معلومة

تحتاج إلى إنشاء مكتبة من تسلسل ترميز الثدييات

تحتاج إلى إنشاء مكتبة من تسلسل ترميز الثدييات


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد استنساخ 100 تسلسل ترميز مختلف من الإنسان أو الفأر إلى ناقل تعبير لتحليل الأنماط الظاهرية في زراعة الأنسجة. يمكنني تنفيذ جميع الخطوات ، لكنني لست متأكدًا مما يجب أن أستخدمه كنموذج لردود الفعل الخاصة بي. من الناحية المثالية ، سأشتري مجموعة من cDNAs كاملة الطول من مجموعة من الأعضاء ، وأقوم بالتضخيم من ذلك. بشكل أقل مثالية ، يمكنني إنشاء cDNA بنفسي ، من أعضاء متعددة وتجميعها. هل لدى أي شخص اقتراحات بشأن مصدر النموذج؟


  • تحقق من مكان وجود هذه النصوص بشكل عام (لا ينبغي أن يكون هذا صعبًا على الكائنات الحية الشائعة)
  • إذا تم التعبير عنها جميعًا في نسيج معين ، استخدم cDNA من هذا النسيج
  • إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتجميع cDNAs من أنسجة مختلفة بحيث يمكن تضخيم جميع الجينات
  • تتوفر أيضًا مكتبات cDNA (بما في ذلك الكائن الحي بالكامل) ويمكنك الحصول عليها من أقرب مستودع (أعتقد أن NCBI يوفر أيضًا).

بعض الأشياء الأخرى التي يمكنك القيام بها:

  • اطلب من شركة التوليف التمهيدي توفير مجموعات التمهيدي بتنسيق 96well.

  • يعد تخليق الحمض النووي أيضًا خيارًا لائقًا (يتطلب ما يقرب من 0.5 دولار لكل زوج أساسي) ، ولكن قد يكون ذلك مكلفًا إذا كانت cDNAs لديك ضخمة.


كروموسومات الخنازير X و Y: التركيب والتسلسل والتطور

لقد أنشأنا تجميعًا محسّنًا وتعليقًا توضيحيًا جينيًا للخنزير X كروموسوم ، ومسودة أولية لتجميع كروموسوم الخنزير Y ، عن طريق تسلسل BAC و fosmid clones من حيوانات Duroc ودمج المعلومات من الخرائط البصرية و FISH الألياف. يحمل الكروموسوم X 1033 جينة مشروحة ، 690 منها ترميز بروتين. يتطابق ترتيب الجينات بشكل وثيق مع ذلك الموجود في الرئيسيات (بما في ذلك البشر) والحيوانات آكلة اللحوم (بما في ذلك القطط والكلاب) ، والذي يُستدل على أنه أسلاف. ومع ذلك ، فإن العديد من جينات ترميز البروتين الموجودة على كروموسوم X البشري كانت غائبة عن الخنازير ، وتم شرح 38 جينًا من الكروموسومات X الخاصة بالخنازير ، منها 22 من المستقبلات الشمية. يتألف تسلسل كروموسوم الخنزير الخاص بـ Y الذي تم إنشاؤه هنا من 30 ميغا قاعدة (ميغابايت). تم تجميع مجموعة فرعية بحجم 15 ميغا بايت من هذا التسلسل ، وكشفت عن مجموعتين من جينات عدد النسخ المنخفض الخاصة بالذكور ، مفصولة بمنطقة أمبليكونية بما في ذلك عائلة الجينات HSFY ، والتي تشكل معًا معظم الذراع القصيرة. تحتوي كلتا المجموعتين على متناظرات ذات هوية تسلسل عالية ، يُفترض أن يتم الحفاظ عليها عن طريق التحويل الجيني. يتم تمثيل العديد من الجينات المرتبطة بالأسلاف التي تم الإبلاغ عنها سابقًا في كروموسوم Y واحد على الأقل من الثدييات إما كجينات نشطة أو متواليات جزئية. لقد سمح لنا مشروع التسلسل هذا بتحديد الجينات - نسخة مفردة ومضخمة - على كروموسوم الخنزير Y ، لمقارنة كروموسومات الخنازير X و Y للتسلسل المتماثل ، وبالتالي الكشف عن الآليات الكامنة وراء تطور كروموسوم الخنازير X و Y.

© 2016 سكينر وآخرون. نشرته مطبعة كولد سبرينغ هاربور.

الأرقام

مقارنة X و Y الخريطة. كروموسومات X متسلسلة من تسعة ثدييات ، بالإضافة إلى المتاحة ...

