معلومة

ما الذي قد يتسبب في تعلق البروتينات في طبقة التراص الخاصة بهلام SDS-Page

ما الذي قد يتسبب في تعلق البروتينات في طبقة التراص الخاصة بهلام SDS-Page


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

عادة عندما تتجمع البروتينات ، فإنها ستعلق في الجزء العلوي من البئر. ومع ذلك ، نرى بعض البروتينات تتراكم في طبقة التكديس حتى عندما نتعامل مع حجم التحميل باستخدام DTT.

إحدى السمات المميزة لهذه التجربة هي أننا نحاول تنفيذ Cu (I) المحفز Azide-Alkyne Click rxn. بدون Cu (I) ، تعمل البروتينات بشكل طبيعي. ومع ذلك ، بعد Click rxn ، نرى بعضًا من منتجاتنا المتوقعة التي تم النقر عليها ، أحد بروتيناتنا يختفي في النطاق العلوي. الفرضية هي أن النحاس (I) يغير الانتقال أو أن الضرر التأكسدي من انتقال Cu (I) -> Cu (II) يغير البروتين.

بالعودة إلى السؤال الأصلي ، ما الذي قد يتسبب في توقف البروتين عند طبقة التراص مقابل الأمشاط؟

[عدل] وفقًا لزملائي في المختبر الذي كان يعاني من هذه المشكلة ، كان البروتين متشابكًا مع نفسه لتكوين بوليمرات كبيرة الحجم إلى حد ما. لقد رأينا أيضًا سلالم من البروتين بحجم تصاعدي. أدى تدوير التفاعل الذي تم النقر عليه إلى إزالة المشكلة ولكنه أدى أيضًا إلى فقد البروتين. يبدو أنه لم يكن يعالج بكمية كافية من DTT لتفتيت الخليط.

هذا للأسف لا يزال لا يفرق بين البروتينات العالقة في الأمشاط مقابل البروتينات العالقة في طبقة التكديس.


يبدو مثل النحاس المتقاطع الذي يربط البروتين أو يخلق مجاميعًا لا يستطيع المخزن المؤقت SDS تفكيكها. أضف EDTA إلى مخزن التحميل قبل طهيه؟


في واجهة هلام المكدس والهلام الحل هو تغيير في درجة الحموضة وتغير في كثافة الهلام. إذا كنت متأكدًا من أن البروتين الخاص بك لا يتشابك كثيرًا بحيث لا يمكن أن يدخل الهلام أكثر مما أفكر في الرقم الهيدروجيني للعينة وتأثير أيونات النحاس على تأثير التراص لجيل ستاتينجيك. هل عينتك ذات اللون الأزرق الطبيعي (إشارة إلى الرقم الهيدروجيني) عند تحميلها (مقارنة بالعينات الأخرى التي تقوم بتحميلها)؟ هل تفرط في زيادة الجل؟ لقد رأيت أن التحميل الزائد يتسبب في التأثير الذي تصفه لأن البروتينات تتركز بدرجة عالية جدًا قبل دخول الجل المحلول. هل يمكن أن تؤثر أيونات النحاس على التراص نفسه؟

اقرأ http://en.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE. على وجه التحديد القسم على أنظمة العازلة. قد ترغب في تجربة نظام مخزن مؤقت مختلف.

أخيرًا ، يمكنك تجربة ترسيب الأسيتون لمحاولة إزالة أيونات النحاس والمواد الكيميائية الأخرى ومعرفة ما إذا كان ذلك يساعدك.


الرحلان الكهربائي اليدوي ثنائي الأبعاد - (نوفمبر / 26/2013)

أقوم بإجراء فصل كهربائي ثنائي الأبعاد ولكن ليس باستخدام شريط IPG هذه المرة ولكن تشغيل PAGE بسيط قبل 2D ، يتم قطع الشريط من هلام PAGE ووضعه أفقيًا على هلام البعد الثاني.

عادةً ما تستخدم المقالات التي قرأتها عرض فاصل أصغر في البعد الثاني ، أي يتم تشغيل البعد الأول في لوحة مباعدة 1 مم والبعد الثاني في لوحة مباعدة 0.75 مم. لكنني أفعل ذلك بشكل معاكس ، أي أن جل البعد الأول الخاص بي يتم تشغيله في لوحة مباعدة 0.75 مم والبعد الثاني في لوحة مباعدة 1 مم. أفعل ذلك لأن شريط جل البعد الأول الخاص بي ينزلق بسهولة إلى أسفل لوحة المباعد 1 مم في البعد الثاني. أنا بلمرة هلام البعد الثاني أولاً ثم حرك شريط البعد الأول عليه.

لقد لاحظت الآن شيئًا مفاده أن المواد الهلامية لا تتواصل تمامًا مع بعضهما البعض على الرغم من أنني قمت بتراكب الجل والشريط بهلام التراص ثم 0.5 ٪ agarose. وأعتقد بسبب هذا أنني أحصل على الكثير من الخطوط الأفقية.

هل يمكن لأي شخص أن يرشدني فيما يتعلق بهذا. وإذا كان لديك أي مقطع فيديو لهذه الأساليب اليدوية ثنائية الأبعاد ، فيرجى مشاركتها معي

بدلاً من التراكب مع جل التكديس ، يجب إدخال شريط الجل من خلال هلام التراص غير المبلمر بعد لضمان عدم وجود فجوات.

إذا كنت تخشى أن تؤثر البلمرة على البروتينات الخاصة بك ، فيمكنك صب طبقة من هلام التراص (تراكب لضمان سطح مستوٍ) ، والسماح لها بالتبلمر ، ثم أدخل شريط الهلام ودفعه مقابل هلام التراص الأكثر ليونة لضمان التلامس الكامل .

هذه نتيجة لصفحة SDS ثنائية الأبعاد الخاصة بي ، يرجى اقتراح كيفية تحسين ذلك.

هذه نتيجة لصفحة SDS ثنائية الأبعاد الخاصة بي ، يرجى اقتراح كيفية تحسين ذلك.

لا أعرف ما الذي تحاول تحقيقه من خلال هذا. مع معيار 2-D gele ، يكون الفصل الأول بواسطة pI والثاني بالوزن الجزيئي. يبدو كما لو أن أسلوبك (في أحسن الأحوال) سينفصل عن طريق الوزن الجزيئي مرتين.

هل تقوم بتشغيل الصفحة الأصلية في البعد الأول (هذا ما كنت أفترضه)؟

يبدو أن لديك مجاميع في عينتك الأولية. إذا كان الأمر كذلك ، فإنها تذوب أثناء الجري ، مما يتسبب في تلطيخ يؤدي إلى نطاقات واسعة جدًا في البعد الثاني.

يجب عليك التأكد من اكتمال الذوبان قدر الإمكان ثم مسح العينة قبل التطبيق على البعد الأول.

نعم ، البعد الأول هو صفحة أصلية أقوم فيها بفصل المجمعات وفي البعد الثاني أقوم بحل تلك المجمعات. كيف يمكنني مسح عيّنتي قبل التحميل لأنني حاولت إذابة أكبر قدر ممكن من البروتينات

يمكنك توضيح عينتك بالطرد المركزي أو الترشيح. هذا يجب أن يزيل أي مواد غير منحلة أو الجسيمات.


بروتين لا ينتقل من خلال الجل - (يوليو / 15/2015)

أنا أدرس بروتينًا غشائيًا ، حوالي 40 كيلو دالتون ، لكنني غير قادر على اكتشاف غالبية البروتين بواسطة SDS-PAGE حيث يبدو أنه يظل عالقًا في الجزء العلوي من الجل.

