معلومة

توافر قاعدة بيانات تحتوي على بروتينات الضمة الكوليرية وتسلسلات الجينات المقابلة لها

توافر قاعدة بيانات تحتوي على بروتينات الضمة الكوليرية وتسلسلات الجينات المقابلة لها


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أردت قائمة بجميع البروتينات (تسلسل الأحماض الأمينية) وتسلسلات الجينات المقابلة لها من ضمة الكوليرا. حاولت البحث في الباتريك ، لكن عدد تسلسلات الأحماض الأمينية وتسلسلات الجينات غير متطابقة ، لأنها قدمت الجينوم بأكمله. أحتاج إلى معرفة ما إذا كانت هناك قاعدة بيانات حيث يمكن الحصول على جميع بروتينات الضمة الكوليرية وتسلسلات الجينات المقابلة لها في ملف واحد أو في ملفين. يبدو أن لصق تسلسل الجينوم والبروتين 4000-5000 بشكل فردي من الإنترنت أمر مرهق بالنسبة لي.


تريد الانتقال إلى PATRIC> Data> Download Tool.

من شجرة التصنيف ، ابحث عن Vibrio cholerae ، واختر نوع التعليق التوضيحي إما PATRIC / RefSeq أو كليهما ، واختر نوع الملف الذي تريده (gbk أو faa) وقم بالتنزيل من هناك.


التوصيف والتنوع الجيني لـ ضمة الكوليرا معزولة عن المصادر السريرية والبيئية في تايلاند

المعهد الوطني للأغذية ، الجامعة التقنية في الدنمارك ، المجموعة البحثية لعلم الأوبئة الجينومية ، المركز المتعاون مع منظمة الصحة العالمية لمقاومة مضادات الميكروبات في مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية والجينوميات والمختبر المرجعي للاتحاد الأوروبي لمقاومة مضادات الميكروبات ، كلغ. لينجبي ، الدنمارك

المعهد الوطني للأغذية ، الجامعة التقنية في الدنمارك ، المجموعة البحثية لعلم الأوبئة الجينومية ، المركز المتعاون مع منظمة الصحة العالمية لمقاومة مضادات الميكروبات في مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية والجينوميات والمختبر المرجعي للاتحاد الأوروبي لمقاومة مضادات الميكروبات ، كلغ. لينجبي ، الدنمارك

قسم الانتساب للميكروبيولوجيا ، كلية الصحة العامة ، جامعة ماهيدول ، بانكوك ، تايلاند

المعهد الوطني للأغذية ، الجامعة التقنية في الدنمارك ، المجموعة البحثية لعلم الأوبئة الجينومية ، المركز المتعاون مع منظمة الصحة العالمية لمقاومة مضادات الميكروبات في مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية والجينوميات والمختبر المرجعي للاتحاد الأوروبي لمقاومة مضادات الميكروبات ، كلغ. لينجبي ، الدنمارك

كلية الصحة العامة ، جامعة تاماسات ، مركز رانجسيت ، باثومثاني ، تايلاند

المعهد الوطني للأغذية ، الجامعة التقنية في الدنمارك ، المجموعة البحثية لعلم الأوبئة الجينومية ، المركز المتعاون مع منظمة الصحة العالمية لمقاومة مضادات الميكروبات في مسببات الأمراض المنقولة بالأغذية والجينوميات والمختبر المرجعي للاتحاد الأوروبي لمقاومة مضادات الميكروبات ، كلغ. لينجبي ، الدنمارك


2 النموذج: نظام الكيمياء في الجسم النموذجي الإشريكية القولونية

من الأفضل فهم الحسية الكيميائية على أنها مسار الانجذاب الكيميائي في البكتيريا النموذجية بكتريا قولونية (شلل الرعاش وآخرون. ، 2015) ، الشكل 1. يحتوي هذا الكائن الحي على نظام حسي كيميائي واحد يستشعر حالة ارتباط الجاذبات والمواد الطاردة لأربعة مستقبلات عبر الغشاء تسمى بروتينات الانجذاب الكيميائي التي تقبل الميثيل (MCPs). تكتشف هذه المستقبلات العناصر الغذائية ، وتشير الجزيئات والسموم التي ترتبط بمجالاتها المحيطة إما بشكل مباشر أو غير مباشر (Milburn) وآخرون.، 1991 Tam and Saier، 1993 Englert وآخرون، 2010). مستقبل خامس إضافي هو مستشعر الأكسدة والاختزال المستقل عن المثيلة والذي يعمل عن طريق تنظيم الأكسدة وتقليل جزء فلافين أدينين ثنائي النوكليوتيد الذي يرتبط بفترة بيولوجية بروتينية ، ومترجم نووي لمستقبل هيدروكربون أريل ، وبروتين أحادي التفكير (PAS) (بيبيكوف وآخرون., 2004 ).

يتم توصيل حالة ارتباط المستقبلات من خلال كينازات الهيستيدين ، وحلقات الأدينيلات ، والبروتينات المتوافقة مع الميثيل ومجال الفوسفاتاز (HAMP) إلى أطرافها السيتوبلازمية. هنا ، ينظمون الفسفرة الذاتية للهيستيدين كيناز CheA. هذا الكيناز هو إنزيم خماسي المجالات يشكل المتجانسين. يلعب كل مجال دورًا مميزًا في وظيفة CheA: يحمل P1 مادة الهيستيدين الركيزة التي تستقبل مجموعة الفسفوريل أثناء الفسفرة الذاتية ، P2 هو موقع الربط لمنظم الاستجابة CheY. كلا المجالين P1 و P2 متصلان ببقية البروتين عبر روابط مرنة. P3 هو مجال dimerization ، P4 هو مجال kinase مع جيب ربط ATP ، و P5 هو مجال ربط المستقبلات (Muok وآخرون., 2020 ).

عند التنشيط ، ينقل الكيناز مجموعة الفوسفوريل إلى CheY. يرتبط CheY الفسفوري بدوره بالمحرك السوطي حيث يتسبب في تبديل في اتجاه دوران السوط (Stock and Da Re ، 2000). عندما تزداد مستويات الجاذبات ، يتم إيقاف تشغيل الكيناز ولا يتم فسفرة CheY. في حالة عدم وجود CheY-P ، تدور المحركات عكس اتجاه عقارب الساعة (ccw). يؤدي هذا إلى تجميع الأسواط المتعددة التي تدفع الخلية معًا إلى الأمام ، مما يؤدي إلى نمط سباحة سلس (يسمى "الجري"). عند انخفاض الجاذبات أو زيادة المواد الطاردة للحشرات ، يتم تنشيط كيناز بواسطة المستقبلات. يتم فسفرة CheY ، مما يؤدي إلى عكس اتجاه دوران المحرك عند ربط CheY-P. يؤدي هذا إلى فصل الحزمة السوطية وتعيد الخلايا توجيه نفسها بشكل عشوائي ("تتعثر"). من أجل الحفاظ على مستوى CheY-P العام متزامنًا مع نشاط CheA ، يتم إزالة الفسفرة من CheY-P بسرعة بواسطة الفوسفاتيز CheZ (باركنسون وآخرون., 2015 ).

يمكن لنظام الانجذاب الكيميائي التكيف مع الظروف الحالية من خلال تنظيم مستقبلات مثيلة في بقايا الجلوتاميل المحددة في الجزء السيتوبلازمي من MCPs (Sourjik and Wingreen ، 2012). يتم أيضًا تنشيط methylesterase CheB بواسطة فسفرة CheA. جنبًا إلى جنب مع ميثيل ترانسفيراز CheR النشط بشكل أساسي ، تتحكم هذه الإنزيمات في مثيلة المستقبلات التي تسمح بالتكيف الدقيق عن طريق مواجهة حالة التنشيط للمستقبلات بطريقة تأخير الوقت: ينتج عن المستقبل الميثلي بالكامل نشاط عالي كيناز ، بينما ينتج عن مستقبلات منزوعة الميثيل بالكامل يقلل من تنظيم الكيناز (باركنسون وآخرون. ، 2015). يسمح نظام الانجذاب الكيميائي للخلايا بالتحكم في مدة وتواتر مرحلتي الجري والتعثر. في النهاية ، عن طريق تغيير التوازن بين هاتين الحالتين ، تتحرك الخلايا في "مسيرة عشوائية منحازة" لأعلى تدرجات جاذبة وأسفل تدرجات طاردة.

تشكل المستقبلات معًا عناقيد كبيرة في أقطاب الخلية. في بكتريا قولونية، تشكل المستقبلات مصفوفات سداسية مرتبة جيدًا مع CheA و CheW CheW ومجال CheW-homologous P5 من CheA على شكل حلقات متناوبة مرتبطة بأطراف المستقبلات. تشكل نطاقات P3 dimerization من CheA جسرًا بين السداسيات المجاورة. يتراوح قياس العناصر المتكافئة في CheA إلى CheW من 1: 1 إلى 1: 2. ينشأ هذا التباين في CheW من بنية المصفوفة ، حيث توجد ستة أشكال سداسية تحتوي على ثلاثة مونومرات CheA ، تحيط بواحد يفتقر إلى هيستيدين كيناز (Briegel وآخرون. ، 2012 ليو وآخرون. ، 2012 كاسيدي وآخرون. ، 2015). يمكن أن يحتوي هذا الشكل السداسي الخالي من CheA على مضغ إضافي.