تنظيم الخنزير ...

تنظيم الخنزير Y كروموسوم. جميع الجينات ذات النسخة المفردة المحددة للذكور هي ...

التنادد بين X و ...

تجانس بين X و Y. تم اكتشاف مخطط مناطق تماثل X-Y بين ...

الخنزير SRY منطقة. ال…

الخنزير SRY منطقة. تحتوي كتلة Yp القريبة من الجينات على نوعين متداخلين ...


تقطعت بهم السبل RNA-seq لعينات الثدييات

يمكن استخدام RNA-seq لفهم البيولوجيا المعقدة لتنظيم الجينات والمساعدة في فهم التعبير الجيني من مجموعة واسعة من أنواع العينات المختلفة. باستخدام مجموعات SMARTer Stranded RNA-seq ، يمكنك الوصول إلى بيانات تعبير جيني ذات قيمة في نصوص الترميز وغير المشفرة من مجموعة واسعة من العينات والمدخلات. تم دمج تقنية SMART في العديد من مجموعاتنا لأداء RNA-seq باستخدام نهج تحضير عشوائي. يمكن أن يساعد هذا النهج في تطوير فهم أفضل للبيولوجيا في عدد من التطبيقات المختلفة ، بما في ذلك:

  • استجواب متواليات غير معالجة بعديد الأدينيلات ، مثل RNA التنظيمي غير المشفر أو RNAs المتدهورة من FFPE أو البلازما
  • توفير معلومات عن الخيوط لقياس أكثر دقة للرنا من الجينات المتداخلة
  • إعطاء معلومات عن متغيرات لصق من جينات متفاوتة الطول

تحتاج إلى إنشاء مكتبة من تسلسل ترميز الثدييات - علم الأحياء

تستفيد البيولوجيا التركيبية من التوحيد القياسي. يعتمد تطوير المجال على طرق بسيطة ورخيصة وعالية الإنتاجية تعمل على تحسين دورة اختبار التصميم والبناء.

لقد مهد تطوير أساليب الاستنساخ عالية الإنتاجية الطريق لظهور العديد من مجموعات أدوات الاستنساخ ، مما يوفر ثروة من الأجزاء المعيارية التي يمكن تجميعها بسهولة ، وبالتالي تسريع هندسة الأجهزة الوراثية المعقدة.

على الرغم من عدم تمثيل مجموعات أدوات الاستنساخ للبيولوجيا التركيبية للثدييات مقارنة بنظيراتها من البكتيريا والخميرة ، إلا أن بعضها متاح الآن للمجتمع.

يعد إنشاء البرامج المشفرة بالحمض النووي أمرًا أساسيًا في البيولوجيا التركيبية ، وغالبًا ما تحدد الطريقة المختارة الوقت اللازم لتصميم وبناء بنيات للاختبار. هنا ، نقوم بوصف وتلخيص السمات الرئيسية لمجموعات الأدوات المتاحة لبناء الحمض النووي لخلايا الثدييات. نحن نقارن استراتيجيات الاستنساخ المختلفة بناءً على مدى تعقيدها والوقت اللازم لإنشاء تركيبات بأحجام مختلفة ، ونفكر في سبب سيطرة أدوات Golden Gate الآن بسبب تصميمها المعياري. نتطلع إلى التطورات المستقبلية ، بما في ذلك حزم الملحقات الخاصة بمجموعات أدوات الاستنساخ التي يمكن أن تسهل التحرير ، والتعامد ، والتنظيم المتقدم ، والاندماج في بناء الكروموسوم الاصطناعي.


كانت مجموعة الإنترونات ذاتية الربط هي الأمثلة الأولى على الحمض النووي الريبي التحفيزي

الحمض النووي في البروتوزوان رباعي الغشاء ثيرموفيلا يحتوي على إنترون متداخل في المنطقة يشفر جزيء ما قبل الرنا الريباسي الكبير. فشلت عمليات البحث الدقيقة في الكشف عن جين واحد قبل الرنا الريباسي بدون تسلسل إضافي ، مما يشير إلى أن التضفير مطلوب لإنتاج الرنا الريباسي الناضج في هذه الكائنات. أظهرت الدراسات اللاحقة أن الرنا الريباسي السابق قد تم تقطيعه في المواقع الصحيحة عندما تم تحضينه بنفسه ، دون مساعدة من أي بروتين ، قدم أول مؤشر على أن الحمض النووي الريبي يمكن أن يعمل كمحفز ، مثل الإنزيمات.