لقد جربت lysates خلية كاملة (2x SDS + 5٪ 2-ME) ، عازلة تحلل NP-40 ، عازلة RIPA ومجموعة استخلاص بروتين غشاء مخصص ولكن معظم البروتين يرفض الهجرة عبر الهلام. أنا أفرط في التعبير عن البروتين عن طريق تعداء الجسم وقد جربت كل من طرق lipofectamine و Ca / P ولكن لا يبدو أن هذه هي السبب.

لقد جربت NuPage 10٪ Bis-Tris gel و Criterion TGX AnyKD gel. كلاهما يظهر نفس الشيء (المثال المرفق).

أميل إلى تشغيل المواد الهلامية بجهد منخفض (حوالي 100 فولت) لمدة 1-1.5 ساعة بشكل عام.

لم أحاول استخدام DTT حتى الآن.

أي أفكار ستكون موضع تقدير حقًا.

كيف تحضر عيناتك؟

هل تستخدم أي عامل اختزال في المخزن المؤقت لعينتك؟

1m خلية (هذه خلايا HEK293T) في 6 لوحات جيدة. اغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني بارد. كشط في برنامج تلفزيوني بارد 1 مل في إيبندورفس. تدور مرتين وإزالة كل برنامج تلفزيوني. أضف 50uL 2x SDS حل تحميل هلام (بيولوجيا الجودة) يحتوي على 5٪ 2-ME. دوامة. يغلي 95-99 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إذا كان لا يزال gloopy الماصة لأعلى ولأسفل أو دوامة أكثر. قم أحيانًا بتخزينه طوال الليل في درجة حرارة -80 درجة مئوية وقم بتشغيل الجل في اليوم التالي. التحميل المعتاد من 15 إلى 20 ميكرولتر لكل بئر اعتمادًا على مدى سماكة العينة. إذا كان سميكًا جدًا ، أضف المزيد من SDS 2x مع 5٪ 2-ME لتخفيفه.

يمكنك تجربة الحضانة على درجة حرارة 60-70 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة بدلاً من 95-90 درجة مئوية. يجب أن يقضي على إمكانية تراكم البروتينات.

يجب عليك التأكد من أن التركيز النهائي لعينة المخزن المؤقت هو 1X (واستخدام 1X للتخفيف). يجب أن يحتوي المخزن المؤقت على الجلسرين وسيظهر "سميكًا" إذا لم يتم تخفيفه بشكل صحيح.

لا تعتبر "كثيفة" محددًا جيدًا لتركيز البروتين ، خاصة إذا كنت تريد مطابقة التحميل بين الآبار.

dtt و 2-me في نفس الحل زائدة عن الحاجة.

إذا قمت بتخزين العينات في أي درجة حرارة أقل من درجة حرارة الغرفة ، فيجب عليك إعادة احتضانها للتأكد من أن جميع بلورات sds قد تم حلها وأن أي تكتلات تكونت قد تم تفتيتها.

هل أنت متأكد من أن جل 10٪ يغطي نطاق حجم الاهتمام. ربما يمكنك إجراء بعض التدريبات التمهيدية باستخدام هلام متدرج. يمكن أن يمنحك هذا التعامل مع أحجام البروتينات التي يبدو أنها لا تنتقل بشكل جيد.

شكرا لجميع اقتراحاتكم. أعتذر عن التأخير في الرد - كنت أجرب اقتراحاتك.

حاولت تسخين العينات عند 70 درجة مئوية و 60 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.

لقد استخدمت أيضًا عينة واحدة من المخزن المؤقت في المرتين ، مع 5٪ 2-ME فقط.

قمت بتشغيل مجموعتي العينات على هلام متدرج (المكدس 4 ٪ على ما يبدو).

كما ترى في الشكل المرفق ، فإن هذه الإجراءات لم تحقق أي تحسن. تقريبا كل البروتين لا يزال عالقا في الجزء العلوي من الغشاء. في الواقع ، يوجد الآن القليل جدًا من البروتين على الغشاء.

هل لديك أي اقتراحات أخرى؟

تشتهر بروتينات الغشاء بصعوبة العمل معها. يجب عليك تعطيل الغشاء باستخدام ripa ثم إجراء تبادل عازل لإزالة الفاعل بالسطح غير الأيوني (يزيح sds من البروتين).

أضف المخزن المؤقت لعينة sds مع 2-me واحتضانها عند 60-70 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (لأنها عينة صعبة).

إذا كان البروتين لا يزال في الجزء العلوي من الجل ، فمن المحتمل أنه بروتين سكري أو بروتين دهني. هذه التعديلات اللاحقة للترجمة يمكن أن تزيد من الكتلة الظاهرة بشكل كبير. كما أنها ستجعل العصابات "مشوشة".

يمكنك صبغ الغشاء (أو الجل) لتأكيد البروتينات السكرية.

شكرا. أخذت lysates من الأمس (تم تحضيره باستخدام Ripa) وحاولت التسخين إلى 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مقابل 99 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. من الواضح أنه كان هناك المزيد من البروتين على الغشاء بالحجم الذي كنت أتوقعه ، مقارنةً بالبروتين العالق في الأعلى ، عند التسخين إلى 65 درجة مئوية فقط. لكن الغالبية كانت لا تزال عالقة في القمة (& gt95 ٪ من البروتين الذي أقدره).

ماذا عن تحضير المحللات باستخدام محلول ملح قوي وليس SDS بدلاً من ذلك؟ لذا ، فإن الليز في كلوريد الصوديوم ، HEPES ، NaF ، EDTA ، NP-40 ومثبطات الأنزيم البروتيني ، يأخذ المادة الطافية ، ويعجل البروتين باستخدام الأسيتون ويذوب طوال الليل في 1x SDS الذي يحتوي على DTT ، ثم يسخن عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل التحميل على الجل ؟ هل تعتقد أن هذا سيعمل (ويتجنب التبادل المؤقت)؟

هطول الأمطار وإعادة التعليق هو تبادل عازلة.

قد يعمل ، لا ضرر في المحاولة.

ولكن ، إذا تم تعديل البروتين بعد الترجمة (العديد من بروتينات الغشاء) ، فلا ينبغي أن يحدث فرقًا.

سأحاول وأعود إليك.

قد تفكر أيضًا في عزل جزء الغشاء عن طريق التحلل في محلول منخفض التوتر (تركيز منخفض للذوبان في المخزن المؤقت عن الخلايا). & # 160 استخدم التعطيل الميكانيكي الخفيف (حقنة) ثم استخدم عملية الطرد المركزي المناسبة لعزل جزء الغشاء الذي تريده. & # 160 أخيرًا ، حاول إذابة البروتين الخاص بك من حبيبات الغشاء باستخدام مجموعة من المنظفات / التركيزات.


تساعد في تحسين لطخة غربية لـ 6kd بروتين - مشكلة نقل اللطخة الغربية (مارس / 10/2008)

أهلا
أقوم حاليًا باستخدام صفحة SDS بنسبة 15٪ للجليسين لتشغيل نسخة غربية .. كل شيء على ما يرام حتى أقوم بنقل البروتين إلى البقعة. بعد فترة الحضانة بين عشية وضحاها ، لا أرى البروتين الذي يهمني ولكني أرى جميع النطاقات العلوية .. المخزن المؤقت للترانسر الخاص بي هو tris و glycine و 20 methanol وأنا أنقله لمدة ساعتين عند 100 فولت. كانت تعمل بشكل جيد ، لكنها لا تعمل الآن

اليوم أقوم بتشغيل الجل مرة أخرى وعلق البروتين على الجزء العلوي من الجل حتى من خلال الغليان عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
الرجاء المساعدة

يمكنك محاولة استخدام هلام متدرج ، ربما يساعد 4-16 أو 10-20٪ في إظهار البروتين بشكل أفضل.