ترتيب المستقبلات في المصفوفات عالية الترتيب ليس فريدًا من نوعه بكتريا قولونية، ولكن تم العثور عليها في جميع أنواع البكتيريا والعتيقات المصوَّرة حتى الآن (Briegel وآخرون., 2009 2015 ).

بينما لدينا فهم شامل للنظام الكيميائي الحسي في بكتريا قولونية، لقد بدأنا للتو في تفكيك بنية ووظيفة هذه الأنظمة في الكائنات الحية الأخرى. في هذه المراجعة ، سنلخص المعرفة الحالية حول أنظمة الحسية الكيميائية المعقدة في ضمة الكوليرا، وهو نظام نموذجي رئيسي باعتباره أحد مسببات الأمراض البشرية بدورة حياة معقدة. على وجه التحديد ، سوف نسلط الضوء على أوجه التشابه والاختلاف مع نظام النموذج في بكتريا قولونية، وحدد بعض الأسئلة المفتوحة المتبقية.


نتائج

تطوير سلالات المراسل لرصد وتيرة فقدان GIs في ضمة الكوليرا.

الأعمال السابقة التي درست ظاهرة استئصال GIs في ضمة الكوليرا اعتمد اختبار PCR (19 ، 20). ومع ذلك ، فإن هذا الاختبار ليس بارعًا في مراقبة فقدان GIs وغير قادر على عزل الخلايا البكتيرية من مجموعة سكانية غير متجانسة فقدت الجهاز الهضمي من جينومها. في هذه الدراسة ، قمنا بتصميم جينوم مختلف ضمة الكوليرا سلالات لرصد وتيرة فقدان GIs المختلفة تحت ظروف النمو في المختبر والحي. تم تمييز كل GI (VPI-1 و VPI-2 و VSP-1 و VSP-2) و prophages بإمكانية اختيار متعددة (قط) ، قابل للتحديد العداد (سايب) و chromogenic (لاكز) الأليلات السريرية ضمة الكوليرا سلالة N16961 ومشتقاتها (الشكل 2). نظرًا لأن جينوم N16961 خالي من SXT ، فقد قمنا بتمييز هذا العنصر بعلامة مماثلة قابلة للتحديد وقابلة للتحديد في ضمة الكوليرا O1 El Tor العزلة السريرية 41081 (الجدول 1). الأليل القطة أو sacB-cat-lacZ أو sacB-aadA تم إدخاله في GIs أو SXT عن طريق طريقة التبادل الأليلي المتسلسل باستخدام مشتقات ناقل الانتحار pKAS32 الذي يحتوي على علامة اختيار بلوخ وعلامة اختيار العداد rpsL في العمود الفقري البلازميد (الملحق SI، الجدول S1). أول سلالة وسيطة متقاطعة تحمل العمود الفقري المتجه (pKAS32) وأليل المراسل (القطة أو sacB-cat-lacZ أو sacB-aadA) من خلال مقاومة المضادات الحيوية (Cam R أو Spc R و Amp R) والتأثر بالستربتومايسين والسكروز. سلالات المراسل المطلوب SB30 (VPI-1 ::القطة) ، SB26 (VPI-2 ::القطة) ، SB23 (VSP-1 ::القطة) ، DD1 (VSP-2:القطة) ، BB2 (CTXΦ ::القطة) و JV3 (SXT ::sacB-aadA) من خلال مقاومة المضادات الحيوية ، وقابلية السكروز ، ولون المستعمرة ، ومقايسة PCR ، وتسلسل الحمض النووي (الشكل 3). نظرًا لأن تكامل CTXΦ و RS1Φ لا رجوع فيه ، فقد تم استبدال مجموعة Prophage TLC-CTX-RS1 في جينوم N16961 أولاً بشريط مقاومة سبكتينوميسين بواسطة طريقة التبادل الأليلي. بعد ذلك ، CTXΦ ::القطة تم تقديم عنصر في lacZ-dif1 أليل عن طريق إعادة التركيب الخاص بالموقع لتطوير السلالة البكتيرية المؤتلفة BB2 (الجدول 1). أكد النمط الظاهري لمقاومة المضادات الحيوية ومقايسة PCR والفحص الأزرق والأبيض السلالة المرغوبة BB2.

تمثيل تخطيطي للتنظيم الجيني للجزر الجينومية (GIs) ، والعنصر المقترن التكاملي (ICE) ، و Prophages وموقع جينات المراسل في الجينوم الموسوم. قابل للتحديد (قط) ، قابل للتحديد العداد (سايب) و chromogenic (لاكز) الأليلات في ضمة الكوليرا الجينوم ، باعتماد طريقة التبادل الأليلي. تشير النجمة إلى ذلك فيبريو تم تمييز جزيرة الإمراضية 1 (VPI-1) بـ القطة إلى جانب sacB-cat-lacZ الأليلات.

الوراثة ذات الصلة والنمط الظاهري من النوع البري والمعدلة وراثيا ضمة الكوليرا السلالات المستخدمة في الدراسة

التنظيم الجيني لمواقع تكامل الكروموسومات (أتب) قبل وبعد استئصال جميع الجزر الجينومية الأربع من جينوم N16961. (أ) ATL و أتر تم تشكيل المواقع بسبب إعادة التركيب الخاص بالموقع بين موقع ارتباط الجزيرة الجينومية (AttP) وموقع ارتباط الكروموسومات (أتب). احتوت أرقام الممرات 17 و 18 على سلالم DNA 1 كيلو بايت و 100 نقطة أساس ، على التوالي. (ب) تحليل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لـ N16961 ومشتقاته في وجود وغياب الجزر الجينومية (GIs). تم حل منتجات PCR المضخمة في هلام الاغاروز. تم ذكر رقم المسار و amplicon المقابل في أ. تشير الأسهم الزرقاء إلى البادئات التي ترتبط بالمنبع والمصب من GI ، والأسهم الخضراء تشير إلى بادئات ترتبط بـ GI.

تحديد التردد في المختبر وفي الجسم الحي لفقدان الجهاز الهضمي ، والعنصر المقترن التكاملي ، و CTX Prophage.

لمراقبة استقرار جميع العناصر الأربعة GIs و CTX prophage و SXT تحت ظروف النمو في المختبر ، تمت زراعة سلالات المراسل المصممة في هذه الدراسة (SB30 و SB26 و SB23 و DD1 و BB2 و JV3) في وسط غني من الناحية التغذوية (مرق لوريا - برتاني LB) لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية. تم طلاء ثقافات سلالات المراسل على لوحات Luria agar (LA) المكملة بالسكروز (15 ٪) والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل). تمت مراقبة المستعمرات المزروعة على لوحات الاختيار من حيث حساسيتها للكلورامفينيكول أو سبيكتينوميسين اعتمادًا على كاسيت المقاومة المستخدم لتمييز GIs و CTX prophage و SXT. خضعت المستعمرات المستأصلة كذلك لتأكيد PCR عن طريق تضخيم منطقة ارتباط كروموسومي لكل من GIs (الشكل 3). تسلسلات المرفقات (أتب) لكل GI و SXT عن طريق تسلسل الحمض النووي. تم تحديد العدد الإجمالي للخلايا البكتيرية في مزرعة بكتيرية نمت بين عشية وضحاها عن طريق طلاء نفس الثقافة على صفيحة LA مكملة بالستربتومايسين. لاحظنا تواترًا مختلفًا للخسارة لمختلف GIs (الجدول 2). لوحظ أعلى تواتر للخسارة في ظل ظروف النمو في المختبر بالنسبة لـ VPI-1 ، بينما لم يتم الكشف عن أي خسارة لانتقال CTX (الجدول 2).

تكرار الخسارة في المختبر وفي الجسم الحي للجزر الجينومية المختلفة

لرصد ترددات فقدان GIs المختلفة في ظل ظروف النمو في الجسم الحي ، اعتمدنا النموذج التجريبي لحلقات الأرانب اللفائفي المربوطة. تم تلقيح سلالات المراسل التي تحتوي على GIs ذات العلامات في الجينوم الخاص بها في حلقة ملفوفة مرتبطة ، وتم قياس ترددات فقد كل GI بعد 12 ساعة عن طريق طلاء الخلايا على لوحات اختيار مكملة بالسكروز (15 ٪) والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) . مثل التجربة في المختبر ، تم قياس العدد الإجمالي للخلايا البكتيرية في سائل الحلقة اللفائفي المربوط عن طريق طلاء السائل على صفيحة LA المكملة بالستربتومايسين. لوحظ أعلى تواتر للخسارة في VPI-2 مقارنة بأي مؤشرات جغرافية أخرى (الجدول 2). لم يلاحظ أي خسارة لانتقال CTX (الجدول 2). تم تأكيد سلالات المراسل التي تحمل حذف GIs المعزولة من الحلقات اللفائفية المربوطة عن طريق إعادة تقسيم المستعمرات إلى فيبريو- وسط انتقائي محدد TCBS و LA مكمل بالستربتومايسين (المقاوم) أو الكلورامفينيكول (الحساس). ومن المثير للاهتمام ، لاحظنا أن تكرار فقدان جميع المؤشرات الجغرافية من ضمة الكوليرا كان الجينوم مرتفعًا جدًا في حالة المختبر مقارنة بالخلايا المزروعة في الجسم الحي (الجدول 2).