بعد اكتشاف التضفير الذاتي رباعية الغشاء قبل الرنا الريباسي ، تم العثور على مجموعة كاملة من متواليات التضفير الذاتي في ما قبل الرنا الريباسي من كائنات أخرى وحيدة الخلية ، في الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء قبل الرنا الريباسي ، في العديد من ما قبل الرنا المرسال من بعض بكتريا قولونية العاثيات ، وفي بعض النصوص الأولية للبكتيريا الحمض الريبي النووي النقال. تستخدم متواليات التضفير الذاتي في كل هذه السلائف ، والتي يشار إليها باسم إنترونات المجموعة الأولى ، الغوانوزين كعامل مساعد ويمكن أن تطوى عن طريق الاقتران الداخلي للقاعدة لتتواءم بشكل وثيق مع الإكسونات التي يجب ضمها. كما نوقش سابقًا ، تحتوي بعض الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء pre-mRNAs و tRNAs على نوع ثانٍ من intron ذاتية التضفير ، والمجموعة الثانية المعينة. كما هو موضح في الشكل 11-51 ، فإن آليات التضفير المستخدمة من قبل مجموعة إنترونات المجموعة الأولى ، وإنترونات المجموعة الثانية ، والالتصاق بشكل عام متشابهة ، وتتضمن اثنين استرة التفاعلات التي لا تتطلب مدخلات من الطاقة. من الواضح ، في إنترونات التضفير الذاتي ، يعمل الحمض النووي الريبي باعتباره ريبوزيم ، تسلسل الحمض النووي الريبي مع القدرة التحفيزية.

الشكل 11-51

آليات الربط في المجموعة الأولى والمجموعة الثانية من الإنترونات ذاتية التضفير والتضفير المحفز للوصلة من قبل الرنا المرسال. يظهر intron باللون الأزرق بحيث يتم ربط exons باللون الأحمر. في المجموعة الأولى introns ، عامل مساعد لغوانوزين (G) ليس جزءًا من سلسلة الحمض النووي الريبي (المزيد).

المجموعة الأولى intron داخل pre-rRNA لـ رباعية الغشاء وبعض الكائنات الحية الأخرى لا علاقة لها بتسلسلات المباعد المنسوخة التي تفصل مناطق 18S و 5.8S و 28S في غالبية الكائنات الحية (انظر الشكل 11-50 ب). على وجه الخصوص ، تختلف آلية التضفير الذاتي التي تزيل مجموعة الإنترونات من المجموعة الأولى عن آلية الانقسام التي يتم من خلالها إزالة متواليات المباعدة أثناء معالجة ما قبل الرنا الريباسي الذي تمت مناقشته في القسم السابق. الهيكل ثلاثي الأبعاد للمجموعة I intron من رباعية الغشاء تم حل ما قبل الرنا الريباسي. تجري تجارب طفرية وكيميائية حيوية لتحديد المخلفات التي تعتبر بالغة الأهمية في تحفيز تفاعلات الاسترة التبادلية المؤدية إلى التضفير.


شاسين

السؤال الرئيسي الذي يتم متابعته في مختبرنا هو كيف تتعرف آلية الربط الخلوي على الإكسونات التي يجب أن تنضم إليها أثناء نضج الرنا المرسال من النسخ الأولية الطويلة. الأشكال الثلاثة المتسلسلة التي ترتبط دائمًا تقريبًا بالإكسونات - موقع الفرع ، وموقع لصق المتقبل المنبع ، وموقع لصق المانحين المتلقين للمعلومات - توفر معلومات غير كافية للتعرف الجزيئي. exons "الزائفة" التي تحدها هذه العناصر تفوق عدد exons الحقيقي بترتيب من حيث الحجم على الأقل ومع ذلك يتم تجاهلها. نحن نحاول تقديم تعريف عالمي للعناصر المعلوماتية الإضافية التي تلعب أدوارًا في تحديد exons للربط التأسيسي والبديل والكشف عن طريقة عملها. هناك العديد من الطرق التي تشبه هذه المشكلة المعلوماتية تلك المتعلقة بأين ومتى يتم التعرف على مواقع بدء النسخ.

لقد استخدمنا طرقًا حسابية لاكتشاف بعض هذه المعلومات. باستخدام تقنيات التعلم الآلي ، وجدنا أن 50 nt intronic تمتد على جانبي exons ، إلى ما وراء تسلسل توافق موقع الانضغاطات نفسها ، تحتوي على معلومات ضرورية للربط الفعال لمعظم exons البشري (14 ، 12). المعلومات في هذه المرحلة هي في شكل 5 سنوات من التمثيل الزائد في هذه المناطق. نود الآن أن نعرف الطبيعة الدقيقة لعناصر الإشارة هذه (معززات الربط الداخلي ، أقطاب ISE) ، والخطوة (الخطوات) في التضفير الذي تعمل فيه ، والبروتينات التي تتوسط تأثيرها.