100V تبدو عالية جدًا بالنسبة لعملية النقل. عادةً ما أقوم بنقل 15٪ من المواد الهلامية الصغيرة بتيار ثابت - 250 مللي أمبير لمدة 45 دقيقة.

أعتقد أن هذا هو حساب عدد الأمبيرات التي يجب استخدامها للنقل.
Amp = مساحة سطح الغشاء (سم 2) X2

أوافق على أن 100 فولت لنقل الأصوات مثل الكثير. أطبق 25-30 فولت لمدة ساعتين ولم أواجه مشكلة. أنا أعمل أيضًا مع بروتين صغير (10.5 كيلو دالتون) وقد استخدمت مواد هلامية متجانسة بنسبة 10 ٪ ومتدرجة بنسبة 10-20 ٪ ، لكنني أعترف أنه لم يحدث فرقًا كبيرًا & # 33 آمل أن يسير كل شيء بشكل أفضل بالنسبة لك & # 33

مرحبًا ، كنت أتساءل ما هو نوع الجل الذي تستخدمه باستخدام tris-tricine أو tris glycine وما هي النسبة المئوية؟ كنت أنصح باستخدام 13.5 جل وهل سأستمر في التحويل في نفس الوقت؟

أهلا. أنا أيضا أقوم بعمل غربي على بروتين صغير (حوالي 12 كيلو دالتون). لقد كنت أقوم بعمل 12-16٪ من المواد الهلامية tris-tricine ، مع أغشية PVDF ، ونقل 20٪ MeOH / glycine (مبلل لمدة 45 دقيقة عند 100 فولت). لقد حصلت على نتائج أفضل إلى حد ما من السابق. سأحاول أيضًا تجربة مخزن مؤقت لنقل CAPS لمعرفة ما إذا كان بإمكاني الحصول على نقل أفضل. سأعلمك بالنتائج.

أنا أيضًا أقوم بانتظام بعمل بقع غربية لبروتين 12 كيلو دالتون ، ولم أواجه أي مشكلة من قبل. أنا أصنع 12 ٪ من المواد الهلامية من التريسين (على الرغم من أنني متأكد من أنه يمكنك الذهاب أعلى قليلاً من هذا مقابل 6 كيلو دالتون).

هنا هو مخزن النقل المؤقت الخاص بي للنشاف الغربي:
39 ملي جلايسين ، 48 م تريس ، 0.037٪ (وزن / حجم) SDS ، 20٪ (حجم / حجم) ميثانول ، pH8.3 مع حمض الهيدروكلوريك.

للحصول على جل صغير بسماكة قياسية (0.75 مم) ، قمت بصبغه لمدة 18 دقيقة عند 13 فولت على بيوراد شبه جاف.

المواد الهلامية والغربية هي دائمًا مثالية & # 33

على الرغم من أنه يبدو أيضًا أنك لا تقوم بتشغيل المواد الهلامية بشكل صحيح ، حيث يتعطل البروتين. ما هي وصفاتك وظروف التشغيل؟

أنا عادة أحمل حوالي 40ug / ممر وأضف عينة عازلة (b-merc) التي تم تخزينها في -20 درجة مئوية ، ثم أخلطها بالدوامة وأغلي العينة
لمدة 5 دقائق وتحميلها في الآبار. وصفة لتشغيل العازلة

30 جرام من قاعدة تريس
144.0 جرام من الجلايسين
أضف 10 جرام من SDS
مخفف إلى 1 لتر من الماء المقطر - أنا فقط استخدم IX ، وعادة ما لا أعدل الرقم الهيدروجيني. تركته يعمل لمدة 50 فولت حتى يمر بجيل التراص و 100 فولت حتى 3/4 من الجل لأن البروتين الخاص بي صغير ولا أريد أن أفقده ، لذلك لا أترك الصبغة تنفد. أقوم بنقل (رطب) لـ 100 فولت لـ Ihr في الغرفة الباردة أضف التالي إلى 800 مل ماء
36.35 جرام تريس
150 جم جلايسين
4g SDS
ف. إلى 1000 مل مع H2O المقطر ، أستخدم Ix من هذا و 200 مل من الميثانول.

أعلم أنه من الصعب جدًا صنع مواد هلامية من التريسين في مختبري لأننا لا نملك جهاز طرد الغاز ، ولهذا السبب أستخدم تريس ، جل الجلايسين ، ونقوم بعمليات النقل الرطبة ، فهل لا يزال بإمكاني استخدام نفس المخزن المؤقت والوقت الذي اقترحته؟
- أتساءل عما إذا كان بإمكانك صب المواد الهلامية على شكل جل جليكاين .. هل يمكنك ذلك؟ اسمحوا لي أن أعرف من فضلك


نتائج

بعد استخلاص بروتين الظفر وكروماتوجرافيا تقارب البورونات ، تمت مقارنة أنماط البروتين لكسور الظفر الغليكوزية والغير متراكمة. باستخدام SDS PAGE أحادي البعد ، تم تحديد أربعة نطاقات رئيسية بين جزء الظفر غير المتراكم. في جزء الظفر الجلوكوز ، لوحظ وجود شريطين فقط. يوضح الشكل 1 مخطط التفريغ الكهربي النموذجي. على غرار كسور البروتين السكري الأخرى (مثل HbA1c) ، يمثل جزء بروتين الأظافر الجلوكوز جزءًا صغيرًا فقط من إجمالي مستخلص بروتين الظفر المستخلص من كروماتوغرافيا تقارب البورونات: على سبيل المثال تم العثور على 5.1 ٪ من الكمية الإجمالية لبروتينات الظفر في حالة سكر في مريض مصاب بداء السكري من النوع 2.

كما أوضحنا بالفعل في عملنا السابق ، فإن تركيز بروتينات الظفر السكري أعلى بشكل ملحوظ في مرضى السكري من النوع مقارنة بمرضى السكري [1]. ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، أظهرنا أنه بعد القطع الدقيق لقصاصات الأظافر إلى طبقات سطحية وعميقة (ن = 12) ، تم العثور على تركيز أقل بكثير من الفركتوزامين في الطبقة السطحية من الظفر (يعني: 2.16 & # x000b1 1.37 & # x003bcmol / g nails) بالمقارنة مع الطبقة العميقة من الظفر (يعني: 4.36 & # x000b1 2.55 & # x003bcmol / g nails) (P & # x0003c0.05) (الشكل 2). علاوة على ذلك ، أظهر قياس بروتينات عدسة العين السكرية وجود فرق كبير بين مرضى السكري من النوع 2 (العدد = 63 ، المتوسط: 3.80 & # x000b1 1.57 & # x003bcmol / g عدسة العين) وغير المصابين بمرض السكري (n = 153 ، يعني: 3.35 & # x000b1 1.34 & # x003bcmol / g عدسة عين) (P & # x0003c0.05). في مجموعة فرعية من 51 مريضًا بإعتام عدسة العين ، تم تحديد تركيز بروتينات الظفر السكري وبروتينات عدسة العين. تم العثور على ارتباط ملحوظ بين بروتينات الظفر السكرية وبروتينات عدسة العين السكرية [y (بروتينات الظفر الجلايكيدية) = 0.39 + 0.99 × (بروتينات عدسة العين السكرية) r 2 = 0.58، P & # x0003c0.001] (الشكل 3). كان هذا الارتباط أقوى في مرضى السكري من النوع 2 [n = 35، y (بروتينات الظفر السكري) = 0.26 + 1.12 x (بروتينات عدسات العين السكرية) ، r 2 = 0.71 ، P & # x0003c0.001] منه في غير السكري [n = 16، y (بروتينات الظفر الغليكوزية) = 0.19 + 0.83 x (بروتينات عدسة العين السكرية)، r 2 = 0.56، P = 0.001] (الشكل 4). باستخدام تحليل الانحدار المتعدد (الجدول 1) ، وجد أن تركيز بروتينات الظفر السكرية هو مؤشر لتركيز بروتينات العدسة السكرية ومستوى HbA1c. لم يصل العمر والجنس إلى أهمية في هذا النموذج.


