم ربط طرف الكربوكسيل بها بشكل تساهمي.

يتم مسح عديد الببتيدات الكبيرة قبل أن يتم تسلسلها:

أنا. تعمل أدوات التسلسل الأوتوماتيكية وتخجل بكفاءة أكبر على عديد الببتيدات من 20-60 بقايا طويلة. وبالتالي ، فإن الانقسام النوعي والمختل في مواقع نادرة نسبيًا أمر مرغوب فيه.

الكواشف التالية تفي بهذا المطلب:

4. توليف الببتيدات:

يمكن تصنيع الببتيدات عن طريق تفاعل بين مجموعة كربوكسيل منشط مثل حمض كلو وشيريد من حمض أميني واحد والمجموعة الأمينية لـ & خجول ، على سبيل المثال ، كلوريد حمض السيستين والليسين.

بعد تكوين رابطة الببتيد ، تتم إزالة مجموعة الكتلة والخجول ، تاركًا الببتيد المطلوب.

5. الببتيدات النشطة فسيولوجيا:

أنا. في بعض الحالات ، يكونون أساس نواتج وخواص البروتين.

ثانيا. في حالات أخرى ، قد تكون هرمونات ، ومضادات حيوية وخجول ، وسلائف لجدران الخلايا البكتيرية ، أو حتى سموم قوية.

ثالثا. مطلوب ثلاثي الببتيد الموزع على نطاق واسع جلوتاث وشيون لعمل العديد من الإنزيمات بما في ذلك الأنسولين. يعمل اختزال الجلوتاثيون إما في تحلل الأنسولين أو في تكوين روابط ثاني كبريتيد.

رابعا. الببتيدات الهامة الأخرى التي تحدث بشكل طبيعي هي براديكينين وكاليدين وهما عاملان خافضان لضغط العضلات الملساء يتم تحريرهما من بروتينات البلازما المحددة عن طريق العلاج بسم الثعبان.


محتويات

غالبًا ما يكون من المرغوب معرفة تكوين الأحماض الأمينية غير المنظمة للبروتين قبل محاولة العثور على التسلسل المرتب ، حيث يمكن استخدام هذه المعرفة لتسهيل اكتشاف الأخطاء في عملية التسلسل أو للتمييز بين النتائج الغامضة. يمكن أيضًا استخدام معرفة تواتر بعض الأحماض الأمينية لاختيار البروتياز الذي يجب استخدامه لهضم البروتين. يمكن أيضًا تحديد سوء دمج المستويات المنخفضة من الأحماض الأمينية غير القياسية (مثل النورليوسين) في البروتينات. [1] طريقة عامة يشار إليها غالبًا باسم تحليل الأحماض الأمينية [2] لتحديد تردد الأحماض الأمينية يكون كما يلي:

  1. تحلل كمية معروفة من البروتين في الأحماض الأمينية المكونة لها.
  2. افصل و حدّد كمية الأحماض الأمينية بطريقة ما.

تحرير التحلل المائي

يتم التحلل المائي عن طريق تسخين عينة من البروتين في حمض الهيدروكلوريك 6 مولار إلى 100-110 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو أكثر. قد تتطلب البروتينات التي تحتوي على العديد من المجموعات الضخمة الكارهة للماء فترات تسخين أطول. ومع ذلك ، فإن هذه الظروف قوية للغاية لدرجة أن بعض الأحماض الأمينية (سيرين ، ثريونين ، تيروسين ، تريبتوفان ، جلوتامين ، وسيستين) تتحلل. للتحايل على هذه المشكلة ، يقترح Biochemistry Online تسخين عينات منفصلة لأوقات مختلفة ، وتحليل كل حل ناتج ، واستقراء وقت التحلل المائي إلى الصفر. يقترح راستال مجموعة متنوعة من الكواشف لمنع أو تقليل التدهور ، مثل كواشف ثيول أو الفينول لحماية التربتوفان والتيروزين من هجوم الكلور وسيستين ما قبل الأكسدة. كما يقترح قياس كمية الأمونيا المتصاعدة لتحديد مدى التحلل المائي للأميد.

الفصل والكميات تحرير

يمكن فصل الأحماض الأمينية عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ثم اشتقاقها لتسهيل اكتشافها. بشكل أكثر شيوعًا ، يتم اشتقاق الأحماض الأمينية ثم حلها بواسطة HPLC الطور العكسي.

تم تقديم مثال على كروماتوغرافيا التبادل الأيوني من قبل NTRC باستخدام البوليسترين المسلفن كمصفوفة ، مضيفًا الأحماض الأمينية في محلول حامضي ويمرر عازلة لزيادة درجة الحموضة بشكل مطرد عبر العمود. يتم التخلص من الأحماض الأمينية عندما يصل الأس الهيدروجيني إلى نقاط تساوي الكهرباء الخاصة بكل منها. بمجرد فصل الأحماض الأمينية ، يتم تحديد الكميات الخاصة بها عن طريق إضافة كاشف يشكل مشتقًا ملونًا. إذا كانت كميات الأحماض الأمينية تزيد عن 10 نانومول ، فيمكن استخدام نينهيدرين لهذا فهو يعطي اللون الأصفر عند تفاعله مع البرولين ، والأرجواني الزاهي مع الأحماض الأمينية الأخرى. يتناسب تركيز الأحماض الأمينية مع امتصاص المحلول الناتج. بكميات صغيرة جدًا ، حتى 10 pmol ، يمكن تكوين مشتقات الفلوريسنت باستخدام الكواشف مثل أورثو فثالديهيد (OPA) أو فلوركامين.

قد تستخدم عملية اشتقاق العمود الأولي كاشف Edman لإنتاج مشتق تم الكشف عنه بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يتم تحقيق حساسية أكبر باستخدام كاشف يولد مشتقًا من الفلورسنت. تخضع الأحماض الأمينية المشتقة إلى كروماتوجرافيا الطور المعكوس ، عادةً باستخدام عمود سيليكا C8 أو C18 وتدرج شطف محسن. يتم الكشف عن الأحماض الأمينية المذابة باستخدام كاشف الأشعة فوق البنفسجية أو كاشف الفلورة ومناطق الذروة مقارنة بتلك الخاصة بالمعايير المشتقة من أجل تحديد كمية كل حمض أميني في العينة.