تكمن المعلومات الإضافية في أجسام exon في شكل معززات الربط الخارجي (ESEs) وكاتم الصوت للربط الخارجي (ESSs). باستخدام التحليل الإحصائي الجينومي ، قمنا بتجميع قوائم من 8 أمتار على أنها ESEs مفترضة (PESEs) و ESSs مفترضة (PESSs) في كل فئة وأظهرنا أن معظم الأشكال المتوقعة يمكن أن تعمل كما هو متوقع (13 ، 11 ، 8). يمكنك زيارة الأداة المساعدة PESX عبر الإنترنت للعثور على هذه الأجزاء الثمانية في التسلسل الخاص بك والاطلاع على المرجع 5 لأساليبنا الحسابية.

يوضح هذا العمل جنبًا إلى جنب مع النجاحات المماثلة للمختبرات الأخرى الآن أن exons وجوانبها مليئة بمجموعة كثيفة من العناصر التنظيمية. تكمن مهمتنا الآن في معرفة كيفية تكامل معلومات التسلسل الغني هذه لاتخاذ قرار ثنائي بالربط. لكن الكثافة العالية تجعل من الصعب إجراء تغييرات جينية فردية ، وتجعل التفسيرات غامضة. للتحايل على هذه المشكلة ، لجأنا إلى exons الاصطناعية التي نصممها لتحتوي على وحدات معززة معزولة وكاتم للصوت ووحدات محايدة (6). نأمل أن تكون القواعد التي تحكم الربط أكثر وضوحًا من خلال التلاعب المدبب لهذه "exons المصمم".

علم الجينوم المقارن هو أداة أخرى نستخدمها لفك تشفير معلومات الربط وعرض الضغوط التطورية التي تمارس على هذه التسلسلات. في سياق هذه التجارب ، اكتشفنا أن أحدث exons للثدييات التي تم إنشاؤها مؤخرًا تنبع إلى حد كبير من التسلسلات المتكررة ويتم تقطيعها بشكل غير فعال وغالبًا ما تكون مشفرة غير بروتينية (10). تسعى الجينومات جاهدة للحفاظ على كفاءة الربط في مواجهة الطفرة المستمرة (8).

يوفر التسلسل (العميق) عالي الإنتاجية وسائل لتحليل الطفرات عالية الإنتاجية. لقد طورنا طريقة (قياس المصفوفات المظهرية الشاملة من مصفوفات التسلسل ، أو "QUEPASA") للاختبار الشامل لجميع k-mers الممكنة لتأثيرات الربط الإيجابية والسلبية. تشير نتائج 6-mers exonic إلى تأثيرات سياق مهمة في كثير من الحالات.

يمكن الاطلاع على استعراضنا لعام 2005 الذي يتناول تعريف الزخارف التنظيمية للتضفير في المرجع 9.

تشمل جهودنا الحالية ما يلي:

أ) علم الأحياء الحسابي
تطوير الخوارزمية للتنبؤ بمواقع الوصلة بناءً على المعلومات المتاحة للخلية ، بما في ذلك التنبؤ بالهيكل الثانوي ، وذلك لتحديد جميع العناصر التي يجب مراعاتها من أجل فهم ميكانيكي للربط. .

ب) Exons مصمم
تعلم قواعد تفاعل ESE و ESS و ISE و ISS من خلال تصميم de novo للإكسونات الاصطناعية. تتكون هذه exons من ESEs و ESSs الموصوفة والتي تم تصميمها لتعمل بشكل فردي عند دمجها (أي لا تؤدي إلى ظهور تسلسلات متداخلة مربكة)

ج) تحليل الطفرات الإنتاجية العالية
لقد قمنا مؤخرًا بتطوير هذه الأداة لتنفيذ شاشات تشبع التسلسلات وتغييرات التسلسل التي تؤثر على الربط. نحن نستخدم هذه المنهجية لتحديد التفاعلات الاندماجية التي تحكم تعريف exon وتحديد تأثير السياق في قرارات الربط.

د) تأثير العمل على مستوى الحمض النووي على التضفير
نحن نتلاعب وراثيًا بـ 25 كيلو بايت من اختزال ثنائي هيدروفولات (ظفر) في خلايا الهامستر الصينية لدراسة تأثير بنية الكروماتين وعمل المحفز / المحسن على التضفير في السياق الكروموسومي الطبيعي للجين.