محتويات

يشكل بياض البيض حوالي ثلثي بيضة الدجاج بالوزن. تشكل المياه حوالي 90 ٪ من هذا ، مع البروتين والمعادن النادرة والمواد الدهنية والفيتامينات والجلوكوز التي تساهم في النسبة المتبقية. [3] تحتوي البيضة الأمريكية الكبيرة النيئة على حوالي 33 جرامًا من بياض البيض مع 3.6 جرام من البروتين و 0.24 جرام من الكربوهيدرات و 55 ملليجرام من الصوديوم. لا يحتوي على الكوليسترول ومحتوى الطاقة حوالي 17 سعرة حرارية. [3] بياض البيض عبارة عن محلول قلوي ويحتوي على حوالي 148 بروتينًا. [4] يسرد الجدول أدناه البروتينات الرئيسية في بياض البيض بالنسبة المئوية ووظائفها الطبيعية. [3] [5]

بروتين وفرة
البيضاوي 54%
أوفوترانسفيرين 12%
مخاطي البيض 11%
أوفوغلوبولين G2 4%
أوفوغلوبولين G3 4%
أوفوموسين 3.5%
ليسوزيم 3.4%
Ovoinhibitor 1.5%
بروتين Ovoglycoprotein 1%
فلافوبروتين 0.8%
أووماكروغلوبولين 0.5%
افيدين 0.05%
سيستاتين 0.05%

البيض هو البروتين الأكثر وفرة في الزلال. يصنف على أنه بروتين فوسفوجليكوبروتين ، أثناء التخزين ، يتحول إلى s-ovalbumin (5 ٪ في وقت وضعه) ويمكن أن يصل إلى 80 ٪ بعد ستة أشهر من التخزين البارد. البيضاوي في المحلول مقاوم للحرارة. تبلغ درجة حرارة التمسخ حوالي 84 درجة مئوية ، ولكن يمكن تغيير طبيعتها بسهولة عن طريق الضغوط الجسدية. Conalbumin / ovotransferrin هو بروتين سكري لديه القدرة على ربط الكاتيونات المعدنية ثنائية وثلاثية التكافؤ في مركب وهو أكثر حساسية للحرارة من الألبومين البيضاوي. عند درجة الحموضة الكهربية المتساوية (6.5) ، يمكن أن تربط كاتيونات وتتخذ لونًا أحمر أو أصفر. هذه المجمعات المعدنية أكثر استقرارًا من حيث الحرارة من الحالة الأصلية. البيض المخاطي هو المادة المسببة للحساسية الرئيسية من بياض البيض وهو بروتين سكري مقاوم للحرارة وجد أنه مثبط للتربسين. الليزوزيم هو بروتين هولوبروتين يمكنه أن يفسد جدار بعض البكتيريا موجبة الجرام ويوجد بمستويات عالية في الطبقة الكلزية والقصيدة التي تثبت الصفار باتجاه منتصف البيضة. Ovomucin هو بروتين سكري قد يساهم في بنية تشبه الهلام من الزلال السميك. كمية البويضة في الزلال السميك أكبر بأربع مرات من الكمية الموجودة في الزلال الرقيق.

يمكن أن يؤدي الضغط الجسدي الناتج عن خفق بياض البيض إلى تكوين رغوة. يحدث نوعان من الإجهاد البدني عن طريق الضرب بالمضرب.

يحدث الأول عندما تسحب الخفاقة السائل من خلال نفسها ، مما يخلق قوة تفتح جزيئات البروتين. هذه العملية تسمى تمسخ.

يأتي الضغط الثاني من اختلاط الهواء بالبيض ، مما يؤدي إلى خروج البروتينات من حالتها الطبيعية. تتجمع هذه البروتينات المشوهة معًا حيث يلتقي الهواء والماء وتشكل روابط متعددة مع البروتينات الأخرى غير المفككة ، وبالتالي تصبح رغوة ، تحافظ على الهواء المدمج في مكانه ، لأن البروتينات تتكون من أحماض أمينية بعضها محبة للماء (تنجذب إلى الماء) و بعضها كاره للماء (يصده الماء). هذه العملية تسمى التخثر. [63]

عند خفق بياض البيض ، يتم تصنيفها على ثلاث مراحل وفقًا للقمم التي تتكون عند رفع الخافق: قمم ناعمة وثابتة وصلبة. يأخذ البيض المفرط النضج مظهرًا جافًا وينهار في النهاية. لا يضرب بياض البيض بشكل صحيح إذا تعرض لأي شكل من أشكال الدهون ، مثل زيوت الطهي أو الدهون الموجودة في صفار البيض.

تستخدم الأواني النحاسية في فرنسا منذ القرن الثامن عشر لتثبيت رغوة البيض. يساعد النحاس الموجود في الوعاء في تكوين رابطة أقوى في عناصر الكبريت التفاعلية مثل بياض البيض. تكون الرابطة التي تم إنشاؤها شديدة الإحكام بحيث يتم منع الكبريتات من التفاعل مع أي مادة أخرى. الوعاء المطلي بالفضة له نفس نتيجة الوعاء النحاسي ، وكذلك رشة من مسحوق النحاس المكمل من متجر صحي يستخدم في وعاء زجاجي. تشمل عيوب الوعاء النحاسي تكلفة الوعاء نفسه ، وصعوبة الحفاظ على نظافة الأوعية. تلوث النحاس من الوعاء ضئيل للغاية ، حيث يحتوي كوب من الرغوة على عُشر مستوى الاستهلاك اليومي العادي للإنسان. [3] [7]

على الرغم من أن بياض البيض يعتبر مصدرًا للتغذية منخفضة الدهون وعالية البروتين ، إلا أن عددًا قليلاً من الناس لا يستطيعون تناوله. تعتبر حساسية البيض أكثر شيوعًا بين الأطفال أكثر من البالغين ، ويتخلص منها معظم الأطفال في سن الخامسة. [8] ردود الفعل التحسسية ضد بياض البيض أكثر شيوعًا من ردود الفعل ضد صفار البيض. [9] بالإضافة إلى ردود الفعل التحسسية الحقيقية ، يعاني بعض الأشخاص من عدم تحمل الطعام تجاه بياض البيض. [9]

البيض عرضة للإصابة السالمونيلا تلوث اشعاعى. يزيل الطهي الشامل الخطر المباشر (أي بياض البيض المطبوخ الصلب وغير السائل) ، لكن خطر التلوث المتبادل لا يزال قائمًا إذا تعامل الناس مع البيض الملوث ثم لمسوا الأطعمة أو العناصر الأخرى في المطبخ ، وبالتالي نشر البكتيريا. في أغسطس 2010 ، أمرت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية بسحب 380 مليون بيضة لأن ذلك ممكن السالمونيلا تلوث اشعاعى. [10]

البيض المطبوخ مصدر جيد للبيوتين. ومع ذلك ، فإن الاستهلاك اليومي لبياض البيض الخام لعدة أشهر قد يؤدي إلى نقص البيوتين ، بسبب محتواه من الأفيدين ، حيث أن الأفيدين يربط البيوتين بإحكام ويمنع امتصاصه. [11]

بياض البيض هو عامل تغريم يمكن استخدامه في تصفية النبيذ وتثبيته. يمكن أيضًا إضافة بياض البيض إلى الكوكتيلات المهزوزة لعمل رغوة رقيقة. تستخدم بعض مساحيق البروتين أيضًا بياض البيض كمصدر أساسي للبروتين.