تحديد الحمض الأميني الذي يشكل ن- تعتبر نهاية سلسلة الببتيد مفيدة لسببين: للمساعدة في ترتيب متواليات شظايا الببتيد الفردية في سلسلة كاملة ، ولأن الجولة الأولى من تدهور Edman غالبًا ما تكون ملوثة بالشوائب ، وبالتالي لا تعطي تحديدًا دقيقًا لـ ن-حمض أميني طرفي. طريقة معممة ل ن- تحليل الأحماض الأمينية الطرفية كما يلي:

  1. تفاعل الببتيد مع الكاشف الذي سيصنف بشكل انتقائي الحمض الأميني الطرفي.
  2. تحلل البروتين.
  3. تحديد الأحماض الأمينية بالكروماتوجرافيا ومقارنتها بالمعايير.

هناك العديد من الكواشف المختلفة التي يمكن استخدامها لتسمية الأحماض الأمينية الطرفية. تتفاعل جميعها مع مجموعات الأمين وبالتالي فإنها ترتبط أيضًا بمجموعات أمين في السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية مثل اللايسين - ولهذا السبب من الضروري توخي الحذر في تفسير مخططات الكروماتوجرام لضمان اختيار المكان الصحيح. اثنان من الكواشف الأكثر شيوعًا هما كاشف سانجر (1-فلورو-2،4-دينيتروبنزين) ومشتقات دانسيل مثل كلوريد دانسيل. يمكن أيضًا استخدام Phenylisothiocyanate ، كاشف تحلل Edman. تنطبق نفس الأسئلة هنا كما في تحديد تركيبة الأحماض الأمينية ، باستثناء عدم الحاجة إلى صبغة ، حيث أن الكواشف تنتج مشتقات ملونة ولا يتطلب الأمر سوى التحليل النوعي. لذلك ليس من الضروري التخلص من الحمض الأميني من عمود الكروماتوغرافيا ، فقط مقارنة بالمعيار. هناك اعتبار آخر يجب أخذه في الاعتبار وهو أنه نظرًا لأن أي مجموعات أمين سوف تتفاعل مع كاشف الوسم ، فلا يمكن استخدام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ، ويجب استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة أو كروماتوجرافيا السائل عالي الضغط بدلاً من ذلك.

عدد الطرق المتاحة لتحليل الأحماض الأمينية C- الطرفية أصغر بكثير من عدد الطرق المتاحة لتحليل N-terminal. الطريقة الأكثر شيوعًا هي إضافة carboxypeptidases إلى محلول البروتين ، وأخذ عينات على فترات منتظمة ، وتحديد الحمض الأميني النهائي عن طريق تحليل مخطط لتركيزات الأحماض الأمينية مع مرور الوقت. ستكون هذه الطريقة مفيدة للغاية في حالة عديد الببتيدات ونهاية N المحظورة بالبروتين. سيساعد التسلسل الطرفي C بشكل كبير في التحقق من الهياكل الأولية للبروتينات المتوقعة من تسلسل الحمض النووي واكتشاف أي معالجة ما بعد الترجمة للمنتجات الجينية من تسلسلات الكودون المعروفة.

يعد تدهور Edman تفاعلًا مهمًا جدًا لتسلسل البروتين ، لأنه يسمح باكتشاف تركيبة الأحماض الأمينية المطلوبة للبروتين. تستخدم أجهزة تسلسل Edman الآلية الآن على نطاق واسع ، وهي قادرة على تسلسل الببتيدات التي تصل إلى ما يقرب من 50 من الأحماض الأمينية. يتبع مخطط تفاعل لتسلسل البروتين بواسطة تدهور Edman بعض الخطوات الموضحة لاحقًا.

  1. كسر أي جسور ثاني كبريتيد في البروتين مع عامل الاختزال مثل 2-مركابتوإيثانول. قد تكون مجموعة الحماية مثل حمض اليودوسيتيك ضرورية لمنع الروابط من إعادة التكوين.
  2. فصل وتنقية السلاسل الفردية لمركب البروتين ، إذا كان هناك أكثر من واحد.
  3. حدد تكوين الأحماض الأمينية لكل سلسلة.
  4. حدد الأحماض الأمينية النهائية لكل سلسلة.
  5. قسم كل سلسلة إلى أجزاء تحت 50 من الأحماض الأمينية طويلة.
  6. فصل وتنقية الشظايا.
  7. حدد تسلسل كل جزء.
  8. كرر مع نمط مختلف من الانقسام.
  9. بناء تسلسل البروتين الكلي.

الهضم في شظايا الببتيد تحرير

لا يمكن تسلسل الببتيدات التي يزيد طولها عن 50-70 حمضًا أمينيًا بشكل موثوق به عن طريق تدهور Edman. لهذا السبب ، يجب تقسيم سلاسل البروتين الطويلة إلى أجزاء صغيرة يمكن بعد ذلك ترتيبها بشكل فردي. يتم الهضم إما عن طريق endopeptidases مثل التربسين أو البيبسين أو عن طريق الكواشف الكيميائية مثل بروميد السيانوجين. تعطي الإنزيمات المختلفة أنماط انشقاق مختلفة ، ويمكن استخدام التداخل بين الأجزاء لبناء تسلسل شامل.

تحرير رد الفعل

يتم امتصاص الببتيد المراد تسلسله على سطح صلب. إحدى الركائز الشائعة هي الألياف الزجاجية المطلية بالبوليبرين ، وهو بوليمر كاتيوني. يضاف كاشف Edman ، phenylisothiocyanate (PITC) ، إلى الببتيد الممتز ، جنبًا إلى جنب مع محلول منظم أساسي معتدل بنسبة 12 ٪ ثلاثي ميثيل أمين. يتفاعل هذا مع المجموعة الأمينية للحمض الأميني N- طرفي.