ضمة الكوليرا السلالات الخالية من أي جزر وراثية جينية قابلة للحياة ويمكن أن تتكاثر في كل من الوسائط الغنية والمتدنية.

لقد قمنا بهندسة جينوم واسعة النطاق لـ N16961 لإزالة جميع GIs و prophages من الجينوم الخاص به. أولاً ، قمنا بتمييز GIs بـ القطة أو sacB-cat-lacZ ثم عزلوا ضمة الكوليرا الخلايا التي فقدت الجهاز الهضمي الموسوم عن طريق طلاء الخلايا على وسط اختيار مكمل بالسكروز (الجدول 1). لعزل السلالات التي تفتقر إلى مجموعات مختلفة من MGE مثل ΔVPI-1 (SB31) ، ΔVPI-2 (SB27) ، ΔVSP-1 (SB25) ، ΔVSP-2 (DD2) ، ΔTLCΦ-CTXΦ-RS1Φ (BS1) ، ΔVPI-1ΔVPI- 2 (SB52) ، ΔVSP-1ΔVSP-2 (SB44) ، ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-1 (SB47) ، ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-2 (SB48) ، ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-1ΔVPI-2 (SB50) ، و ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-1ΔVPI-2ΔTLCΦ-CTXΦ-RS1Φ ::lacZ-dif1 (BB1) سلالة (الجدول 1) ، استخدمنا السمية الشرطية لـ سايب للبكتيريا المضيفة.

قمنا بقياس معدل نمو N16961 ومشتقاته مع أو بدون GIs و prophages في وسط غني بالتغذية (LB) أو متوسط ​​(M9) (فقير من الناحية التغذوية). ضمة الكوليرا كانت الخلايا الخالية من أي GIs و prophages قادرة على النمو في كلا الوسطين (الشكل 4 أ و ب). ومع ذلك ، فإن نمو SB50 (Δvsp-1Δvsp-2vpi-1vpi-2) انخفض بشكل ملحوظ (ص & lt 0.01) خلال 5 و 6 و 7 ساعات من النمو مقارنة بالسلالة الأم N16961 (الشكل 4)أ). لاحظنا أيضًا انخفاضًا كبيرًا (ص & lt 0.05) في نمو السلالة المهندسة SB47 (Δvsp-1Δvsp-2vpi-1) خلال 5 و 6 و 7 ساعات من الحضانة. ومن المثير للاهتمام ، أن BB1 ، مشتق من SB50 يحمل dif1 في Chr1 ولكنه خالي من جميع GIs و prophages الأربعة في الكروموسوم ، أظهر مظهر نمو مشابهًا لسلالة WT N16961 (الشكل 4). أ و ب). لم نلاحظ أي تغييرات كبيرة في ملف النمو سواء في M9 أو LB بين سلالات N16961 و BB1 (الشكل 4). أ و ب). تم الإبلاغ سابقًا عن أن ضمة الكوليرا تتمتع سلالة O1 El Tor N16961 بميزة نمو كبيرة على سلالة النمط الحيوي الكلاسيكي O395 في ثقافة المرحلة الثابتة عندما تمت زراعة كلا السلالتين في LB في ظل ظروف النمو المثلى (27). يتمثل الاختلاف الرئيسي بين El Tor والأنماط الحيوية الكلاسيكية فيما يتعلق بـ GI في عدم وجود كل من VSP-1 و VSP-2 في الأخير. لقد درسنا ما إذا كانت سلالة O1 الكلاسيكية O395 يمكنها التنافس مع سلالة O1 El Tor SB60 الخالية من جزر VSP-1 و VSP-2. للتمييز بين سلالات SB60 و O395 في زراعة الكاكاو ، قدمنا ​​شريطين مختلفين للجينات المقاومة ، قط و ش بلي، في ال dif1 موقع سلالات El Tor والسلالات الكلاسيكية ، على التوالي. نمت الثقافة المختلطة في وسط LB أو M9 في ظل ظروف النمو المثلى ، وتم قياس عدد الخلايا البكتيرية في نقاط زمنية مختلفة (الشكل 4). ج و د). تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن النمط الحيوي الكلاسيكي O395 يمكن أن ينافس النمط الحيوي El Tor المحذوف VSP-1 و VSP-2 عندما تمت زراعتهما في وسط M9. ومع ذلك ، يمكن أن تتفوق سلالات El Tor المحذوفة VSP-1 و VSP-2 على O395 في وسط LB. تشير هذه النتيجة إلى أن اكتساب VSP-1 و VSP-2 في جينوم ضمة الكوليرا قدمت بعض السمات الأيضية التي ربما ساعدت النمط الحيوي للوباء السابع El Tor على التغلب على النمط الحيوي الكلاسيكي المسبب للوباء السادس. ومع ذلك ، دور إضافي oriC قد تساعد الوظائف أيضًا النمط الحيوي El على التغلب على النمط الحيوي الكلاسيكي في البيئة الغنية بالمغذيات حتى في حالة عدم وجود مثل هذه السمات الأيضية (28). تم الإبلاغ سابقًا عن أن oriC من النمط الحيوي الكلاسيكي يحمل طفرة أساسية واحدة (T → G) في منطقة تكرار 13-mer R الغنية بـ AT المحفوظة مقارنةً بـ oriC من طراز El Tor biotype (28). لقد تم إثبات أن رقم نسخة المينيكروموسوم وكفاءته التحويلية تقل بشكل كبير بسبب طفرة الاستبدال في oriC من النمط الحيوي الكلاسيكي (28). قد يكون هذا أحد أسباب ضعف كفاءة النموذج الحيوي الكلاسيكي أثناء الزراعة المشتركة مع النمط الحيوي El Tor في الوسط الغني بالمغذيات.

منحنى النمو من النوع البري والمعدّل وراثياً ضمة الكوليرا سلالات في وسط الثقافة الغنية (LB) والمحددة تغذويًا (M9). نمت سلالة El Tor N16961 ومشتقاتها بشكل فردي في الزراعة الأحادية في LB (أ) و M9 (ب) ، وتم رصد نمو الخلايا البكتيرية عن طريق قياس الكثافة الضوئية للثقافة عند 600 نانومتر (OD600) في مقياس الطيف الضوئي في نقاط زمنية مختلفة. تم إجراء منافسة النمو بين ΔVSP-1ΔVSP-2 N16961 و O395 أيضًا في الأغنياء (ج) ومتوسط ​​ضئيل (د) في وسط مشترك عن طريق تلقيح عدد مماثل من الخلايا معًا (1: 1). تم تحديد عدد CFU لكل سلالة عن طريق طلاء الثقافة في وسط غني (LA) مكمل بمضاد حيوي محدد. TCR = TLCΦ-CTXΦ-RS1Φ.

كفاءة التكامل بين مختلف GIs و SXT و CTXΦ في وجود وغياب الجينوم المكتسب.