هـ) يكمن مجال الاهتمام الثاني في مجال التكنولوجيا الحيوية: نحن نعزل المشتقات المهندسة لخلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) القادرة على تضخيم الجينات السريع لتسريع تطوير العلاجات القائمة على البروتين المؤتلف ، وتطوير نواقل تزيد إنتاج البروتين المؤتلف من خلال معالجة أكثر كفاءة لما بعد النسخ للنصوص المؤتلفة.

سجل PESE لملف chuk exon البشري 8 (منحنى أسود) وتأثير الطفرات على درجة PESE (المنحنيات الحمراء أو المنحنيات الزرقاء) والربط (المستطيلات).


نقاش

إن أهم ما يميز أي تطور موجه واستراتيجية هندسة البروتين هو القدرة على إنشاء مكتبات بحجم كافٍ من الحيوانات المستنسخة المتغيرة. نظرًا لأننا نعتمد هنا على Cas9 لتقديم مكتبات مباشرة في جينوم خلايا الثدييات ، فقد كنا نهدف أولاً إلى تحسين مجموعة من المعلمات المرتبطة بـ HDR من خلال تطوير اختبار تجريبي يقارن النمط الجيني للجسم المضاد بالنمط الظاهري باستخدام خلايا PnP (الشكل 1 أ). سمح لنا ذلك بتقييم سلسلة من المعلمات التي حددنا من خلالها أن تعبير Cas9 التأسيسي داخل الخلية المضيفة لعب الدور الأكثر أهمية في تحسين كفاءة HDR (الشكل 1C). من المحتمل أن يكون هذا بسبب توفر ووفرة بروتين Cas9 المترجمة بالفعل داخل النواة في الوقت الذي أصبح فيه مانحون ssODN متاحين لإصلاح الحمض النووي. لقد حللنا أيضًا طول ذراع التماثل الأمثل ، والذي لم يتوافق بشكل غير متوقع مع أطول ssODN تم اختباره (200 nt) ، ولكن بالأحرى بطول ssODN متوسط ​​يبلغ 120 nt. لا يُعرف السبب الدقيق وراء حدوث مثل هذا الانخفاض في التكامل لمانحي ssODN الأطول ، ولكن يُفترض أن الوصول إلى ssODNs الأطول يكون أقل سهولة ، أو قد يتداخل مع بروتينات إصلاح الحمض النووي (38) ويمكن أيضًا أن يُعزى إلى انخفاض في تعداء العدوى نجاعة. لقد قررنا أيضًا أن التعديل الكيميائي للنهايات 5 ′ و 3 من ssODNs مع روابط PS أدى إلى ارتفاع HDR نظرًا لزيادة ثباتها ومقاومة نوكلياز (19). نظرًا لأن العديد من الدراسات أظهرت مؤخرًا أن تثبيط منظم مسار NHEJ 53BP1 يمكن أن يحسن HDR ، فقد قمنا أيضًا بإخراج 53BP1 ورأينا تحسنًا إضافيًا في HDR ، حيث وصل الحد الأقصى في هذه الدراسة إلى ∼36٪ (الشكل 1D). في المستقبل ، قد يكون من الممكن زيادة تحسين HDR من خلال دمج تقنيات إضافية مثل استخدام gRNAs المعدلة كيميائيًا (50) وقمع جزيئات NHEJ الأخرى (على سبيل المثال KU70 و DNA ligase IV) (51) ، أو عن طريق استغلال هندسيًا حديثًا المتغيرات من Cas9 أو نوكليازات أخرى قابلة للبرمجة (مثل Cpf1) (52 ، 53).