يمكن بعد ذلك فصل الحمض الأميني الطرفي بشكل انتقائي عن طريق إضافة حمض لا مائي. ثم يتشابه المشتق لإعطاء فينيل ثيو هيدانتوين بديل ، والذي يمكن غسله وتحديده بواسطة كروماتوجرافي ، ويمكن تكرار الدورة. تبلغ كفاءة كل خطوة حوالي 98٪ ، مما يسمح بتحديد حوالي 50 من الأحماض الأمينية بشكل موثوق.

تحرير منظم البروتين

أ منظم البروتين [3] هي آلة تقوم بتدهور Edman بطريقة آلية. يتم تجميد عينة من البروتين أو الببتيد في وعاء التفاعل لمُتسلسل البروتين ويتم إجراء تحلل Edman. كل دورة تطلق وتشتق حمض أميني واحد من البروتين أو الببتيد نيتم بعد ذلك تحديد المدة ومشتق الأحماض الأمينية المنطلقة بواسطة HPLC. تتم عملية التسلسل بشكل متكرر لبولي ببتيد بأكمله حتى يتم إنشاء التسلسل القابل للقياس بالكامل أو لعدد محدد مسبقًا من الدورات.

تحديد البروتين هو عملية تعيين اسم لبروتين مهم (POI) ، بناءً على تسلسل الأحماض الأمينية. عادةً ، يجب تحديد جزء فقط من تسلسل البروتين تجريبيًا من أجل تحديد البروتين بالرجوع إلى قواعد بيانات تسلسل البروتين المستخلص من تسلسل الحمض النووي لجيناتهم. قد يتضمن توصيف البروتين الإضافي تأكيدًا على النهايتين N و C الفعليين لنقطة الاهتمام ، وتحديد متغيرات التسلسل وتحديد أي تعديلات ما بعد الترجمة موجودة.

الهضم الحال للبروتين تحرير

يتم وصف مخطط عام لتحديد البروتين. [4] [5]

  1. يتم عزل نقطة الاهتمام ، عادةً بواسطة SDS-PAGE أو الفصل اللوني.
  2. يمكن تعديل نقطة الاهتمام المعزولة كيميائيًا لتحقيق الاستقرار في بقايا السيستين (على سبيل المثال S-ميدوميثيل أو S-carboxymethylation).
  3. يتم هضم POI ببروتياز معين لتوليد الببتيدات. التربسين ، الذي ينشق بشكل انتقائي على الجانب الطرفي C من بقايا ليسين أو أرجينين ، هو البروتياز الأكثر استخدامًا. تشمل مزاياها 1) تواتر بقايا Lys و Arg في البروتينات ، و 2) الخصوصية العالية للإنزيم ، و 3) استقرار الإنزيم و 4) ملاءمة الببتيدات التريبتية لقياس الطيف الكتلي.
  4. يمكن تحلية الببتيدات لإزالة الملوثات المتأينة وتعريضها لمقياس الطيف الكتلي MALDI-TOF. قد يوفر القياس المباشر لكتل ​​الببتيدات معلومات كافية لتحديد البروتين (انظر بصمة كتلة الببتيد) ولكن غالبًا ما يتم استخدام المزيد من تجزئة الببتيدات داخل مطياف الكتلة للحصول على معلومات حول تسلسل الببتيدات. بدلاً من ذلك ، يمكن تحلية الببتيدات وفصلها عن طريق HPLC الطور المعكوس وإدخالها في مطياف الكتلة عبر مصدر ESI. قد يوفر LC-ESI-MS معلومات أكثر من MALDI-MS لتحديد البروتين ولكنه يستخدم وقتًا أطول للأداة.
  5. اعتمادًا على نوع مطياف الكتلة ، قد يحدث تفتيت أيونات الببتيد عبر مجموعة متنوعة من الآليات مثل التفكك الناجم عن التصادم (CID) أو تسوس ما بعد المصدر (PSD). في كل حالة ، يوفر نمط شظايا أيونات الببتيد معلومات حول تسلسلها.
  6. ثم تتم مطابقة المعلومات بما في ذلك الكتلة المقاسة لأيونات الببتيد المفترضة وتلك الخاصة بشظاياها مع قيم الكتلة المحسوبة من التحلل البروتيني المفاهيمي (في السيليكو) وتجزئة قواعد بيانات متواليات البروتين. سيتم العثور على تطابق ناجح إذا تجاوزت نتيجته الحد الأدنى بناءً على معايير التحليل. حتى إذا لم يتم تمثيل البروتين الفعلي في قاعدة البيانات ، فإن المطابقة المتسامحة مع الخطأ تسمح بالتعريف المفترض للبروتين بناءً على التشابه مع البروتينات المتماثلة. تتوفر مجموعة متنوعة من حزم البرامج لإجراء هذا التحليل.
  7. عادةً ما تُنشئ حزم البرامج تقريرًا يوضح هوية (رمز الانضمام) لكل بروتين محدد ، ودرجة المطابقة الخاصة به ، وتوفر مقياسًا للقوة النسبية للمطابقة حيث يتم تحديد البروتينات المتعددة.
  8. غالبًا ما يستخدم رسم تخطيطي للببتيدات المتطابقة في تسلسل البروتين المحدد لإظهار تغطية التسلسل (٪ من البروتين الذي تم اكتشافه كببتيدات). عندما يُعتقد أن POI أصغر بكثير من البروتين المطابق ، قد يشير الرسم البياني إلى ما إذا كانت POI عبارة عن جزء N- أو C- طرفي من البروتين المحدد.

تحرير التسلسل الجديد

يسمح نمط تجزئة الببتيد بالتحديد المباشر لتسلسلها بواسطة من جديد التسلسل. يمكن استخدام هذا التسلسل لمطابقة قواعد بيانات تسلسل البروتين أو للتحقيق في التعديلات اللاحقة للترجمة أو الكيميائية. قد يوفر دليلًا إضافيًا لتعريف البروتين الذي تم إجراؤه على النحو الوارد أعلاه.