تعتبر الدراسات حول كفاءة تكامل المؤشرات الجغرافية معقدة نظرًا لحجمها الكبير وطبيعتها غير التكرارية لشكلها الدائري المقتطع. لذلك ، لتجنب هذا التعقيد ، قمنا بتضخيم الوحدة التكاملية لـ GIs و SXT و CTXΦ من شكلها الدائري المقتطع ، والذي يتضمن موقع المرفق (AttP) مع أو بدون إعادة التركيب (الشكل 5). تم استنساخ وحدات التكامل في ناقل اقتران متماثل مشروط (الملحق SI، الجدول S1). تم إدخال ناقل مؤتلف يحتوي على وحدة تكامل من GIs أو SXT أو CTXΦ عن طريق الاقتران في ضمة الكوليرا سلالات تحمل موقع ارتباط الكروموسومات الأصلي (أتب) مع أو بدون بيانات جغرافية أخرى. تكامل وحدة تكاملية في كروموسوم ضمة الكوليرا تم تحديده بناءً على ملف مقاومة المضادات الحيوية (الكلورامفينيكول أو الزيوسين) للخلايا المتلقية. تم تأكيد تكامل الجهاز الهضمي في موضع كروموسومي محدد بشكل أكبر عن طريق مقايسة PCR والمقايسة اللونية الزرقاء والبيضاء. أدى اقتران النواقل المؤتلفة المختلفة التي تحمل وحدة تكامل غير متكررة من GIs و SXT و CTXΦ إلى ظهور أعداد مختلفة من المتحولين (الجدول 3). من بين GIs و SXT غير التكراري ، تم الحصول على أكبر عدد من المتحولين مع ناقل مؤتلف يحمل وحدة تكامل SXT (الجدول 3). أدى غياب GIs و prophages إلى زيادة كفاءة تكامل SXT. تم الحصول على أقل عدد من المتحولات المترابطة مع ناقل مؤتلف يحمل وحدة تكامل VSP-1 (الجدول 3). ومع ذلك ، عند مقارنتها بكفاءة تكامل GIs و SXT مع الوحدة التكرارية والتكاملية لـ CTXΦ ، تم الحصول على أكبر عدد من المتحولين مع جينوم الملتهمة (الجدول 3). للتمييز بين ضمة الكوليرا الخلايا التي تحمل الشكل التكاملي أو التكراري لوحدة RS2 الخاصة بـ CTXΦ ، قمنا بدمج موقع ارتباط الكروموسومات dif1 في منطقة الترميز الخاصة بـ لاكز تضخيم الجين من ه. القولونية. ال lacZ-dif1 أنتج الأليل β-galactosidase وظيفيًا وأنتج مستعمرات زرقاء في وجود مادة كروموجينية X-gal في لوحة التحديد. ثم قمنا بحذف الذاتية لاكز الجين من ضمة الكوليرا الخلايا ، وتم استبدال مجموعة Prophage TLC-CTX-RS1 بـ lacZ-dif1 أليل (الملحق SI، الشكل S3). تحولت سلالة المراسل التي تحمل وحدة RS2 التكرارية لـ CTXΦ إلى اللون الأزرق في وجود X-gal على لوحة التحديد ، في حين أن السلالة تحمل RS2 التكاملي في dif1 في الكروموسومات lacZ-dif1 أنتج الأليل مستعمرات بيضاء بسبب تعطيل لاكز الجين وإلغاء إنتاج β-galactosidase (الملحق SI، الشكل S3). أظهر عدد المتحولين المتحدرين مع نفس ناقل المؤتلف في وجود وغياب GIs الأخرى في الخلايا المضيفة نتائج مختلفة (الجدول 3). تم قياس كفاءات التكامل لـ CTXΦ ومشتقاته في غياب TLCΦ و prophages الأخرى. يمكن أن تتكامل وحدة التكامل الخاصة بـ SXT و VPI-1 تقريبًا بكفاءة متساوية في وجود وغياب المؤشرات الجغرافية الأخرى في ضمة الكوليرا الجينوم. تم تقليل كفاءة تكامل VPI-2 في غياب المؤشرات الجغرافية الأخرى. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم زيادة كفاءة تكامل VSP-1 و VSP-2 في غياب المؤشرات الجغرافية (الجدول 3).

أدوات وراثية مصممة لقياس كفاءة التكامل لمختلف GIs و ICE (SXT) و CTXΦ. تم تضخيم وحدة التكامل لجميع العناصر من شكلها الدائري المقتطع ، والذي يتضمن موقع التعلق (AttP) مع أو بدون إعادة تركيب التيروزين. المتجه الأصلي (pSW23T) غير قادر على النسخ المتماثل بتنسيق ضمة الكوليرا نظرا لشروطها أوري (R6K) وظيفة.

ترددات التكامل للجزر الجينومية المختلفة ، عنصر CTXΦ و SXT في وجود وغياب العناصر الوراثية المكتسبة

لقد قمنا أيضًا بقياس كفاءة التكامل لوحدة RS2 غير المتماثلة لـ CTXΦ في dif1 موقع Chr1 في ضمة الكوليرا سلالة مراسل BS1 و BB1. لاحظنا كفاءة تكامل مماثلة لوحدة RS2 غير المتماثلة في وجود وغياب GIs مختلفة. كان حدث التكامل لوحدة RS2 غير المتماثلة خاصًا بالموقع (≥99.3 ٪) ولا رجعة فيه ، سواء في وجود أو عدم وجود مؤشرات جغرافية أخرى (الجدول 3).

تبادل الحديث بين العناصر الجينية المكتسبة أفقيًا والجينوم الأساسي.

تبادل الحديث بين GIs و prophages في ضمة الكوليرا هي ظاهرة معروفة (29 ، 30). ومع ذلك ، فإن تأثير الوظائف المكتسبة في وظائف الجينات الموجودة في الجينوم الأساسي غير معروف. فهم الأساس الجزيئي لأهمية LexA في ضمة الكوليرا له أهمية خاصة بسبب مساهمته في بيولوجيا MGEs المكتسبة أفقياً ، لا سيما في تكرار وتكامل وإنتاج CTXΦ خارج الصبغيات من العوارض واستئصال ونشر SXT. لقد حللنا لغز جوهرية LexA في ضمة الكوليرا عن طريق حذف ليكسا الجين من الكروموسوم في الهندسة ضمة الكوليرا تم حذف سلالة BB1 باستخدام GIs و prophages (الجدول 1). استخدمنا ناقل pAP17 مؤتلف يحتوي على كاسيت مقاومة كاناميسين (aph3) تحيط بها مناطق المنبع والمصب ليكسا لحذف ليكسا الجين بطريقة التبادل الأليلي. لتحديد العنصر الجيني الرئيسي المسؤول عن أهمية ليكسا الجين فيها ضمة الكوليرا الجينوم ، اخترنا سلالات GI مفردة أو متعددة أو سلالات محذوفة من Prophage (الجدول 1) متبوعة بمحاولة لحذف ليكسا في كل من هذه السلالات المهندسة. والمثير للدهشة أن مثل هذا الفحص سمح لنا باكتشاف أن ليكسا الجين ليس ضروريًا في TLC-CTX-RS1 المحذوف ضمة الكوليرا الخلايا ، لكنها لا تزال ضرورية في سلالة مفردة أو متعددة سلبية الجهاز الهضمي (الجدول 4). لتحديد ما إذا كانت مجموعة TLC-CTX-RS1 أو أي واحدة من هذه العاثيات مسؤولة عن أهمية ليكسا، تم حذف كل منهم بالتسلسل ، متبوعًا بمحاولة الحذف ليكسا في تلك السلالات المهندسة. ومن المثير للاهتمام أنه تم تحديد ذلك ليكسا ليس ضروريًا فقط في الخلايا المحذوفة من CTX (الجدول 4). يتكون Prophage CTX من RS2 والمنطقة الأساسية. بينما يحمل RS2 rstR-rstA-rstB الجينات ، يحمل الجزء الأساسي سبعة جينات مختلفة بما في ذلك الترميز المقطعي المحوسب ctxAB الجينات. من ناحية أخرى ، فإن RS1Φ مطابق لـ RS2 إلا أنه يحمل جينًا إضافيًا يسمى rstC. ال rst, rstB، و rstR تعتبر المنتجات الجينية ضرورية لتكرار الملتهمة ، والتكامل ، وتنظيم النسخ ، على التوالي. منذ التعبير عن rstR, rst، و rstB تحت سيطرة LexA من P.rst المروج (31) ، لذلك قمنا بتحليل وظيفة كل من هذه البروتينات لفهم مساهمتها ، إن وجدت ، في أهمية ليكسا الجين فيها ضمة الكوليرا. RstB هو بروتين مرتبط بالحمض النووي أحادي السلسلة ، مما يساعد في تكامل CTXΦ و RS1Φ في الكروموسومات ديف موقع. RstR هو منظم نسخي ، يقوم بقمع نسخ ملفات rst, rstB، و rstC من صrst المروجين (الملحق SI، الشكل S3). RstA هو بروتين Rep ، الذي يقدم نكات الحمض النووي في أوريctx التسلسل ويساعد CTXΦ على توليد جينوم العاثيات خارج الصبغية من النبضة. افترضنا أنه في حالة عدم وجود قمع بوساطة LexA ، يمكن أن يكون هناك إنتاج زائد من RstA من بروفاجات CTX و RS1 ، والتي بدورها تولد شقوقًا متكررة في DNA Prophage CTX و RS1 ، مما يؤدي إلى حدوث فواصل كروموسومية مميتة. لاختبار هذه الفرضية ، حاولنا دمج CTXΦ أو CTXΦ-RS1Φ جنبًا إلى جنب في ضمة الكوليرا Δليكسا ΔCTXΔRS1 متحولة لكنها فشلت في دمج نسخ متعددة من CTXΦs أو CTXΦ-RS1Φ بالترادف. في تباين حاد ، تكامل نسخ متعددة من CTXΦs أو CTXΦ-RS1Φ جنبًا إلى جنب في dif1 موقع ال ضمة الكوليرا ΔCTXΔRS1 لكن ليكسا- تم الحصول على سلالة إيجابية بسهولة (الملحق SI، الشكل S1). نظرًا لأن RecA يرتبط ارتباطًا وثيقًا باستقرار LexA وبالتالي نشر التعبير الجيني ، فقد صممنا ΔليكساΔrecA سلالة متحولة مزدوجة JV5 والتحقيق في رقم نفاذية CTX في dif1 الموقع بعد إدخال العاثية عن طريق الاقتران. مثل Δليكسا سلالة ، كانت نشرة CTX أحادية النسخة هي المهيمنة أيضًا في ΔليكساΔrecA متحولة مزدوجة (الملحق SI، الشكل S1). لتقديم المزيد من الأدلة على أن النسخة المتعددة وظيفية rst يرتبط بأساسيات LexA في ضمة الكوليرا، أجرينا عملية الطفرات الموجهة بالموقع لاستبدال بقايا التيروزين الحفزية لعزر RIYNK لبروتين RstA مع بقايا فينيل ألانين. بسبب هذه الطفرة النقطية ، لم يتمكن بروتين متحولة RstA Y237F المشفر هندسيًا CTXΦ غير النشط تحفيزيًا من بدء تكرار الدائرة المتدحرجة في ضمة الكوليرا. ومع ذلك ، فإن نسخة واحدة من CTXΦ تحمل RstA غير الوظيفية تم تحللها بشكل ثابت في وجود وغياب LexA. تشير هذه النتائج بقوة إلى ذلك ، عندما تكون وظيفية rst الجين موجود في ضمة الكوليرا الجينوم ، حذف ليكسا قاتلة للبكتيريا. أكدت مراقبة الأنماط الظاهرية (مقاومة المضادات الحيوية) وكذلك الأنماط الجينية (اختبار PCR والتسلسل) صحة هذه ضمة الكوليرا المسوخ.