مع المعلمات المحسّنة لـ HDR ، قمنا بعد ذلك ببناء مكتبات HDM أولية تستهدف CDRH3 من خلال دمج الكودونات المتدهورة (NNK و NNB) الموجودة بين أذرع التماثل الخاصة بمانحي ssODN. بعد تحليل HDM و NGS ، تمكنا من توضيح أن a.a. كانت الترددات الموجودة في المكتبات الجينومية تقريبًا بالضبط ما كان يمكن توقعه بناءً على مخطط الكودون المنحل (الشكل 2 أ). هذا يعني أن تسلسلات ssODN التي لها تماثل إضافي من خلال التشابه مع CDRH3 الأصلي لم يتم دمجها بشكل انتقائي في الترددات الأعلى ، مما يشير إلى أن HDM غير متحيز. ومع ذلك ، كشف تحليل NGS أن إصلاح الفواصل المزدوجة التي تقطعت بها السبل عبر مسارات NHEJ / MMEJ حدث بطريقة غير عشوائية ، مما أدى إلى العديد من المتغيرات الوفيرة للغاية التي كانت موجودة بشكل غير متناسب في المكتبة (الشكل 2C). تم الإبلاغ عن ظاهرة تحيز إصلاح Cas9 سابقًا (46). في حين أن إمكانية استخدام آلية NHEJ المعرضة للخطأ لإدخال طفرات إضافية في مكتبتنا يمكن اعتبارها فائدة ، حيث تم استخدامها حتى لاكتشاف المتغيرات الجديدة لمسارات إشارات الخلية (54) وتشريح مناطق المحسن (55) في في سياق هندسة الأجسام المضادة ، فإن وجود متغيرات زائدة عن الحاجة سيكون له تأثير ضار على توزيع المكتبة والفرز (56). لذلك ، قمنا بتقليل ميل هذه الأحداث باستخدام تسلسل هدف gRNA `` Frameshift-stop '' ، حيث بعد انقسام Cas9 ، أحداث NHEJ / MMEJ التي من شأنها أن تؤدي عادةً إلى تسلسل الأجسام المضادة داخل الإطار بدلاً من ذلك ، مما أدى إلى تسلسل الأجسام المضادة مع أكواد الإيقاف المبكرة. (الشكل 2 ب و ج). أظهرت مكتبات HDM التي شُيدت باستخدام تسلسل gRNA ذي الإطار المتوقف (خلايا PnP-HEL23.FS) توزيعًا أكثر اتساقًا ، مما يقلل بشكل كبير من المتغيرات الممثلة بشكل زائد (الشكل 2 د). على الرغم من أن تحسين هدف gRNA ليس ضروريًا دائمًا ، كما تم عرضه عند إنشاء مكتبات DMS في CDRH1 و 2 ، فإننا نتوقع أن أي دراسات مستقبلية تهدف إلى هندسة الأجسام المضادة (أو البروتينات الأخرى) في خلايا الثدييات قد تستفيد أيضًا من التصميم الدقيق لتسلسلات الجرنا. للتأكد من أن الإصلاح المنحاز NHEJ / MMEJ لا يضر بتوزيع المكتبة.

حتى مع كفاءات HDM المحسّنة التي لوحظت هنا ، لا تزال مكتبات الخلايا الثديية لدينا (10 5) أصغر بكثير مقارنة بما يمكن تحقيقه بشكل روتيني في الملتهمة (& GT10 10) والخميرة (& GT10 7) (2). في حين أن التوسع باستخدام الأجهزة المتخصصة القادرة على التثقيب الكهربائي على نطاق واسع (& gt2.0 × 10 10 خلايا) يمكن أن يعوض جزئيًا عن هذا (الشكل التكميلي S3) ، فإن معدل النمو البطيء والإنتاجية المرتبطة بثقافة الخلايا الثديية تتطلب استراتيجية لتعظيم الجودة الوظيفية للمكتبات. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتصميم ssODNs من خلال الاختيار العقلاني لمخططات الكودون المنحلة لتقليد a.a. ترددات فضاء تنوع معين ، في هذه الحالة الذخيرة الساذجة للفئران. على الرغم من وجود مناهج أخرى لبناء التنوع الجيني والتي تلخص بشكل وثيق أ.أ. ترددات ذخيرة معينة (مثل تخليق قليل النوكليوتيد القائم على الفوسفوراميدات ثلاثي النوكليوتيد) (57-60) ، هذه الطرق باهظة الثمن وتتطلب تجميعًا جينيًا واستراتيجيات استنساخ متطورة. في المقابل ، يعتمد HDM على مخططات الكودون المتحللة القابلة للتركيب تجاريًا ولا يتطلب أي تجميع جيني أو استنساخ ، مما يمثل توفيرًا كبيرًا في الوقت والجهد والتكلفة لإنشاء المكتبة. علاوة على ذلك ، لقد أظهرنا أنه عند مقارنتها بمخططات الكودون المتدهور NNK و NNB القياسية ، كانت مخططات الكودون المختارة عقلانيًا لـ ssODNs قادرة على أن تشبه بشكل أوثق a.a. ترددات ذخيرة الماوس ساذجة (الشكل 3 أ و ب). لإنشاء مكتبة NRO ، استخدمنا أسلوبًا ضئيلًا للغاية من ssODN الكودون المنحل الفردي (لكل طول CDRH3) ولكن مع التقدم في التوليف واسع النطاق لمصفوفات oligonucleotide (61) ، يمكن تضمين مجموعات ssODN من التسلسلات المحددة المخصصة لإنشاء مكتبات HDM أكثر دقة.