تحرير N- و C-termini

لا تشتمل الببتيدات المتطابقة أثناء تحديد البروتين بالضرورة على N- أو C- الطرف المتوقع للبروتين المتطابق. قد ينتج هذا عن صعوبة تحديد الببتيدات الطرفية N أو C بواسطة MS (على سبيل المثال ، إما أن تكون قصيرة جدًا أو طويلة جدًا) ، أو يتم تعديلها بعد الترجمة (على سبيل المثال أستلة N- الطرفية) أو تختلف حقًا عن التنبؤ. يمكن تحديد التعديلات اللاحقة للترجمة أو المصطلحات المقطوعة من خلال الفحص الدقيق للبيانات (أي من جديد التسلسل). قد يكون من المفيد أيضًا تكرار عملية الهضم باستخدام البروتياز ذي النوعية المختلفة.

تعديلات ما بعد الترجمة تحرير

بينما يمكن استخدام المقارنة التفصيلية لبيانات MS مع التنبؤات المستندة إلى تسلسل البروتين المعروف لتحديد التعديلات اللاحقة للترجمة ، يمكن أيضًا استخدام الأساليب المستهدفة للحصول على البيانات. على سبيل المثال ، قد يساعد التخصيب المحدد من الببتيدات الفوسفاتية في تحديد مواقع الفسفرة في البروتين. قد تعطي الطرق البديلة لتفتيت الببتيد في مطياف الكتلة ، مثل ETD أو ECD ، معلومات تسلسل تكميلية.

تحرير كامل الكتلة

الكتلة الكلية للبروتين هي مجموع كتل بقايا الأحماض الأمينية بالإضافة إلى كتلة جزيء الماء ويتم تعديلها لأي تعديلات لاحقة للترجمة. على الرغم من أن البروتينات تتأين بشكل أقل جودة من الببتيدات المشتقة منها ، فقد يكون البروتين الموجود في المحلول قادرًا على التعرض لـ ESI-MS وتقاس كتلته بدقة جزء واحد في 20000 أو أفضل. غالبًا ما يكون هذا كافيًا لتأكيد المصطلح (وبالتالي تطابق الكتلة المقاسة للبروتين التي تنبأت من تسلسلها) واستنتاج وجود أو عدم وجود العديد من التعديلات اللاحقة للترجمة.

تحرير القيود

لا ينتج عن تحلل البروتين دائمًا مجموعة من الببتيدات القابلة للتحليل بسهولة والتي تغطي التسلسل الكامل لـ POI. غالبًا ما لا ينتج عن تجزئة الببتيدات في مطياف الكتلة أيونات مقابلة للانقسام في كل رابطة ببتيدية. وبالتالي ، فإن التسلسل المستنتج لكل ببتيد ليس بالضرورة كاملاً. لا تميز الطرق القياسية للتجزئة بين بقايا الليوسين والإيزولوسين لأنها متماثلة.

نظرًا لأن تحلل Edman ينشأ من الطرف N للبروتين ، فلن يعمل إذا تم تعديل الطرف N كيميائيًا (على سبيل المثال عن طريق الأسيتيل أو تكوين حمض البيروجلوتاميك). لا يعد تدهور Edman مفيدًا بشكل عام لتحديد مواقع جسور ثاني كبريتيد. يتطلب أيضًا كميات من الببتيد من 1 بيكومول أو أعلى للحصول على نتائج ملحوظة ، مما يجعلها أقل حساسية من قياس الطيف الكتلي.

في علم الأحياء ، يتم إنتاج البروتينات عن طريق ترجمة الرنا المرسال (mRNA) مع تسلسل البروتين المشتق من تسلسل الكودونات في الرنا المرسال. يتشكل الرنا المرسال نفسه عن طريق نسخ الجينات ويمكن تعديله بشكل أكبر. تُفهم هذه العمليات بشكل كافٍ لاستخدامها خوارزميات الكمبيوتر لأتمتة تنبؤات تسلسل البروتين من تسلسل الحمض النووي ، مثل مشاريع تسلسل الحمض النووي للجينوم الكامل ، وقد أدت إلى إنشاء قواعد بيانات كبيرة لتسلسل البروتين مثل UniProt. تسلسل البروتين المتوقع هو مورد مهم لتحديد البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي.

تاريخيًا ، تمت إعادة ترجمة متواليات البروتين القصيرة (من 10 إلى 15 وحدة بنائية) التي يحددها تدهور Edman إلى تسلسلات DNA التي يمكن استخدامها كمسبار أو بادئات لعزل النسخ الجزيئية للجين المقابل أو الحمض النووي التكميلي. ثم تم تحديد تسلسل الحمض النووي المستنسخ واستخدامه لاستنتاج تسلسل الحمض الأميني الكامل للبروتين.

توجد أدوات المعلوماتية الحيوية للمساعدة في تفسير أطياف الكتلة (انظر تسلسل الببتيد De novo) ، لمقارنة أو تحليل تسلسل البروتين (انظر تحليل التسلسل) ، أو البحث في قواعد البيانات باستخدام تسلسل الببتيد أو البروتين (انظر بلاست).


محتويات

يحتوي كل حمض أميني على مجموعة كربوكسيل ومجموعة أمين. ترتبط الأحماض الأمينية ببعضها البعض لتشكيل سلسلة من خلال تفاعل الجفاف الذي ينضم إلى مجموعة أمين من حمض أميني واحد إلى مجموعة الكربوكسيل التالية. وبالتالي ، فإن سلاسل البولي ببتيد لها نهاية بمجموعة كربوكسيل غير منضمة ، الطرف C ، ونهاية بمجموعة أمين غير منضمة ، الطرف N. يتم تصنيع البروتينات بشكل طبيعي بدءًا من الطرف N وتنتهي عند الطرف C.