ضرورة ليكسا من أجل بقاء ضمة الكوليرا في وجود وغياب الجزر الجينومية و Prophages

يساعد RecA المشفر بالجينوم الأساسي CTXΦ على التغلب على مناعة المضيف وإعادة التأهيل ضمة الكوليرا.

بخلاف RstA المشفر بالتهوية ، يلعب الهليكاز UvrD المشفر بالكروموسومات و LexA أيضًا دورًا مهمًا في تكرار CTXΦ (30). تم الإبلاغ عن أن RstR ، عامل النسخ المشفر CTXΦ ، يرتبط بـ rst مروج (صrst) ويقمع تعبيره من جينوم النبوة (31). ومع ذلك ، يحدث القمع الكامل من خلال التفاعل التعاوني مع LexA ، المنظم الرئيسي للاستجابة البكتيرية SOS. أهمية RecA ، ثاني بروتين حاسم للاستجابة البكتيرية SOS ، في تكرار CTXΦ في ضمة الكوليرا لم يتم استكشافها. قمنا بقياس كفاءة التكرار لأنواع El Tor ، والأنواع الكلاسيكية ، والبيئية من CTX في وجود وغياب RecA في مختلف ضمة الكوليرا سلالات (الشكل 6). يحتوي جينوم N16961 على نشرة CTXΦ ET في كروموسومها الكبير. قدمنا ​​وحدة النسخ والتكامل لـ CTXΦ ET (RS2 ET) و CTXΦ Cl (RS2 Cl) في RecA-positive N16961 و transconjugants المعزولة على لوحة اختيار مكملة بالكلورامفينيكول. حصلنا على 2.44 × 10 4 و 3.32 × 10 5 متحولات الاقتران التي تحمل RS2 ET (pBS66) و RS2 Cl (pBS22) ، على التوالي (الشكل 6). لقد قدمنا ​​أيضًا CTXΦ ET و RS2 ET و RS2 Cl و RS2 Env و RS1Φ كاملة في المراسل ضمة الكوليرا السلالة BS1 تفتقر إلى نشرة CTXΦ في جينومها ، والتي لديها RecA وظيفي. من الجدير بالذكر أنه تم الحصول على أعداد متشابهة من المتحولون المتحولون لكل من العاثيات التي تم إدخالها (الشكل 6). عندما قدمنا ​​كل من هذه العاثيات في مشتق BS1 الذي يؤوي CTXΦ ET prophage في dif1 loci ، هنا أيضًا حصلنا على عدد مماثل من transconjugants التي تحمل جينومات الملتهمة التكرارية والتكاملية أو وحدات RS. تشير النتائج إلى أن الإصابة مرة أخرى بواسطة CTXΦ ممكنة حتى في وجود نوع حيوي محدد rstR والوظيفية recA الجينات في جينوم المضيف (الشكل 6).

تحليل كفاءة النسخ المتماثل لـ CTXΦ المختلفة في وجود وغياب وظيفة RecA. تمثل الأعمدة عدد وحدات CFU التي تحمل وحدة تكرار لـ CTXΦ. تم نقل الوحدات المتماثلة إلى البكتيريا المضيفة بواسطة اقتران 3 ساعات. تم اختيار المتحولون المتحدون بناءً على الأنماط الظاهرية المقاومة للمضادات الحيوية. تم استخدام اتجاهين RM-ANOVA لاستنتاج دلالة إحصائية للاختلافات في أرقام CFU. تشير أشرطة الخطأ إلى SDs. Wt ، النوع البري ET ، El Tor (أ) Cl ، كلاسيكي (ب) بيئي بيئي (ج) TCR ، TLC-CTX-RS1 prophage. * = CTXΦ ET Cam.

نظرًا لأن وظيفة RecA مرتبطة ارتباطًا وثيقًا باستجابة SOS وتعديل نشاط التحلل الذاتي لـ LexA ، فقد قمنا بتوسيع دراستنا لفك تشفير دور RecA في تكرار CTXΦ. للقيام بذلك ، تم إدخال جميع العناصر الجينية ، وهي CTXΦ ET و RS2 ET و RS2 Cl و RS2 Env ، في recA- تم حذف سلالة BS1 ، وتمت مقارنة أعداد المتحولين على ألواح الاختيار. تم الحصول على أعداد مماثلة من transconjugants التي تحمل جينومات الملتهمة التكرارية والتكاملية أو وحدات RS في وجود RecA الوظيفية (الملحق SI، الجدول S2). ثم قمنا بحذف ملف recA في N16961 وقدم CTXΦ ET و RS2 ET و RS2 Cl و RS2 Env لمراقبة كفاءة النسخ المتماثل للعناصر المشتقة من الملتهمة. لدهشتنا ، بينما لم يتم الحصول على متحولة لعنصر CTXΦ ET أو RS2 ET في غياب recA، يمكن الحصول على محولات الاقتران لعنصر RS2 Cl (4.6 × 10 5) أو RS2 Env (5 × 10 4) باستخدام نفس ضمة الكوليرا سلالة متحولة (الشكل 6). أكدنا أيضًا هذا النمط الظاهري باستخدام سلالة BS11 المشتقة من N16961 ، والتي تفتقر recA وجميع الأنبياء. بمجرد إدخال CTXΦ ET ، أظهر أيضًا مناعة ضد الإصابة مرة أخرى بنوع مماثل من CTXΦ (الشكل 6). لاحظنا أيضًا أنماطًا ظاهرية مماثلة في النمط الكلاسيكي (O395) والبيئي (VCE232) ضمة الكوليرا سلالات عندما قدمنا ​​CTXΦ Cl أو CTXΦ Env وحدة النسخ والتكامل إلى السلالات التي تفتقر إليها recA الجين ولكن يحتوي على CTXΦ Cl أو CTXΦ Env في الكروموسوم ، على التوالي (الشكل 6 و الملحق SI، الجدول S2). في كلتا الحالتين ، يمكن أن يتكاثر CTXΦ في حالة عدم وجود recA ولكن وجود أنماط حيوية مختلفة من نفاثات CTX في الكروموسوم. لقد حرصنا أيضًا على عدم تقليل عملية الإرسال في حالة عدم وجود recA وظيفة الجين باستخدام البلازميد المترافق المتماثل pFX497 (الملحق SI، الجدول S1) كعنصر تحكم ، والذي أعطى عددًا مشابهًا من المتحولين في وجود أو عدم وجود recA. ومع ذلك ، لم يتم ربط وظيفة RecA بكفاءة تكامل CTXΦ ، حيث إنها قادرة على التكامل في ديف موقع بكفاءة متساوية تقريبًا في وجود أو عدم وجود وظيفة RecA (الملحق SI، الجدول S2). The findings of the present study demonstrate that RecA helps CTXΦ replication in the presence of preexisting CTX prophage in the host chromosome.

Contribution of GIs in Modulating Cellular Proteome.

For identification, quantification, and comparison of whole-cell proteomes of wild type ضمة الكوليرا strain N16961 and its derivative BB1 devoid of GIs and prophages, we performed experiments using a high-throughput liquid chromatography (LC) system (Eksigent 2D) coupled with Triple TOF 5600 mass spectrometer (AB Sciex). We have identified a total of 1,864 proteins in both strains (Dataset S1). Based on the proteome profile of N16961 and BB1, we categorized the protein pool into three classes: (أنا) proteins with lower abundance (>1.5 log fold changes) or absent in BB1, (ثانيا) proteins with higher abundance (>1.5 log fold changes) in BB1, and (ثالثا) proteins with similar abundance in both strains. Proteins that are not detectable in BB1 but found in the N16961 strain were analyzed to find their coding sequences. We have identified similar numbers of proteins in N16961 (ن = 1,765) and BB1 (ن = 1,724) strains. A total of 141 proteins were detected only in N16961, of which 41 proteins are encoded by the genes present in Chr2. More than 10 proteins are encoded by the 4 GIs, VPI-1 (ن = 1), VPI-2 (ن = 4), VSP-1 (ن = 3), VSP-2 (ن = 1), and CTXΦ (ن = 2), which were detected in N16961 but not in BB1. We observed that 131 proteins were differentially expressed (log fold change 1.5 and ص value <0.05) between N16961 and BB1 strains. Out of 131 differentially expressed proteins in BB1, 59 and 72 proteins were up- and down-regulated, respectively. Proteins down-regulated in BB1 belong to uncharacterized proteins (ن = 8), outer membrane proteins (ن = 2), flagellar biosynthetic proteins (ن = 2), aspartate modifying enzymes (ن = 2), and several others. Enzymes involved in succinate metabolic pathways (ن = 3), RNA degradation (ن = 2), and ABC transporters (ن = 2) are up-regulated in the absence of MGEs. Both small- and large-subunit ribosomal proteins are up- and down-regulated in the absence of MGEs. We observed that 61 proteins encoded by the Chr2 were detectable either in N16961 (ن = 25) or BB1 (ن = 36).