تم استخدام الزلال من بياض البيض كعامل ربط في التصوير الفوتوغرافي المبكر خلال الفترة 1855-90 ، وكانت هذه المطبوعات تسمى المطبوعات الزلالية.

في خمسينيات القرن الثامن عشر ، كان يُعتقد أن بياض البيض يمنع التورم ، وقد استخدم لهذا الغرض. للمساعدة في تهدئة مناطق الجلد المصابة ، يمكن أن يساعد بياض البيض الممزوج بالقطب الأرمني في استعادة الألياف. يستخدم بياض البيض أيضًا في تجليد الكتب أثناء عملية التذهيب ، حيث يشار إليه باسم "glaire" ، ولإضفاء لمعان على غلاف الكتاب. [12]


اللطخة الغربية والتحويل الكهربائي

يسمى نقل أو "النشاف" للبروتينات المنفصلة بالرحلان الكهربي من مصفوفة الهلام إلى غشاء (عادةً النيتروسليلوز أو PVDF) متبوعًا باكتشاف لاحق قائم على الأجسام المضادة على سطح الغشاء يسمى Western Blot أو Immunoblot. يوفر Creative Proteomics تحليل النشاف الغربي للكشف عن بروتين مستهدف محدد من خليط بروتين معقد ، على سبيل المثال. ز. تجانس الأنسجة أو مستخلص الخلية ، باستخدام تفاعلات مستضد - مستضد انتقائية وحساسة للغاية. تسمح البيانات الناتجة بالتحليل النوعي وشبه الكمي للبروتين محل الاهتمام.

لطخة ويسترن هي تقنية تحليلية مستخدمة على نطاق واسع للكشف عن بروتينات معينة في عينة من النسيج المتجانس أو المستخلص. يستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الأصلية عن طريق هيكل ثلاثي الأبعاد ، أو البروتينات المشوهة بطول البولي ببتيد. يتم بعد ذلك نقل البروتينات المنفصلة إلى غشاء (عادة النيتروسليلوز أو PVDF) ، حيث يتم تلطيخها بأجسام مضادة خاصة بالبروتين المستهدف. يستخدم Western Blot على نطاق واسع في مجالات البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية وعلم الوراثة المناعي وتخصصات البيولوجيا الجزيئية الأخرى. النشاف هو نقل الجزيئات الكبيرة على أغشية منع الحركة للكشف الدقيق والحساس.

في تحليل اللطخة الغربية ، يتم فصل بروتينات العينة أولاً في الفصل الكهربائي للهلام عن طريق نقطة متساوية الكهربية (pI) ، أو الوزن الجزيئي ، أو الشحنة الكهربائية ، أو مزيج من هذه العوامل باستخدام طرق مختلفة مثل SDS-PAGE و IEF. عادةً ما يتم استخدام SDS-PAGE للفصل ، لأن جميع البروتينات مذابة وتهاجر في نفس الاتجاه ، ويمكن الوصول إلى الحلقات بسهولة بسبب تأثير تغيير طبيعة SDS.

بعد تحليل الرحلان الكهربي للهلام ، يتم نقل البروتينات من داخل الهلام إلى غشاء مصنوع من النيتروسليلوز أو بولي فينيل ديفلورايد (PVDF) لجعلها متاحة لاكتشاف الأجسام المضادة. تتمتع أغشية PVDF بقدرة ربط أعلى للبروتينات من النيتروسليلوز ، لكن النيتروسليلوز يربط البروتينات الصغيرة بشكل أفضل. الطريقة الأساسية لنقل البروتينات تسمى بالتلوين الكهربائي والتي تستخدم تيارًا كهربائيًا لسحب البروتينات من الجل إلى غشاء PVDF أو النيتروسليلوز. هناك عدة طرق لإجراء النقل الكهربي: التنشيف بالخزان والنشاف شبه الجاف والنشاف شبه الرطب. يشترك الثلاثة جميعًا في أن الهلام والغشاء يشكلان شطيرة مع كومة من أوراق الترشيح على كلا الجانبين. وتجدر الإشارة إلى أنه إذا تم استخدام التركيز المتساوي الكهربي لفصل البروتينات ، فسيكون نقل البروتينات عن طريق الانتشار مع تنشيف الضغط أكثر كفاءة. أثناء عملية التجلط الكهربائي ، تنتقل البروتينات من داخل الهلام إلى الغشاء مع الحفاظ على التنظيم الموجود داخل الهلام.

بعد عملية النشاف ، والتي يمكن أن تستغرق حوالي ساعة (نشاف شبه جاف) إلى طوال الليل (تنشيف الخزان) ، يتم تعريض البروتينات على طبقة سطحية رقيقة لاكتشاف الأجسام المضادة. إلى جانب ذلك ، يتم حظر مواقع الارتباط الحر للغشاء بخليط بروتين ، والذي لن يتداخل مع الفحص اللاحق مع الجسم المضاد. يتم اكتشاف البروتينات أولاً بواسطة الجسم المضاد الأولي ، ثم يتم اكتشافها باستخدام جسم مضاد ثانوي ، والذي يتعرف على هذا الجسم المضاد الأولي المحدد. يتم اقتران الجسم المضاد الثانوي بمجموعة من الجزيئات المحددة ، والتي يمكن اكتشافها بسهولة من خلال إجراء تطوير لاحق بحساسية عالية.

أكثر طرق الكشف حساسية هي استخدام التلألؤ الكيميائي المعزز (ECL): يتعرف الجسم المضاد - الفجل المتقارن على الجسم المضاد الأولي ، حيث يقترن تفاعل الركيزة بتفاعل ثانوي يسبب انبعاث ضوء كيميائي لفترة زمنية معينة. تتراكم هذه الإشارة الضوئية عن طريق تعريض الغشاء على فيلم أشعة إكس ، أو بوضعه في خزانة مظلمة تمامًا حيث يتم تسجيل الإشارة بكاميرا CCD حساسة. باستخدام متغير خاص من ECL ، يمكن اكتشاف ما يصل إلى 1 بيكوغرام من شريط البروتين.

يمكن استخدام النشاف الغربي لمتابعة فسفرة البروتين. سيُظهر الجسم المضاد الذي يرتبط بجميع الأشكال الإسوية لبروتين متعدد الفوسفور مظهرًا "خرزًا على سلسلة" على هلام ثنائي الأبعاد. كما أن النشاف الغربي مفيد أيضًا في تحديد البروتينات المعروفة وغير المعروفة في المجمعات التي تم إسقاطها بواسطة الترسيب المناعي: بمجرد وضع البروتينات المهمة على لطخة غربية ، يمكن قطع البقع المقابلة من هلام Coomassie المكرر المصبوغ باللون الأزرق وتحديده بواسطة MS.