تحرير إشارات الاحتفاظ الطرفية C

في حين أن الطرف N للبروتين غالبًا ما يحتوي على إشارات استهداف ، يمكن أن يحتوي الطرف C على إشارات احتفاظ لفرز البروتين. إشارة الاحتفاظ بالشبكة الإلكترونية الأكثر شيوعًا هي تسلسل الأحماض الأمينية -KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) أو -HDEL (His-Asp-Glu-Leu) عند الطرف C. هذا يحافظ على البروتين في الشبكة الإندوبلازمية ويمنعها من دخول المسار الإفرازي.

تعديلات C- الطرفية تحرير

يمكن تعديل الطرف C للبروتينات بعد الترجمة ، والأكثر شيوعًا عن طريق إضافة مرساة دهنية إلى الطرف C الذي يسمح بإدخال البروتين في الغشاء دون وجود مجال عبر الغشاء.

تحرير prenylation

شكل واحد من أشكال تعديل C- المحطة هو prenylation. أثناء عملية التضمين ، تتم إضافة مرساة غشاء farnesyl- أو geranylgeranyl-isoprenoid إلى بقايا السيستين بالقرب من الطرف C. غالبًا ما يتم تعديل بروتينات G الصغيرة المرتبطة بالغشاء بهذه الطريقة.

تحرير المراسي GPI

شكل آخر من أشكال تعديل الطرف C هو إضافة الفوسفوجليكان ، glycosylphosphatidylinositol (GPI) ، كمثبت غشاء. يتم توصيل مرساة GPI بالطرف C بعد الانقسام التحلل للبروبتيد الطرفي C. المثال الأبرز لهذا النوع من التعديل هو بروتين البريون.

تحرير المجال C- المحطة

المجال الطرفي C لبعض البروتينات له وظائف متخصصة. في البشر ، يتكون CTD لـ RNA polymerase II عادةً من ما يصل إلى 52 تكرارًا لتسلسل Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. [1] يسمح هذا للبروتينات الأخرى بالارتباط بالمجال الطرفي C لبوليميراز الحمض النووي الريبي من أجل تنشيط نشاط البوليميراز. تشارك هذه المجالات بعد ذلك في بدء نسخ الحمض النووي ، وتغطية نسخة الحمض النووي الريبي ، والتعلق بجسيم لصق لربط الحمض النووي الريبي. [2]


الشكل التكميلي 1 توصيف الانقسامات LysargiNase و trypsin و LysN المفقودة.

(أ) نسبة الببتيدات التي تم تحديدها في LysargiNase و trypsin هضم من MDA-MB-231 خلية محللة تحمل 0 أو 1 أو 2 أو 3 مواقع انقسام مفقودة باستخدام إعدادات خاصة بالإنزيم لمطابقة الببتيد إلى التسلسل. عرض IceLogos (ب) مواقع الانقسام الفريدة ، المستخلصة من كلا طرفي الببتيدات المحددة في LysargiNase أو بروتينات MDA-MB-231 المهضومة بالتريبسين (هذه الدراسة) أو من الببتيدات المحددة في Lys-N HEK293 الخلوية المهضومة التي أبلغ عنها Raijmakers et al. 12 و (ج, د) سياق التسلسل المحيط بمواقع انشقاق LysargiNase أو trypsin المفقودة في Arg أو Lys وموقع انشقاقات Lys-N المفقودة في Lys. تظهر اختلافات كبيرة في الحدوث (ص & lt 0.05) مقارنة بـ (ب,ج) وفرة الأحماض الأمينية الطبيعية في البروتين البشري و (د) مواقع انقسام محددة تم تحديدها لكل إنزيم.

الشكل التكميلي 2 نشاط LysargiNase في ظروف وحلول البروتينات الشائعة وفي درجات حرارة مختلفة.

تم تقييم نشاط LysargiNase بعد 30 دقيقة من الحضانة باستخدام الكازين المسمى resorufin (الإنزيم: نسبة الركيزة 1: 400 w / w) عند 37 درجة مئوية في 50 ملي مولار HEPES ، 10 ملي كلوريد الكالسيوم2، pH 7.5 مع تركيزات مبينة مضافة من (أ) كلوريد الصوديوم وعوامل الاختزال DTT و TCEP ، (بالمذيبات العضوية الميثانول (MeOH) والأسيتونيتريل (ACN) ، (ج) المنظف RapiGest TM وتغيير طبيعة تركيزات اليوريا و (د) تغيير طبيعة عوامل تشوتروبيك اليوريا مع الثيوريا والجوانيدين وحدهما. تم اختبار أهمية الاختلاف في الحضانة في ظروف التحكم باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الذيل (ن = 3 ، * ص & lt 0.05). (ه) عدم اكتمال هضم LysargiNase لمحلول الخلية MDA-MB-231 البشري عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف محدودة بالإنزيم (إنزيم: البروتين 1: 100 w / w) وذلك لمراقبة الاختلافات شبه الكمية في هضم البروتين في وجود المنظفات ، المذيبات العضوية وعوامل الاختزال. لاحظ أن النشاط الأنزيمي في وجود عوامل الاختزال يتم استعادته عن طريق التبريد مع إضافة الكاشف المؤلكل iodoacetamide (IAM) بعد الاختزال. (ز) تم تقييم نشاط LysargiNase بعد 30 دقيقة من الحضانة باستخدام مادة الكازين المسمى ريزوروفين (الإنزيم: نسبة الركيزة 1: 400 وزن / وزن) في 50 ملي مولار Hepes ، 10 ملي كلوريد الكالسيوم2، pH 7.5 في درجات الحرارة المحددة. تم اختبار أهمية الاختلاف في الحضانة عند 25 درجة مئوية من خلال اختبار t للطالب ثنائي الذيل (ن = 6 ، * ص & lt 0.05). (ح) مقارنة بين هضم الخلايا البشرية MDA-MB-231 مع LysargiNase عند إنزيم مختلف: نسب البروتين عند 37 درجة مئوية و 50 درجة مئوية.