مناقشة

Most genomic studies on ضمة الكوليرا have focused on serogroup O1, but the global genomic landscape for the non-O1/non-O139 serogroups, the genetic diversity of the O-PS gene clusters, and the evolutionary associations with O1 and O139 serogroups have not been adequately studied. Here, we sequenced three strains from two O159 and O170 serogroups, together with 25 strains from 16 other serogroups to reveal their O-PS gene cluster organizations, genomic features and the evolutionary associations among the different serogroups.

The ANI scores between the different strains reflect the level of global similarity among them. Based on our results, serogroups O159 and O39 are most similar in terms of their ANI score, as are serogroups O170 and O89. Among all the representative strains, most share high similarity scores with each other and only serogroup O115 has an ANI score lower than 95% when compared with all the other strains.

O-PS contains genetic signatures that allow the genetic clones of strains within a species to be distinguished. The genes related to O-PS biosynthesis are generally organized together to form a cluster. All the O-PS biosynthesis genes from the 18 serogroups from this study clustered together and were chromosomally located between the gmhD و rjg genes, suggesting that site-specific transfer has occurred among the different serogroups and strains. Within the O-PS gene clusters, several genes are grouped together and appear in the O-PS gene clusters in the different serogroups, possibly showing that frequent recombination has occurred in these gene clusters. Thus, genetic variability in the O-PS biosynthesis genes, coupled with frequent genetic transfers and recombination may have generated the many serogroups of ضمة الكوليرا. Serogroups O1 and O139 cause cholera epidemics, but only one gene in the O-PS genetic region of serogroup O159 was found to share sequence homology with a serogroup O1 gene. It is interesting that serogroup O170 shares the most sequence homology in the O-PS genes with O139, suggesting that O139 and O170 O-PS genetic regions have similar sub-structures.

By visualizing their vertices and edges, networks are a useful way of displaying complicated relationships among vertices in an intuitive way, and analysis of a specified network may provide new insights into biological systems. Here, we constructed a relationship network containing different ضمة الكوليرا serogroups and their associated O-PS genes. Previous preliminary research has shown there is variety in the O-PS genetic region in the different serogroups [19], and our network analysis on the homologous genes in the present study supports the idea that there is great diversity in the O-antigen among different serogroups, a viewpoint supported by our 2-dimensional hierarchical clustering analysis. This analysis made further efforts to decipher the detailed relationship between the different serogroups and the contributions of the constituent O-PS genes in each serogroup. The O-PS gene cluster size and gene count showed great divergence among the serogroups. Except for the left and right junction genes in the wb* regions encoding O-PS synthesis, no genes were shared by all the serogroups, further indicating the genetic diversity of the O-PS in ضمة الكوليرا. Based on the network analysis, some genes shared by more than two serogroups were identified, showing that exchange and recombination has occurred in the genes and even in the gene clusters among the O-PS genetic regions from the different serogroups. This is further supported by the finding that the O-PS genetic regions comprise the combinations of several smaller gene sets with different origins [20]. Our data have revealed that the O-PS biosynthesis gene pool contains 405 homologous gene clusters, and the network analysis results suggest the hot-spots for serogroups or homologous genes that link other serogroups or homologous genes to a high degree. We suggest that the genes in the gene pool facilitate O-antigen shifts in the different ضمة الكوليرا serogroups. Serogroup conversion of the O1 recipient by the O139 donor has been validated in the laboratory, and it is proposed that the exchange of serogroup-specific gene clusters could potentially occur between the different O serogroups of الخامس. cholerae [21].

Our phylogenetic analysis revealed that most toxigenic O1 ضمة الكوليرا strains and two classical strains form two separate clusters in the tree. One O139 strain clustered together with most toxigenic O1 ضمة الكوليرا strains. Two non-O1, non-O139 strains, V52 (O37) and 981–75 (O65), appear in the same cluster with toxigenic O1 ضمة الكوليرا strains, indicating the possibility of O serogroup conversions from O1 to non-O1/non-O139 [20, 22]. Most of the non-O1/non-O139 strains were distributed in the other part of the tree, a finding consistent with that of a previous study [20]. Furthermore, we investigated whether the O-PS biosynthesis gene clusters had undergone co-evolution with the whole genomes in the different ضمة الكوليرا serogroups. The genomes and O-PS genes had different phylogenic structures in these strains, revealing that asynchronous genetic variation had occurred during their evolution. We also found that several serogroup pairs had consistent relationships between core-genes or pan-genes and the O-PS genetic region. The consistency between the core gene-based and O-antigen region-based genetic distance indicates that these serogroups had the same common ancestors before gaining similar O-PS genetic regions. In addition, the consistency between the pan gene-based and O-PS genetic region-based distance indicates that these serogroups have undergone some horizontal gene transfer events and acquired similar foreign genes before gaining similar O-PS genetic regions.

The virulence-related genes in the ضمة الكوليرا strains displayed the highest levels of sequence similarity with those from P. الزنجارية, V. vulnificus, H. somnus و H. influenzae. كما ضمة الكوليرا has an aboriginal habitat in the environment, these data suggest that ضمة الكوليرا can exchange virulence-related genes with the above-named species under certain environmental conditions.

Changes that occur in mobile genetic elements may relate to the emergence, drug resistance, fitness and virulence of a strain. Here, we analyzed the profiles of the mobile genetic elements (i.e., VPI-1, VPI-2, VSP- I, VSP-II, SXT and CT) in the different representative strains. We found O159 had a nearly complete VSP-II and partial VPI-1 and VPI-2 sequences, whereas the O170 strain carried partial VPI- 1 and VPI- 2 sequences. VSP-II is considered to be a genetic marker of epidemic ضمة الكوليرا therefore, gaining VSP- II may allow a strain to obtain a survival advantage during epidemics [23]. VPI is one of two essential virulence gene clusters in epidemic-causing toxigenic ضمة الكوليرا. Several non-O1/non-O139 strains contain full or partial VPI-1 and VPI-2 islands, indicating their potential to evolve into epidemic strains. Because alteration of the O-antigen in pathogenic strains will boost the emergence of new epidemic strains, a combined description of the O-PS genetic region in the non-O1/non-O139 serogroups and their virulence elements, such as CT and TCP, will provide further information on the genesis mechanism of new emerging strains.

Positive selection is known to be an important aspect of the evolution of many pathogens [24, 25]. Indeed, one study showed that the diversification of clinical and environmental ضمة الكوليرا isolates from Haiti was driven by positive selection [26]. Selection pressure analysis of strains within the different ضمة الكوليرا serogroups should provide detailed information on their evolutionary trends. Here, we found that several of the strains share genes that appear to have evolved under positive selection and are involved in environmental adaptation (e.g., chemotaxis, Na + resistance and cell wall synthesis). These functions may represent the common mechanisms used by strains within the different serogroups to adapt to environmental changes. Serogroup-specific selected genes were also found, and some positively-selected genes may exist in more than one serogroup. Thus, the genetic complexity of the different serogroups and strains may reflect their adaptability to different niches.


Availability of a database containing the proteins of Vibrio cholerae and their corresponding gene sequences - Biology

We showed previously that chitin catabolism by the marine bacterium Vibrio furnissii involves at least three signal transduction systems and many genes, several of which were molecularly cloned, and the corresponding proteins were characterized. The predicted amino acid sequences of these proteins showed a high degree of identity to the corresponding proteins from ضمة الكوليرا, whose complete genomic sequence has recently been determined. We have therefore initiated studies with ضمة الكوليرا. We report here a novel ATP-dependent glucosamine kinase of ضمة الكوليرا encoded by a gene designated gspK. The protein, GspK (31.6 kDa), was purified to apparent homogeneity from recombinant الإشريكية القولونية. The product of the reaction was shown to be GlcN-6-P by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI mass spectrometry) and NMR. ال كم values for GlcN, ATP, and MgCl2 were 0.45, 2.4, and 2.2 m m , respectively, and the الخامسالأعلى values were in the range 180–200 nmol/μg/min (∼6 nmol/pmol/min). Kinase activity was not observed with any other sugar, including: galactosamine, mannosamine, Glc, GlcNAc, GalNAc, mannose, 2-deoxyglucose, and oligosaccharides of chitosan. The enzyme is also ATP-specific. The kinase can be used to specifically determine micro quantities of GlcN in acid hydrolysates of glycoconjugates. The physiological function of this enzyme remains to be determined.