يرجى تقديم وصف مفصل لمشروعك. سنزودك بخطة مشروع مخصصة لتلبية طلبات البحث الخاصة بك. يمكنك أيضًا إرسال رسائل بريد إلكتروني مباشرة إلى للاستفسارات.


مراجع

Debiton C و Merlino M و Chambon C و Bancel E و Decourteix M و Planchot V و Branlard G: تحليلات الألبومين والجلوبيولين والبروتينات البرمائية عن طريق النهج البروتيني تعطي رؤى جديدة حول استقلاب نشا القمح الشمعي. ي علوم الحبوب. 2011 ، 53 (2): 160-169. 10.1016 / j.jcs.2010.11.001.

Jerkovic A و Kriegel AM و Bradner JR و Atwell BJ و Roberts TH و Willows RD: يحمي التوزيع الاستراتيجي للبروتينات الواقية داخل طبقات النخالة من القمح السويداء الغني بالمغذيات. نبات فيزيول. 2010 ، 152 (3): 1459-1470. 10.1104 / ص 109.149864.

Osborne TB، Campbell GF: بروتينات البازلاء. شركة J Am Chem Soc. 1898 ، 20 (5): 348-362. 10.1021 / ja02067a006.

دانيلسون سي: غلوبولين البذور في الجراميني والبقوليات. Biochem J. 1949 ، 44 (4): 387-400.

Dunwell JM: Cupins: فصيلة جديدة من البروتينات المتنوعة وظيفيًا والتي تشمل الجراثيم وبروتينات تخزين النباتات. Biotechnol Genet Eng القس 1998 ، 15: 1-32.

Lawrence MC ، Izard T ، Beuchat M ، Blagrove RJ ، Colman PM: هيكل phaseolin بدقة 2 2: الآثار المترتبة على بنية فيكيلين / بقول مشتركة والهندسة الوراثية لبروتينات تخزين البذور. J مول بيول. 1994 ، 238 (5): 748-776. 10.1006 / جمبي.1994.1333.

Chrispeels MJ: فرز البروتينات في الجهاز الإفرازي. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1991 ، 42: 21-53. 10.1146 / annurev.pp.42.060191.000321.

هيرمان إي ، لاركينز ب: أجسام وفراغات تخزين البروتين. الخلية النباتية. 1999 ، 11 (4): 601-613.

Heck GR ، Chamberlain AK ، Ho THD: جين الشعير الجلوبيولين -1 ، beg1 - توصيف cDNA ، ورسم خرائط الكروموسوم وتنظيم التعبير. مول جينيه. 1993 ، 239 (1-2): 209-218.

Di Sabatino A، Corazza GR: مرض الاضطرابات الهضمية. لانسيت. 2009 ، 373 (9673): 1480-1493. 10.1016 / S0140-6736 (09) 60254-3.

Tatham AS، Shewry PR: مسببات الحساسية للقمح والحبوب ذات الصلة. كلين اكسب الحساسية. 2008 ، 38 (11): 1712-1726.

Larre C و Lupi R و Gombaud G و Brossard C و Branlard G و Moneret-Vautrin DA و Rogniaux H و Denery-Papini S: تقييم الحساسية للأنماط الجينية للقمح ثنائي الصبغة وسداسي الصبغيات: تحديد مسببات الحساسية في جزء الألبومين / الجلوبيولين. ي بروتيوميكس. 2011 ، 74 (8): 1279-1289. 10.1016 / j.jprot.2011.03.014.

MacFarlane AJ، Burghardt KM، Kelly J، Simell T، Simell O، Altosaar I، Scott FW: بروتين مرتبط بالسكري من النوع الأول من القمح (Triticum aestivum) - استنساخ cDNA من جلوبيولين تخزين القمح ، Glb1 ، المرتبط بتلف الجزر. J بيول كيم. 2003 ، 278 (1): 54-63.

Taplin CE و Mojibian M و Simpson M و Taki I و Liu E و Hoffenberg EJ و Norris JM و Scott FW و Rewers M: الأجسام المضادة لغلوبولين تخزين القمح Glo-3A عند الأطفال قبل وعند تشخيص مرض الاضطرابات الهضمية. ي بيدياتر جاسترونتيرول نوتر. 2011 ، 52 (1): 21-25. 10.1097 / MPG.0b013e3181f18c7b.

Loit E ، Melnyk CW ، MacFarlane AJ ، Scott FW ، Altosaar I: تحديد ثلاثة جينات جلوبيولين القمح عن طريق فحص مكتبة الجينوم Triticum aestivum BAC باستخدام cDNA من الجلوبيولين المرتبط بالسكري. بيول مصنع بيول. 2009، 9: 93-10.1186 / 1471-2229-9-93.

Fabijanski S، Altosaar I، Lauriere M، Pernollet JC، Mosse J: التماثلات الأنتيجينية بين الشوفان وجلوبيولين القمح. FEBS ليت. 1985 ، 182 (2): 465-469. 10.1016 / 0014-5793 (85) 80355-0.

Robert LS، Adeli K، Altosaar I: Homology بين 3 S و 7 S globulins من الحبوب والبازلاء. نبات فيزيول. 1985 ، 78 (4): 812-816. 10.1104 / ص 78.4.812.

Larre C و Penninck S و Bouchet B و Lollier V و Tranquet O و Denery-Papini S و Guillon F و Rogniaux H: حبيبات Brachypodium distachyon: تحديد وتوطين بروتينات التخزين. J اكسب بوت. 2010 ، 61 (6): 1771-1783. 10.1093 / jxb / erq050.

Tasleem-Tahir A، Nadaud I، Girousse C، Martre P، Marion D، Branlard G: التحليل البروتيني للطبقات المحيطية أثناء نمو حبوب القمح (Triticum aestivum L.). البروتيوميات. 2011 ، 11 (3): 371-379. 10.1002 / pmic.201000333.

Dupont FM و Vensel WH و Tanaka CK و Hurkman WJ و Altenbach SB: فك رموز تعقيدات بروتين دقيق القمح باستخدام الرحلان الكهربي الكمي ثنائي الأبعاد وثلاثة بروتياز وقياس الطيف الكتلي الترادفي. علم البروتيوم. 2011 ، 9: 10-10.1186 / 1477-5956-9-10.

Khavkin EE ، Misharin SI ، Markov YY ، Peshkova AA: تحديد المستضدات الجنينية للذرة: الجلوبيولين كبروتينات احتياطية أساسية للجنين. بلانتا. 1978 ، 143 (1): 11-20. 10.1007 / BF00389046.

روبرت إل إس ، نوزوليلو سي ، التوسار الأول: التناظر بين عديد الببتيدات الشبيهة بالبقوليات من الحبوب والبازلاء. Biochem J. 1985 ، 226 (3): 847-852.

Sun JL ، و Nakagawa H ، و Karita S ، و Ohmiya K ، و Hattori T: جلوبيولين جنين الأرز: متواليات الأحماض الأمينية الطرفية ، واستنساخ cDNA والتعبير. فيسيول الخلية النباتية. 1996 ، 37 (5): 612-620. 10.1093 / oxfordjournals.pcp.a028989.

Thijssen MH ، Spoelstra P ، Emons AMC: الكشف المناعي والتوطين المناعي لبروتينات تخزين الجلوبيولين أثناء تطور الجنين الجنيني والجسدي في Zea mays. فيزيول بلانتاروم. 1996 ، 98 (3): 539-549. 10.1111 / j.1399-3054.1996.tb05709.x.