الشكل التكميلي 3 مقايسة نشاط exopeptidase المستندة إلى MALDI-TOF مع الببتيدات الاصطناعية.

الببتيدات الاصطناعية (أ) RGPANL ↓ KGR ، (ب) RGISEVNLDAEF ↓ RH و (ج) تم استخدام RGPANLIG ↓ R لفحص أنشطة ثلاثي و ثنائي و أحادي الكربوكسي ببتيداز من LysargiNase ، على التوالي. تم تحليل الببتيدات بواسطة مطياف الكتلة MALDI-TOF بعد الحضانة ليلا باستخدام (w / w 50: 1 الألواح اليمنى) وبدون (الألواح اليسرى) LysargiNase. تم تحليل ناتج الانقسام لـ RGPANLIG ↓ R لاحقًا باستخدام مطياف الكتلة الترادفية MALDI TOF / TOF ، وكشف عن طيف تجزئة تهيمن عليه أيونات السلسلة b مع أيون أرجينين b1 بارز (m / z 157) ولا يوجد أيون أرجينين y1 (م / z 175) ، واستبعاد نشاط aminopeptidase (غير موضح).

الشكل التكميلي 4 مقايسة نشاط exopeptidase المستندة إلى MALDI-TOF.

(أ) تم استخدام خلاصة BSA التجريبية لـ (ب) فحص LysargiNase لأنشطة amino- و carboxypeptidase. لم يلاحظ أي نشاط للأمينوببتيداز ، ولكن تمت معالجة اثنين من الببتيدات (م / ض 689.3260 و 1439.8773 ، مبين باللون الأزرق) من 10 ببتيدات تجريبية من BSA ، مما يشير إلى نشاط طفيف في arginyl-carboxypeptidase. لوحظ وجود ببتيد LysargiNase ذاتي التحلل (REMPMPR ، م / ض 916.3680 مبين باللون الأسود).

الشكل التكميلي 5 في الهلام هضم الأبقار بيتا-كازين و BSA.

الببتيدات التي تم تحديدها بواسطة LC-MS / MS باستخدام CID من النوع الشعاعي بعد هضم الهلام من بيتا كازين البقري مع (أ) LysargiNase أو (ب) التربسين وألبومين مصل الأبقار مع (ج) LysargiNase أو (د) التربسين. Peptides identified by Mascot database searches are highlighted in red, Mascot protein identification score and sequence coverage are indicated.

Supplementary Figure 6 Complementarity of LysargiNase and trypsin in shotgun proteomics.

(أ) Box plots of the ratios of b-type to y-type fragment ions observed in 8,463 ion trap CID peptide spectrum matches for trypsin and 5,474 for LysargiNase (FDR < 0.01). The centerlines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend to the 5th and 95th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference was tested using the two-tailed Student’s t-test (*** ص & lt 0.001). (ب) Overlap of peptide sequences identified after trypsin or LysargiNase cleavage of proteomes. For comparison, N- or C-terminal basic residues were removed from the peptide sequences identified from LysargiNase and trypsin datasets, respectively.

Supplementary Figure 7 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of identical basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 8 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of varying basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 9 Effect of a-ion fragments on spectral quality and Comet XCORR scores.

(أ) Beam-type CID MS/MS spectra of the LysargiNase peptide RLLVDCYSPVE (top panel) and corresponding tryptic peptide LLVDCYSPVER (bottom panel). The tryptic peptide exhibits strong and extensive y-type fragment ions whereas the LysargiNase-derived peptide exhibits strong b-type and a-type fragment ions. (ب) Increase in Comet XCORR score by inclusion of a-type fragment ions during peptide-to-sequence matching of beam-type CID fragmentation spectra, plotted as % increase. Inclusion of a-type fragment ions increased scores for LysargiNase-derived peptides by 33% (left panel), significantly stronger than for tryptic peptides (right panel), where scores increased only by 15% (ص < 0.0001, two sided Student’s ر-test, one of two replicates shown). Notably, inclusion of a-type fragment ions did not affect the number of identifications, solely their confidence.

Supplementary Figure 10 Protein C-terminal peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

(a-f) Selected exemplary ion trap CID peptide fragmentation spectra matched to protein C-terminal peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 11 LysargiNase and trypsin facilitate identification of different phosphorylation motifs in phosphoproteomics.

(أ) Phosphorylation motifs identified by motif-x and their prevalence among high confidence phosphopeptides, with a localization probability > 0.75 identified by MaxQuant at an FDR < 0.01 from trypsin and LysargiNase-digested human MDA-MB-231 cell lysates (*ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص < 0.001, two-tailed Student’s t-test). (ب) Match of kinase specificity with identified phosphorylation motifs as extracted from the human protein reference database (HRDB). (ج) Relative change in abundance of phosphorylation motifs following stimulation by 12-ا-tetradecanoylphorbol-13-acetate (PMA) for 5 and 20 min.

Supplementary Figure 12 Examples of corresponding phosphosites identified both in LysargiNase and tryptic digests of MDA-MB-231 cell lysates.

(a-e) Selected ion-trap CID spectra from LysargiNase generated peptides (left panels) show stronger b-type fragment ions series and generated higher Andromeda scores and higher phosphosite localization probabilities than corresponding spectra from tryptic peptides (right panels). Within each peptide sequence phosphosite localization probabilities are enclosed within brackets to the right of each modified residue. Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 13 Monomethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (أ-ج) mono-methylated Lys or (d-f) mono-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 14 Dimethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (a, b) di-methylated Lys or (c-f) di-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 15 LysargiNase facilitates identification of peptides with methylated and dimethylated arginine and lysine residues.

(أ) Structural model depicting a possible interaction between a dimethylated lysine side chain and the LysargiNase S1' pocket. This model is based on the experimental crystal structure of the enzyme with an arginine-valine dipeptide occupying the S1‘ and S2‘ positions (pdb access code 2CKI 13 ). (ب) Peptides with methylated or dimethylated arginine and lysine as a proportion of all peptides identified in shotgun proteomics analysis of human MDA-MB-231 cell lysates using ion trap CID fragmentation (ن = 4). White, tryptic digests grey, LysargiNase digests. Center lines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference between LysargiNase and trypsin datasets was tested with two-tailed Student’s t-test (* ص & lt 0.05 ، *** ص & lt 0.001).