Published, JBC Papers in Press, February 15, 2002, DOI 10.1074/jbc.M107953200

This work was supported by Grant GM51215 from the National Institutes of Health.The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. لذلك يجب وضع علامة على المقالة بموجب هذا "الإعلانات"وفقًا لـ 18 U.S.C. القسم 1734 فقط للإشارة إلى هذه الحقيقة.

Present address: ISM Biopolymer, 220 Denison E. Granby, Quebec J2H 2R6, Canada.


مناقشة

In this study, we adopted reverse vaccinology based reductive screening and fished out five immunogenic proteins harboring 10 peptide epitopes as potential vaccine candidates in the ضمة الكوليرا proteome. Reverse vaccinology is a genome/proteome based approach for vaccine development that has been proved effective (Giuliani et al., 2006). Reductive screening is performed based on parameters i.e., protein essentiality, subcellular localization, host homology and effective immunogenicity for predicting an effective vaccine candidate. A computer-aided screening process is more convenient, accurate and fast in comparison with the contemporary vaccine development which depends on a hit and trial approach. This strategy studies key aspects of the pathogen i.e., genome, essential metabolism, virulence and protein-protein interactions and incorporates this information for determining the prospective vaccine candidates prior to any wet lab experimentations (Naz et al., 2015). One of the key limitation is that this strategy is primarily focused on prediction of peptide epitopes based on amino acid sequences of the proteins. Hence, the long known immunogenic potential of nonprotein antigens (i.e., Lipopolysaccharides) couldn’t be accounted in this strategy (Lüderitz et al., 1982 McGhee et al., 1980 Del Barrio et al., 2015). But the addition of such known epitopes as adjuvants is a good approach for overcoming this limitation (Caucheteux et al., 2017 Noguchi et al., 2017). Another prominent limitation could be the high mutation rate of the viral surface proteins (Steinhauer & Holland, 1987 Echave, Spielman & Wilke, 2016). The prospects of reverse vaccinology approach have been discussed in detail in our previous study (Rashid et al., 2017).

Peptide vaccines theoretically have several advantages over conventional and recently developed DNA vaccines (Ingolotti et al., 2010). Lesser cost and convenient synthesis with improved safety and stability are the key features which have been demonstrated in various studies (Firbas et al., 2006 Jagannath et al., 2009). Conventional vaccines are overburdened with unnecessary antigens which divert immune response resources thus might result in a chaos which lacks the required dedicated for eliminating the threat thus impedes the vaccine efficacy (Czerkinsky & Holmgren, 2015). As in case of cholera, whole cell vaccines were only able to impart varying protective efficiency (39–60%) in studies conducted in Bangladesh and Vietnam (Clemens et al., 1990 Thiem et al., 2006). While live attenuated vaccine was unsuccessful in generating long term protective response (Fournier, 1998). One interesting inconsistency is the comparative efficacy of cholera vaccines in developed and developing countries (Czerkinsky & Holmgren, 2009), while a notable recent exception was observed in South Sudan (Bekolo et al., 2016). Considering these factors, the need for novel strategy is vital to achieve protection against this pathogen.

Reported prioritized targets included lipoprotein NlpD, outer membrane protein OmpU, accessory colonization factor AcfA, putative porin, and outer membrane protein OmpW. These predicted proteins are involved in important virulence mechanisms of ضمة الكوليرا. Role of lipoprotein NlpD, has been studied in reference to cell division and intestinal colonization by the pathogen. Septal peptidoglycan (PG) amidase, AmiB is involved in separation of daughter cells at the end of cell division process (Yakhnina, McManus & Bernhardt, 2015). AmiB is regulated by NlpD في ضمة الكوليرا (Möll et al., 2014). Both of these processes are important for pathogen’s survival in host intestine. Another predicted potential target accessory colonization factor AcfA is of peculiar interest as it has been subjected to edible vaccine (Sharma et al., 2008). الاستهداف NlpD و AcfA could provide passive therapeutic potential as immune inactivation would impede the pathogen’s ability to colonize and multiply in the small intestine.

Among these vaccine candidates, we obtained two outer membrane proteins (OMPs), OmpU and OmpW that also serve as antibiotic resistance determinants. In vibrio species OMPs are studied to play vital roles as porins in iron, phosphate and sugar acquisition as well as in bacterial attachment to solid surfaces (Aeckersberg et al., 2001). في حين OmpU has been reported to be involved in conferring polymyxin B sulfate resistance (Mathur & Waldor, 2004). We consider OmpU as an important vaccine candidate selected via our computational framework as it is not only involved in host cell invasion but also confers antibiotic resistance (Duperthuy et al., 2011). Moreover, it has also been used as an effective vaccine candidate in other vibrio species such as V. alginolyticus و V. هارفي في Lutjanus erythropterus و Scophthalmus maximus, respectively (Cai et al., 2013 Wang et al., 2011). Such studies provide good examples of how a reverse vaccinology strategy can be used for systematic vaccine design against drug resistant microbial pathogens.

Another important predicted potential vaccine candidate is OmpW. It’s a characteristic outer membrane protein expressed by ضمة الكوليرا and has been used to identify infectious agent via different PCR based detection techniques. Studies have reported this protein to be conserved and harbors immunogenic properties (Nandi et al., 2005 Jalajakumari & Manning, 1990). Considering its abilities, OmpW could be a good candidate for developing a broad spectrum and effective vaccine.

Interestingly, when we analyzed our screened results with a recent antibody profiling study of the ضمة الكوليرا O1 protein immunome, nine overlapping antigens were observed (Charles et al., 2017). These antigens were: Organic solvent tolerance protein (VC0446), outer membrane protein OmpU (VC0633), toxin co-regulated pilin (VC0828), outer membrane protein OmpV (VC1318), neuraminidase (VC1784), hemolysin-related protein (VC1888), and flagellar proteins/components (VC2142, VC2143, VC2187). Among these nine, outer membrane protein OmpU (VC0633) was common in the most effective antigens reported in the final selection of the both studies. While toxin co-regulated pilin (VC0828) was among our initial screening list but it is reported as one of the most effective by Charles et al. (2017). One possible reason of the screening results could be the difference in the adopted screening strategies. Our strategy was purely computational, with the calculations all derived using only the peptide sequences of the proteins. A shortcoming to this is that it could only be applied for peptide antigens, while on the other hand antigens other than proteins do have their immuno-protective potential i.e., the O polysaccharide, LPS, etc. These overlapping proteins in the two investigations provide confidence to our prediction.


Present address: The 306th Hospital of PLA, Beijing, 100101, China

Present address: CAS key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, China

الانتماءات

The 306th Hospital of PLA, Beijing, 100101, China

Yong Yi, Liping Jia, Hua Jing, Hu Xia & Yan Cui

CAS key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, China

Na Lu, Fei Liu, Jing Li, Ruifen Zhang, Baoli Zhu & Yongfei Hu

Beijing Key Laboratory of Microbial Drug Resistance and Resistome, Beijing, 100101, China

Na Lu, Fei Liu, Jing Li, Ruifen Zhang, Baoli Zhu & Yongfei Hu

Department of Obstetrics and Gynecology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100730, China


خلفية

Identification of conserved protein domains that span a wide range of biological functions provide deep insights regarding the origin and evolution of complex biological systems, These versatile conserved domains often have catalytic or structural roles that can be utilized, with small variations, in different contexts. The P-loop-containing nucleotide phosphatase fold represents one such catalytic domain that is utilized in almost every conceivable biological system in all the three superkingdoms of life [1,2]. Folds such as the SH3-like barrels, the PAS-like fold, the OB fold, the double-stranded β-helix, the β-propeller and rubredoxin-like zinc ribbons are predominantly non-catalytic domains that are widely represented in multiple functional contexts, with roles such as small-molecule binding, nucleic-acid binding and interaction with other proteins [3,4,5] (see also the SCOP [6] and CATH [7] databases). Versatile globular domains appear to have emerged fairly early in evolution in various fold classes, such as the α/β or α+β mixed folds, or the all-α and all-β folds [5,8]. Comparative genomics and evolutionary studies indicate that many of these versatile folds probably emerged in contexts related to RNA binding in the ancient translation system and were subsequently re-utilized in other biological systems [9,10].

Of particular interest in this context are the small all-β folds that assume conformations such as barrels or β-helices [3,4]. These structures have considerable potential for functional versatility, because they are able either to accommodate small molecules within cavities formed by the curved β-sheets or to interact with various larger molecules, especially nucleic acids or proteins, via the external surfaces of the sheets. A few ancient and widespread β-rich folds such as the SH3-like barrel and the OB fold appear to have colonized multiple functional niches early in evolution, although their earliest versions may have had roles related to RNA metabolism [9,11,12,13]. We were interested in identifying other such functionally versatile β-rich folds that could be traced back to the early stages of life's evolution. The availability of extensive genome sequence data and advances in structure determination over recent years allow the successful application of comparative genomics, sequence and structure comparisons to identify any such folds that may be somewhat less widely represented than the OB or SH3-like folds.