بعد ذلك ، أنشأنا مكتبة أكبر ، تعتمد بشكل أساسي على زيادة عدد الخلايا المنقولة. بعد تحليل HDM و NGS ، حددنا أن هناك حدًا أدنى من 1.47 × 10 5 متغيرات (تسلسل CDRH3 a.a. فريد). نظرًا لحقيقة أن العينات تم تحضيرها لـ NGS من الحمض النووي الجيني بأعداد نسخ منخفضة لكل متغير ، فإننا نعتقد أن حجم المكتبة الذي تم إنشاؤه كان في الواقع في نطاق متغيرات 5 × 10 5 وفقًا لتعداد الخلايا الحية بعد ترنسفكأيشن وبيانات قياس التدفق الخلوي. أدى إخضاع المكتبة لاختيار المستضد بواسطة MACS و FACS إلى اكتشاف تسلسل CDRH3 جديد (HEL24) ، والذي كان له طول مختلف ومسافة تحرير كبيرة عن التسلسل الأصلي (HEL23). بينما كان فحص خلايا الثدييات لدينا ناجحًا في تحديد متغير CDRH3 جديد خاص بمستضد معين ، فإننا نفهم أن مثل هذا النهج في حد ذاته لا يتنافس مع مكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية الأكثر قوة التي يتم فحصها عن طريق عرض العاثيات والخميرة ، والتي غالبًا ما تستعيد لوحات من نسخ CDRH3 الفريدة (3 ، 43 ، 44 ، 62). هذا بالتأكيد بسبب انخفاض حجم المكتبة والتنوع في نظام الثدييات لدينا. على الرغم من أن التنوع وحجم المكتبة أكبر مما يتم ملاحظته بشكل شائع في المنصات القائمة على الثدييات ، فإننا لا نتصور أن نهجنا سيكون له تطبيق أساسي في اكتشاف استنساخ الأجسام المضادة الجديدة ، ولكننا نتوقع أن يكون التطبيق الرئيسي للهندسة وتحسين الأجسام المضادة ، بدءًا من مرشح رئيسي مناسب (والذي يمكن أن يكون من في الجسم الحي الاختيار أو فحص عرض الملتهمة والخميرة). تحقيقا لهذه الغاية ، أظهرنا أنه من خلال تجميع ssODNs مع الكودونات المتدهورة المبلطة على طول CDRH3 ، يمكن استخدام HDM في هندسة الأجسام المضادة HEL23 و HEL24 "المرشح الرئيسي" بسرعة من أجل تقارب أعلى (الشكل 4C و D الشكل التكميلي S8).

أحد أكثر تطبيقات HDM إثارة هو السهولة التي يمكننا بها تنفيذ DMS ، وهي تقنية جديدة في هندسة البروتين تكشف عن العلاقات بين التسلسل والوظيفة. يعتمد DMS على إنشاء مكتبات طفرات التشبع ، والتي تتطلب طفرات PCR أو الجينات الاصطناعية والاستنساخ في نواقل التعبير البلازميد ، وبالتالي تم إجراء معظم دراسات DMS في البكتيريا والعاثية والخميرة (24 ، 37 ، 63 ، 64). قام أحد الأمثلة السابقة بإجراء DMS على استنساخ جسم مضاد باستخدام تعداء البلازميد في خلايا الثدييات (65) ، ومع ذلك ، فإن الوجود العابر وتعدد النسيلة للبلازميدات يجعل هذا نهجًا صعبًا. في حالة HDM ، تمكنا من إنشاء مكتبات طفرات التشبع لـ DMS بنفس الطريقة التي فعلناها من أجل نضج التقارب ، ببساطة عن طريق تجميع ssODNs مع الكودونات المنحلة المفردة المربوطة على طول CDRH1 ، 2 ، 3. لأن أحجام المكتبة المطلوبة لـ مقياس DMS خطيًا مع عدد المواضع المستهدفة للتحقيق ، كان من السهل تحقيق أحجام المكتبة الإجمالية في خلايا الورم الهجين لدينا. علاوة على ذلك ، نظرًا لعدم الحاجة إلى الاستنساخ أو تعداء البلازميد ، يمكن بناء مكتبات DMS بسرعة وسهولة عن طريق HDM والتكامل الجيني الذي يضمن أحادية النسيلة الخلوية. كشف تحليل بيانات NGS التي تنتجها DMS عن بقايا حرجة وضارة لتعبير الجسم المضاد الوظيفي وخصوصية المستضد (الشكل 5). يمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد الكودونات المتدهورة بشكل عقلاني والتي تحاكي مشهد التسلسل الوظيفي ، والتي بدورها يمكن استخدامها لإنتاج مكتبات HDM اندماجية يمكن فحصها بحثًا عن الأجسام المضادة ذات الخصائص المحسنة (أي التقارب والنوعية وقابلية التطوير). أخيرًا ، بينما نركز في هذه الدراسة حصريًا على الأجسام المضادة ، يوفر HDM إمكانية التحقيق في مواقع المنظم الجينومي (مثل المروجين والمعززات) أو هندسة علاجات بيولوجية وخلوية أخرى قيّمة تعتمد على تعبير الثدييات ، مثل مستقبلات المستضدات الكيميرية ، T - مستقبلات الخلايا ومستقبلات السيتوكين ومجالات الإشارة داخل الخلايا (66-69).