Type or paste the sequence of a peptide and click “Analyze”. The tool can auto-detect most formats of single-letter and three-letter amino acid sequences (e.g., EQKLISEEDL, Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu), or you can specify which format you input. Multiple sequences can be analyzed at a time by entering or pasting each sequence on a separate line. Multiple sequences must be in the same format.

Sequence 0

Analyzed sequence

Sequence length
كره الماء
GRAVY
MW average
MW monoisotopic
النظرية PI

Some amino acids(Q, E(N-term), C, M, W, N, P, D) are less stable than others and are prone to side reactions. These reactions may occur even under our stringent production conditions. The final peptide yield is the sum of the product and the peptide that has undergone side reactions. Once the sum of the corresponding peaks in analytical HPLC reaches the requested purity, the peptide is shipped. While the total purity stays constant, the ratio of product and byproduct may change over time.

Synthesis/Purification

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Duis non venenatis ipsum. Aliquam in justo pretium, finibus nibh non, laoreet sem. Integer consequat et magna at vestibulum. Quisque eget tempus risus. Quisque efficitur velit nisl, condimentum blandit neque elementum eget.

SRM/MRM Compatibility

Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit. Duis non venenatis ipsum. Aliquam in justo pretium, finibus nibh non, laoreet sem. Integer consequat et magna at vestibulum. Quisque eget tempus risus. Quisque efficitur velit nisl, condimentum blandit neque elementum eget.

Note: This analysis tool does not support any peptide modifications and sequences shorter than 4 amino acids. The quality of this analysis may be significantly affected if the input sequence is longer than 25 amino acids. To assess and optimize peptides for antigenicity and other properties relating to antibody production, use the Antigen Profiler Peptide Tool.


Supplementary files

C-Terminal lactamization of peptides

N. H. Fischer, D. S. Nielsen, D. Palmer, M. Meldal and F. Diness, تشيم. كومون., 2021, 57, 895 DOI: 10.1039/D0CC06018F

To request permission to reproduce material from this article, please go to the Copyright Clearance Center request page.

إذا كنت كذلك an author contributing to an RSC publication, you do not need to request permission provided correct acknowledgement is given.

إذا كنت كذلك the author of this article, you do not need to request permission to reproduce figures and diagrams provided correct acknowledgement is given. If you want to reproduce the whole article in a third-party publication (excluding your thesis/dissertation for which permission is not required) please go to the Copyright Clearance Center request page.


Supplementary Figure 1 Characterization of LysargiNase, trypsin and LysN missed cleavages.

(أ) Proportion of peptides identified in LysargiNase and trypsin digests of MDA-MB-231 cell lysates carrying 0, 1, 2 or 3 missed cleavage sites using enzyme-specific settings for peptide-to-sequence matching. IceLogos showing (ب) unique cleavage sites, inferred from both ends of peptides identified in LysargiNase or trypsin-digested MDA-MB-231 proteomes (this study) or from peptides identified in Lys-N digested HEK293 cell lysates reported by Raijmakers et al. 12 and (ج, د) the sequence context surrounding missed LysargiNase or trypsin cleavage sites at Arg or Lys and missed Lys-N cleavages sites at Lys. Shown are significant differences in occurrence (ص < 0.05) as compared to (ب,ج) the natural amino acid abundance in the human proteome and (د) specific cleavage sites identified for each enzyme.

Supplementary Figure 2 LysargiNase activity in common proteomics conditions and solutions and at different temperatures.

LysargiNase activity was assayed after 30 min incubation with resorufin-labeled casein (enzyme:substrate ratio 1:400 w/w) at 37 °C in 50 mM HEPES, 10 mM CaCl2, pH 7.5 with added indicated concentrations of (أ) NaCl and reducing agents DTT and TCEP, (ب) organic solvents methanol (MeOH) and acetonitrile (ACN), (ج) the detergent RapiGest TM and denaturing concentrations of urea and (د) denaturing chaotropic agents urea with thiourea and guanidine alone. Significance of difference to incubation at control conditions was tested with two-tailed Student’s t-test (n = 3, * ص & lt 0.05). (ه) Incomplete LysargiNase digestion of human MDA-MB-231 cell lysate at 37 °C under enzyme-limited conditions (enzyme:proteome 1:100 w/w) so as to semi-quantitatively monitor differences in proteome digest in the presence of detergents, organic solvents and reducing agents. Note that enzymatic activity in the presence of reducing agents is restored by quenching with the alkylating reagent iodoacetamide (IAM) added after reduction. (g) LysargiNase activity assayed after 30 min incubation with resorufin-labeled casein substrate (enzyme:substrate ratio 1:400 w/w) in 50 mM Hepes, 10 mM CaCl2, pH 7.5 at the indicated temperatures. Significance of difference to incubation at 25 °C was tested with two-tailed Student’s t-test (n = 6, * ص & lt 0.05). (ح) Comparison of human MDA-MB-231 cell lysates digestion with LysargiNase at different enzyme:proteome ratios at 37 °C and 50 °C.

Supplementary Figure 3 MALDI-TOF–based exopeptidase activity assay with synthetic peptides.

The synthetic peptides (أ) RGPANL↓KGR, (ب) RGISEVNLDAEF↓RH, and (ج) RGPANLIG↓R were used to assay tri-, di- and mono-carboxypeptidase activities of LysargiNase, respectively. Peptides were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry after over-night incubation with (w/w 50:1 right panels) and without (left panels) LysargiNase. The cleavage product of RGPANLIG↓R was subsequently analyzed using a MALDI TOF/TOF tandem mass spectrometer, revealing a fragmentation spectrum dominated by b-series ions with a prominent arginine b1 ion (m/z 157) and no arginine y1 ion (m/z 175), ruling out aminopeptidase activity (not shown).