Here, we identify one such β-barrel fold typified by the globular domain of the H subunit of the photosynthetic reaction center (PRC-H) from purple proteobacteria such as رودوبسودوموناس فيريديس [14,15]. The purple bacterial photosynthetic reaction center consists of three primary subunits, of which PRC-L and PRC-M primarily bind the pigments involved in photochemistry, whereas PRC-H appears to be a key regulator of electron transfer between the quinones in photosynthetic reaction centers [16]. So far, homologs of the H subunit have only been found in photosynthetic proteobacteria [17,18,19] and the carboxy-terminal globular domain of PRC-H shows a distinct β-barrel fold that is structurally unrelated to other characterized β-barrels. This raises the important question of the evolutionary provenance of this unique domain. Here we use sequence-profile analysis and comparative genomics to show that the β-barrel domain of PRC-H defines a novel, widespread superfamily of β-barrel domains that is represented in several bacterial, plant and archaeal genomes. We also show that this β-barrel domain is found in the conserved protein RimM, which is involved in RNA processing and ribosomal assembly in the course of translation. Thus we provide evidence for an unexpected evolutionary connection between RNA metabolism, translation and the redox reactions in photosynthesis in the form of a shared functionally versatile β-barrel domain.


مناقشة

The genomic island of V. parahaemolyticus TS 8-11-4 was deemed a PAI due to the presence of virulence genes on this island, despite its environmental origin (Schmidt and Hensel 2004 Hasan et al. 2010 Dobrindt et al. 2004). The thermostable direct hemolysin gene (tdh) was found on this island, as well as genes involved in the type three secretion system II (T3SS2). كلا ال tdh gene and T3SS2 complex are the two major virulence factors implicated in V. parahaemolyticus pathogenesis (Makino et al. 2003 Park et al. 2004 Yanagihara et al. 2010). A collagenase gene was found on the island collagenase is thought to be involved in V. parahaemolyticus virulence (Gode-Portratz et al. 2011). The genomic island of V. parahaemolyticus strain TS-8-11-4 is a PAI, and more specifically, because it contains tdh and T3SS2 genes, we designate this island as a VPAI-7 (VPaIα or tdhVPA) (Makino et al. 2003 Sugiyama et al. 2008 Xu et al. 2017).

Four genes involved in capsule production, as well as one integrase gene, and a Na + /H + antiporter (nhaA) were also found on this PAI. Capsules aid pathogens in evasion of host immune defenses, establishing infections, and survival in harsh environments, such as the stomach. V. parahaemolyticus virulence is correlated with capsule production (Broberg et al. 2011 Letchumanan et al. 2014). One capsule gene had high homology with Gram positive capsule production genes. This is interesting because vibrios are Gram negative organisms, so this gene may have been acquired laterally. An integrase gene was found near the center of the island. Integrase genes are associated with PAIs and function to integrate foreign DNA into the genome (Hacker and Kaper 2000). Usually VPAI-7 does not contain an integrase gene, but a few transposon genes instead (Ceccarelli et al. 2013). Finally, we determined that a nhaA gene is located on this genomic island. nhaA genes encode Na + /H + antiporters, which transport ions to balance pH. Na + /H + antiporters aid ضمة الكوليرا in environmental persistence (Vimont and Berche 2000) and are essential for يرسينيا بيستيس virulence (Minato et al. 2013).

مشابه ل V. parahaemolyticus, the two islands found for the V. vulnificus WR-2-BW strain are characterized as PAIs due to the presence of virulence genes and virulence-related genes. Two of these genes had virulence-related functions, a putative LPS biosynthesis protein gene and an O-antigen flippase wzx الجين. These genes are virulence-associated factors, as they do not directly cause host cell damage, but they do contribute to pathogenesis, aiding in the establishment of infections. Lipopolysaccharide (LPS) is a main component of the outer membrane of Gram negative bacteria, and is a known pyrogen (fever-producing agent) (McPherson et al. 1991 Jones and Oliver 2009). Phylogenies show that the LPS biosynthesis protein gene from V. vulnificus WR-2-BW was closely related to an LPS biosynthesis protein gene from a Vibrio coralliilyticus محيط. The O-antigen flippase wzx gene is part of the major class of O-antigen gene clusters, and it encodes a hydrophobic protein with 12 potential transmembrane segments (Liu et al. 1996).

A cytolysin secretion gene, vvhB, was found also found on the 143 kbp V. vulnificus جزيرة. Cytolysins lyse erythrocytes by forming small pores in the cytoplasmic membrane or binding to cholesterol to interrupt potassium and sodium ion channels (Choi et al. 2002). في V. vulnificus, the expression and mechanism of cytolysins vvhA و vvhB are not fully understood, however, they are both believed to play a role in pathogenicity (Choi et al. 2002). They are homologous to a known ضمة الكوليرا El Tor hemolysin (Choi et al. 2002 Yamamoto et al. 1990). Phylogenies show that the vvhB gene in the V. vulnificus WR-2-BW strain was 99% identical to other V. vulnificus vvhB genes from other strains.

Other genes of interest on the 143 kbp PAI include a chitinase gene, tldD/tldE proteolytic complex genes, and type IV secretory pathway components. في الإشريكية القولونية, it was shown that the TldD and TldE proteins could be involved in regulating gyrase function as well as aiding in proteolytic activity (Allali et al. 2002). The chitinase gene had a 99% blast identity score to the chitinase gene found in the V. vulnificus YJ016 strain however, the chitinase gene in YJ016 is located on the first chromosome and WR-2-BW’s chitinase gene is located in the second chromosome. Chitinous exoskeletal materials of invertebrates can be a source of carbon and nitrogen for bacteria vibrios in particular have a well-known association with marine copepods (Kaneko and Colwell 1975 Lovell 2017). ضمة الكوليرا has a well-studied association with copepods, which commonly serve as a vector of cholera infections in Bangladesh water systems (Tamplin et al. 1990). Chitinase has been identified as part of the mechanism for adsorption and attachment to copepods, which relates to its ability to colonize its host and degrade the host exoskeleton, increasing the overall ecological fitness of the vibrios (Huq et al. 1983 Nalin et al. 1979 Bhowmick et al. 2006).

Vibrio diabolicus had a large genomic island that did not contain any virulence factors or virulence associated genes, which we defined as a fitness island, as it contained genes that would aid the organism in persistence in the environment. Toxin–antitoxin (TA) systems are found either on plasmids, genomic islands, or within the chromosome and are made up of closely linked toxin and antitoxin genes. The encoded labile antitoxin protects the host from the stable toxin, while competitor cells that do not have the TA system (and respective antitoxin) are eliminated (Hayes 2003 Van Melderen and Saavedra 2009). Sometimes TA systems are referred to as “addiction modules” because the host cell is dependent on the antitoxin (Van Melderen and Saavedra 2009). The toxin and respective antitoxin loci are usually found neighboring each other, often overlapping (Hayes 2003). Seven type II TA toxins were found on JBS-8-11-1’s fitness island, along with their neighboring respective antitoxins. Type I TAs include RNA antitoxins, while type II TAs have protein antitoxins (Hayes 2003). ال relE, yafQ، و yoeB toxin genes encode mRNA interferase endoribonucleases all three of these toxin genes were detected on this fitness island. ال وثيقة toxin gene (death on curing) inhibits translation by blocking translation elongation at the 30S ribosomal subunit (Lui et al. 2008) three copies of the وثيقة toxin gene and three copies of its antitoxin partner gene, phd (prevent host death) were found on JBS-8-11-1’s fitness island. وثيقة toxin genes and phd antitoxin genes are widespread in vibrios and were also found on V. parahaemolyticus strain TS-8-11-4’s PAI as well as V. vulnificus strain WR-2-BW’s PAI (Fig. 2).

Maximum-likelihood phylogeny (Kimura 2-parameter model) of وثيقة toxin genes and phd antitoxin genes. Bold indicates sequences obtained from this study. The bootstrap values represent 1000 replications, and values of less than 50 are not shown. The reference sequences were acquired from NCBI GenBank

Lateral gene transfer in environmental strains

PAIs are present in environmental فيبريو strains and are most likely acquired via lateral gene transfer. All four of the islands described here have significant lower GC content than the rest of the genome, providing evidence that these islands originated from a foreign source and were transferred into these genomes relatively recently. Additional evidence includes mobile genetic elements, such as phage and plasmid genes, integrases, and transposons. Virulence loci on VPAI-7 have been detected in environmental species that do not cause human infections: Vibrio mimicus, فيبريو هارفي، و الضمة الطبيعية (Gennari et al. 2011 Klein et al. 2014). Clearly, lateral transfer of individual virulence loci and/or entire PAIs is occurring between and among environmental vibrios. It is well documented that ضمة الكوليرا enters a natural competency state in the presence of chitin or under low-nutrient conditions (Hazen et al. 2010 Metzger and Blokesch 2016) however, less is known about uptake of exogenous DNA by other فيبريو محيط. Further studies examining the rates of lateral transfer among vibrios in the environment are needed. Vibrios survive, persist and can undergo rapid population expansions (bloom) in coastal ecosystems. Consequently, the pathogenicity loci (and potential of said loci to be transferred laterally) of naturally occurring environmental strains are clearly important.


شاهد الفيديو: Vibrio Cholerae Cholera - Pathophysiology - Symptoms - Diagnosis - Treatment (كانون الثاني 2023).