مناقشة

كشفت تحليلاتنا المقارنة لأطالس AS التطورية عبر سبعة أنواع أن devAS قد تم الحفاظ عليه بشكل كبير أثناء التطور أكثر من AS غير الديناميكي الأكثر تكرارًا. تعرض DevAS أيضًا ميزات متعددة تشير إلى أنها غنية بشكل عام بأحداث AS الوظيفية ، كما هو مقترح سابقًا 16. ومع ذلك ، فإن مدى devAS وأنماط الاختيار تختلف باختلاف الأعضاء ، وفترات النمو ، وأنماط استخدام exon ، وأعمار exon وأنواع exons الكاسيت.

يوفر عملنا رؤية عالمية للأنماط التنموية لـ AS عبر أعضاء وأنواع الفقاريات. ومع ذلك ، فإن لها قيودًا مهمة واحدة في أن بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي للأنسجة الضخمة لا تسمح عمومًا بتقييم المساهمات النسبية لتغيرات التركيب الخلوي مقابل التغييرات في ترددات AS داخل أنواع الخلايا إلى مسارات التطور AS المرصودة - مع استثناءين. أولاً ، مع العلم أن microexons خاصة بالخلايا العصبية إلى حد كبير وتشارك في تكوين الخلايا العصبية 37،38 يسمح لنا أن نعزو ملاحظتنا أن microexons تتغير في الغالب في التطور المبكر (الشكل 5 د) إلى تغيرات تردد AS في الخلايا العصبية. ثانيًا ، حقيقة أن التركيب الخلوي للخصية يتغير بشكل أساسي عند النضج الجنسي 22،23 ، وملاحظتنا أن هذا الانتقال يتزامن مباشرة مع تحول جذري في أنماط AS (الشكلان 1 هـ و 3 أ ، والشكلان التكميليان 4 و 6) ، توفر ارتباطًا مباشرًا بين هاتين العمليتين. ومع ذلك ، فإن مثل هذه التحولات الأساسية في تكوين نوع الخلية لا تحدث في الأعضاء الأخرى. باستمرار ، تُظهر جميع الأعضاء الأخرى اختلافات سلسة وتدريجية لبرامج AS أثناء التطوير ، والتي من المحتمل أن تساهم فيها التغييرات في وفرة نوع الخلية وترددات AS داخل نفس أنواع الخلايا (الشكلان 1 هـ و 3 أ ، والشكلان التكميليان 4 و 6) . سيتطلب فصل المساهمات الدقيقة لتكوين الخلية مقابل تغييرات AS الجوهرية من نوع الخلية على أنماط AS التي لوحظت في دراستنا مجموعات بيانات نسخ خلية مفردة تسمح بالتقييم الكمي الموثوق لـ AS - وهو مسعى الآن في متناول اليد 49،50.


شكر وتقدير

يعتذر المؤلفون لزملائهم الذين لا يمكن الاستشهاد بعملهم بسبب ضيق المساحة. يشكرون إم إنيس وجي توريلا وتي فورد وجي تشين على التعليقات المفيدة على المخطوطة. تم دعم العمل في مختبر المؤلف من قبل: زمالة منظمة البيولوجيا الجزيئية الأوروبية وزمالة برنامج العلوم الحدودية البشرية إلى F.L. زمالة مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية إلى A.G. وتمويل من المعاهد الوطنية للصحة ووكالة مشاريع الأبحاث الدفاعية المتقدمة إلى P.A.S.


شاهد الفيديو: حجز الكتب مكتبة حراء (كانون الثاني 2023).