Supplementary Figure 4 MALDI-TOF–based exopeptidase activity assay.

(أ) A tryptic BSA digest was used to (ب) assay LysargiNase for amino- and carboxypeptidase activities. No aminopeptidase activity was observed, but two peptides (m/z 689.3260 and 1439.8773, indicated in blue) out of 10 tryptic BSA peptides were C-terminally processed indicating minor arginyl-carboxypeptidase activity. A LysargiNase autolytic peptide was observed (REMPMPR, m/z 916.3680 indicated in black).

Supplementary Figure 5 In-gel digests of bovine β-casein and BSA.

Peptides identified by LC-MS/MS using beam-type CID after in-gel digestion of bovine beta-casein with (أ) LysargiNase or (ب) trypsin and bovine serum albumin with (ج) LysargiNase or (د) trypsin. Peptides identified by Mascot database searches are highlighted in red, Mascot protein identification score and sequence coverage are indicated.

Supplementary Figure 6 Complementarity of LysargiNase and trypsin in shotgun proteomics.

(أ) Box plots of the ratios of b-type to y-type fragment ions observed in 8,463 ion trap CID peptide spectrum matches for trypsin and 5,474 for LysargiNase (FDR < 0.01). The centerlines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend to the 5th and 95th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference was tested using the two-tailed Student’s t-test (*** ص & lt 0.001). (ب) Overlap of peptide sequences identified after trypsin or LysargiNase cleavage of proteomes. For comparison, N- or C-terminal basic residues were removed from the peptide sequences identified from LysargiNase and trypsin datasets, respectively.

Supplementary Figure 7 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of identical basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 8 Examples of peptide fragmentation spectra with overlapping sequences but differential placement of varying basic residues.

(a-d) Peptide ion trap CID fragmentation spectra from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates peptides (left panels) and corresponding peptide fragmentation spectra from trypsin-digested MDA-MB-231 cell lysates covering the same protein sequence (right panels). Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 9 Effect of a-ion fragments on spectral quality and Comet XCORR scores.

(أ) Beam-type CID MS/MS spectra of the LysargiNase peptide RLLVDCYSPVE (top panel) and corresponding tryptic peptide LLVDCYSPVER (bottom panel). The tryptic peptide exhibits strong and extensive y-type fragment ions whereas the LysargiNase-derived peptide exhibits strong b-type and a-type fragment ions. (ب) Increase in Comet XCORR score by inclusion of a-type fragment ions during peptide-to-sequence matching of beam-type CID fragmentation spectra, plotted as % increase. Inclusion of a-type fragment ions increased scores for LysargiNase-derived peptides by 33% (left panel), significantly stronger than for tryptic peptides (right panel), where scores increased only by 15% (ص < 0.0001, two sided Student’s ر-test, one of two replicates shown). Notably, inclusion of a-type fragment ions did not affect the number of identifications, solely their confidence.

Supplementary Figure 10 Protein C-terminal peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

(a-f) Selected exemplary ion trap CID peptide fragmentation spectra matched to protein C-terminal peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 11 LysargiNase and trypsin facilitate identification of different phosphorylation motifs in phosphoproteomics.

(أ) Phosphorylation motifs identified by motif-x and their prevalence among high confidence phosphopeptides, with a localization probability > 0.75 identified by MaxQuant at an FDR < 0.01 from trypsin and LysargiNase-digested human MDA-MB-231 cell lysates (*ص & lt 0.05 **ص & lt 0.01 ، ***ص < 0.001, two-tailed Student’s t-test). (ب) Match of kinase specificity with identified phosphorylation motifs as extracted from the human protein reference database (HRDB). (ج) Relative change in abundance of phosphorylation motifs following stimulation by 12-ا-tetradecanoylphorbol-13-acetate (PMA) for 5 and 20 min.

Supplementary Figure 12 Examples of corresponding phosphosites identified both in LysargiNase and tryptic digests of MDA-MB-231 cell lysates.

(a-e) Selected ion-trap CID spectra from LysargiNase generated peptides (left panels) show stronger b-type fragment ions series and generated higher Andromeda scores and higher phosphosite localization probabilities than corresponding spectra from tryptic peptides (right panels). Within each peptide sequence phosphosite localization probabilities are enclosed within brackets to the right of each modified residue. Spectra are shown as matched to peptide sequences and annotated by MaxQuant v1.4.12.

Supplementary Figure 13 Monomethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (أ-ج) mono-methylated Lys or (d-f) mono-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 14 Dimethylated peptides identified from LysargiNase-digested MDA-MB-231 cell lysates.

Exemplary ion trap CID fragmentation spectra matching peptides containing (a, b) di-methylated Lys or (c-f) di-methylated Arg, identified and annotated by MaxQuant v1.4.1.2.

Supplementary Figure 15 LysargiNase facilitates identification of peptides with methylated and dimethylated arginine and lysine residues.

(أ) Structural model depicting a possible interaction between a dimethylated lysine side chain and the LysargiNase S1' pocket. This model is based on the experimental crystal structure of the enzyme with an arginine-valine dipeptide occupying the S1‘ and S2‘ positions (pdb access code 2CKI 13 ). (ب) Peptides with methylated or dimethylated arginine and lysine as a proportion of all peptides identified in shotgun proteomics analysis of human MDA-MB-231 cell lysates using ion trap CID fragmentation (ن = 4). White, tryptic digests grey, LysargiNase digests. Center lines show the medians, box limits indicate the 25th and 75th percentiles, whiskers extend 1.5 times the interquartile range from the 25th and 75th percentiles, and outliers are represented by dots. Significance of the difference between LysargiNase and trypsin datasets was tested with two-tailed Student’s t-test (* ص & lt 0.05 ، *** ص & lt 0.001).


شاهد الفيديو: لائحة 30 دولة يستطيع المغاربة السفر إليها فقط بالجواز المغربي (ديسمبر 2022).