Burgess SR ، Shewry PR: تحديد الجلوبيولين المتماثل من أجنة القمح والشعير والجاودار والشوفان. J اكسب بوت. 1986 ، 37 (185): 1863-1871.

Singh J ، Blundell M ، Tanner G ، Skerritt JH: بروتينات الألبومين والجلوبيولين لدقيق القمح: توصيف التسلسل المناعي و N-terminal. ي علوم الحبوب. 2001 ، 34 (1): 85-103. 10.1006 / jcrs.2001.0380.

Nielsen H ، Engelbrecht J ، Brunak S ، von Heijne G: تحديد ببتيدات الإشارة بدائية النواة وحقيقية النواة والتنبؤ بمواقع الانقسام. هندسة البروتين. 1997 ، 10 (1): 1-6. 10.1093 / بروتين / 10.1.1.

Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, von Heijne G: Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. J مول بيول. 2000, 300 (4): 1005-1016. 10.1006/jmbi.2000.3903.

Eizirik DL, Colli ML, Ortis F: The role of inflammation in insulitis and beta-cell loss in type 1 diabetes. Nat Rev Endocrinol. 2009, 5 (4): 219-226. 10.1038/nrendo.2009.21.

Todd JA: Etiology of type 1 diabetes. حصانة. 2010, 32 (4): 457-467. 10.1016/j.immuni.2010.04.001.

MacFarlane AJ, Strom A, Scott FW: Epigenetics: deciphering how environmental factors may modify autoimmune type 1 diabetes. مام جينوم. 2009, 20 (9–10): 624-632.

McCallum BD, DePauw RM: A review of wheat cultivars grown in the Canadian prairies. Can J Plant Sci. 2008, 88 (4): 649-677. 10.4141/CJPS07159.

Deng X, Hahne T, Schroeder S, Redweik S, Nebija D, Schmidt H, Janssen O, Lachmann B, Waetzig H: The challenge to quantify proteins with charge trains due to isoforms or conformers. الكهربائي. 2012, 33 (2): 263-269. 10.1002/elps.201100321.

Kriz AL: 7 S globulins of cereal. In Seed Proteins. Edited by: Shewry PR, Casey R. 1999, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 477-498.

Yupsanis T, Burgess SR, Jackson PJ, Shewry PR: Characterization of the major protein component from aleurone cells of barley (Hordeum vulgare L.). J Exp Bot. 1990, 41 (225): 385-392.

Gatehouse JA, Lycett GW, Delauney AJ, Croy RRD, Boulter D: Sequence specificity of the post-translational proteolytic cleavage of vicilin, a seed storage protein of pea (Pisum sativum L). Biochem J. 1983, 212 (2): 427-432.

Spencer D, Chandler PM, Higgins TJV, Inglis AS, Rubira M: Sequence interrelationships of the subunits of vicilin from pea seeds. Plant Mol Biol. 1983, 2 (5): 259-267. 10.1007/BF01578644.

Sharma GM, Mundoma C, Seavy M, Roux KH, Sathe SK: Purification and biochemical characterization of Brazil nut (Bertholletia excelsa L.) seed storage proteins. J Agric Food Chem. 2010, 58 (9): 5714-5723. 10.1021/jf9036326.

Sturm A, Vankuik JA, Vliegenthart JFG, Chrispeels MJ: Structure, position, and biosynthesis of the high mannose and the complex oligosaccharide side-chains of the bean storage protein phaseolin. J بيول كيم. 1987, 262 (28): 13392-13403.

Chrispeels MJ, Higgins TJV, Spencer D: Assembly of storage protein oligomers in the endoplasmic reticulum and processing of the polypeptides in the protein bodies of developing pea cotyledons. J خلية بيول. 1982, 93 (2): 306-313. 10.1083/jcb.93.2.306.

Schwartz D: Analysis of the size alleles of the pro gene in maize - evidence for a mutant protein processor. مول جينيه. 1979, 174 (3): 233-240. 10.1007/BF00267795.

Sanchez JC, Rouge V, Pisteur M, Ravier F, Tonella L, Moosmayer M, Wilkins MR, Hochstrasser DF: Improved and simplified in-gel sample application using reswelling of dry immobilized pH gradients. الكهربائي. 1997, 18 (3–4): 324-327.

Scott FW, MacFarlane A, Burghardt K, Mojibian M: Diabetogenic epitopes. US Patent Application. 2007, 20070185021

Ariizumi T, Higuchi K, Arakaki S, Sano T, Asamizu E, Ezura H: Genetic suppression analysis in novel vacuolar processing enzymes reveals their roles in controlling sugar accumulation in tomato fruits. J Exp Bot. 2011, 62 (8): 2773-2786. 10.1093/jxb/erq451.

Sancho AI, Gillabert M, Tapp H, Shewry PR, Skeggs PK, Mills ENC: Effect of environmental stress during grain filling on the soluble proteome of wheat (Triticum aestivum) dough liquor. J Agric Food Chem. 2008, 56 (13): 5386-5393. 10.1021/jf800209b.

Kaviani B, Pourkhalili ST, Sajedi RH, Mosadegh B: Salt treatment can change composition of glycinin and beta-conglycinin proteins in soybean seed. Plant Omics. 2011, 4 (4): 228-235.

Rayhan MU, Van K, Kim DH, Il Kim S, Kim MY, Lee Y, Lee S: Identification of Gy4 nulls and development of multiplex PCR-based co-dominant marker for Gy4 and alpha' subunit of beta-conglycinin in soybean. Genes Genom. 2011, 33 (4): 383-390. 10.1007/s13258-010-0158-7.

Stanojevic SP, Barac MB, Pesic MB, Vucelic-Radovic BV: Assessment of soy genotype and processing method on quality of soybean tofu. J Agric Food Chem. 2011, 59 (13): 7368-7376. 10.1021/jf2006672.

Walker-Simmons M: ABA levels and sensitivity in developing wheat embryos of sprouting resistant and susceptible cultivars. نبات فيزيول. 1987, 84 (1): 61-66. 10.1104/pp.84.1.61.

Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC: Measurement of protein using bicinchoninic acid. الشرج Biochem. 1985, 150 (1): 76-85. 10.1016/0003-2697(85)90442-7.

Bradford MM: Rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing principle of protein-dye binding. الشرج Biochem. 1976, 72 (1–2): 248-254.

Shaw MM, Riederer BM: Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis. Proteomics. 2003, 3 (8): 1408-1417. 10.1002/pmic.200300471.

Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. طبيعة سجية. 1970, 227 (5259): 680-685. 10.1038/227680a0.

Wilm M, Shevchenko A, Houthaeve T, Breit S, Schweigerer L, Fotsis T, Mann M: Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels by nano-electrospray mass spectrometry. طبيعة سجية. 1996, 379 (6564): 466-469. 10.1038/379466a0.

Vasilescu J, Smith JC, Ethier M, Figeys D: Proteomic analysis of ubiquitinated proteins from human MCF-7 breast cancer cells by immunoaffinity purification and mass spectrometry. J Proteome Res. 2005, 4 (6): 2192-2200. 10.1021/pr050265i.

Wall ML, Wheeler HL, Smith J, Figeys D, Altosaar I: Mass spectrometric analysis reveals remnants of host-pathogen molecular interactions at the starch granule surface in wheat endosperm. Phytopathology. 2010, 100 (9): 848-854. 10.1094/PHYTO-100-9-0848.

Koziol AG, Marquez BK, Huebsch MP, Smith JC, Altosaar I: The starch granule associated proteomes of commercially purified starch reference materials from rice and maize. J Proteomics. 2012, 75 (3): 993-1003. 10.1016/j.jprot.2011.10.019.

Skylas DJ, Mackintosh JA, Cordwell SJ, Basseal DJ, Walsh BJ, Harry J, Blumenthal C, Copeland L, Wrigley CW, Rathmell W: Proteome approach to the characterisation of protein composition in the developing and mature wheat-grain endosperm. J Cereal Sci. 2000, 32 (2): 169-188. 10.1006/jcrs.2000.0321.


نتائج

Fatty acid synthase is intact prior to cryo-EM grid preparation

The FAS complex used for cryo-EM data collection was pure and homogeneous, as shown by size exclusion chromatography, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (Figure 1—figure supplement 1A–C). Thermal shift assays indicated that the complex was stable (Figure 1—figure supplement 1D), and at 1500–3000 mU/mg it was enzymatically fully active (Fichtlscherer et al., 2000 Oesterhelt et al., 1969 Wieland et al., 1979). Negative-stain EM of freshly purified FAS samples indicated that the complex was structurally intact (Figure 1—figure supplement 2A). Cryo-EM of the same samples in plunge-frozen, unsupported thin layers of vitrified solution on holey carbon film revealed that around 90% of the particles had suffered major structural damage (Figure 1). FAS particles in two-dimensional (2D) and in particular three-dimensional (3D) classification lacked between one third and one half of their density or had weak density at the distal part of the beta-domes (Figure 1A,B). A reconstruction of

8000 particles was limited to 9.5 Å resolution, according to the gold-standard 0.143 FSC criterion (Scheres and Chen, 2012) (Figure 1C). Back-tracking of incomplete particles in the 3D classes (Figure 1B) revealed major structural defects of the protein complexes in the raw micrographs (Figure 1—figure supplement 2B,C). These observations led us to conclude that the protein must have been damaged prior to or during cryo-EM grid preparation.

Single-particle cryo-EM results from unsupported vitrified buffer.

(أ) Two-dimensional classification of particles shows weak or absent density of beta-domes (red arrows). (ب) The alpha-wheel structure reveals major damage to about 90% of particles (dashed red). The remaining ∼10% (dashed grey) contributed to a reconstruction (ج) at 9.5 Å resolution.

Particle distribution in vitrified cryo-EM grids

Next, we performed cryo-ET on the vitrified specimens prepared for single-particle cryo-EM. Several batches of purified FAS plunge-frozen by different users under different conditions were examined. All experiments indicated damaged FAS complexes in all imaged areas (Figure 2A). In most instances, small fragments of denatured FAS were found in the areas surrounding individual complexes (red arrows in Figure 2A, Figure 2—video 1).

Particle distribution and structure of FAS in unsupported vitrified buffer.

(أ) Segmentation of a typical Quantifoil R2/2 grid hole with FAS complexes. Red arrows indicate fragments of FAS particles. (ب) Slab of vitrified buffer, delimited by carbon and small contaminating ice crystals. (ج) Detail of a single FAS complex showing morphological differences between sides facing the air-water interface or away from it.

Cryo-ET revealed that FAS adhered to the two opposite surfaces of the unsupported thin layers of vitrified buffer. One surface, which we refer to as the lower meniscus, was densely packed with adsorbed protein complexes. The opposite surface (the upper meniscus) had only a small number of particles attached (Figure 2B and Figure 2—figure supplement 1). Together with small ice crystals from atmospheric contamination on the outside surface of the vitrified layer, the FAS complexes on the upper and lower meniscus allowed us to trace the air-water interface exactly (Figure 2B).

Tomographic volumes suggested that nearly all the FAS particles in contact with the air-water interface were damaged. The particles were mostly flattened on one side and appeared incomplete (Figure 2C). The flattened regions aligned with the plane of the air-water interface. Particles attached to the lower and upper meniscus appeared to be equally affected, although the small number of particles on the upper meniscus precluded a statistically significant analysis. Our observations thus suggest that at some point during cryo-specimen preparation, the large majority of FAS complexes encountered the air-water interface, attached to it, and the air-exposed side unfolded before vitrification.

Orientation of damaged FAS particles on the air-water interface

FAS particles at the air-water interface were investigated by subtomogram averaging (STA). A set of 1724 subvolumes was manually selected, and a subset of 20 randomly picked volumes was used as a reference for initial alignment. No symmetry constraints were applied. The final reconstruction indicated that one side of the FAS map lacked density, whereas the opposite side of the complex appeared complete (Figure 3A). FAS attached with its long axis parallel to the air-water interface, which accounts for the scarcity of top views in the single-particle analysis. To determine the orientation of the partly denatured FAS complexes relative to the air-water interface, we fitted a surface through the centers of all particles (Figure 3B). We then calculated the vectors pointing from the center of a complex towards its flattened side (Figure 3C). Finally, we assessed by how much the vectors diverged from the normal of the previously calculated plane through all particles at that position, and whether they pointed toward the air-water interface or away from it. This analysis indicated clearly that the vectors pointed towards the air-water interface (Figure 3D).

Sub-tomogram averaging and orientation of denatured FAS in unsupported vitrified buffer.

(أ) Subtomogram averaging confirms localized denaturation of FAS. The published cryo-EM structure of intact FAS (Gipson et al., 2010) (above) is shown for comparison. (ب) Surface (Sestimate) through the center of all FAS complexes in the selected area. (ج) Vector Pdenat describing the orientation of denatured FAS (Rdenat), of the missing density (Rمفقود) and the perpendicular direction (Pعادي) relative to Sestimate. The displacement angle is δ. (د) Angular distribution of δ for all particles in reconstructed tomograms.

The structural heterogeneity of the partly denatured FAS complexes was examined by multi-reference alignment. In line with the single-particle results (Figure 1B), we found different degrees of particle damage. About 86% were extensively damaged, with one third or even half of the characteristic quaternary FAS structure weak or absent (Figure 3—figure supplement 1A). The remaining 14% had poorly resolved densities (Figure 3—figure supplement 1B), suggesting that even those particles on the air-water interface that appeared intact had suffered some damage. The set of subvolumes probably contained a small number of undamaged particles from the bulk phase, but visual inspection of the tomographic volumes did not reveal any. We conclude that most if not all particles at or near a meniscus were damaged to a greater or lesser extent by contact with the air-water interface.

Air exposure induces protein denaturation

In a series of three experiments, we tested different ways in which exposure to air could cause protein denaturation. As before, negative-stain EM confirmed that the particles were initially undamaged (Figure 4A). In one experiment, we bubbled air through the sample to maximize air contact. In another experiment, we poured the protein solution over a glass rod (Trurnit, 1960) to expose a continuous thin aqueous film to the atmosphere (Figure 4B). In the third experiment, we applied a 20 μl volume of FAS solution to a standard EM support grid coated with continuous carbon, and then touched the top of the droplet with a second carbon-coated grid (Figure 4C). In this way, we separated the particles adsorbed to the air-water interface from those adsorbed to the carbon film (Figure 4D). The result of each experiment was then examined by negative-stain EM (upper panels in Figure 4B–D). Bubbling air through the sample (experiment 1) completely denatured all FAS complexes (not shown), whereas in experiments 2 and 3 a small proportion remained intact. Denatured proteins were a predominant feature in all the three conditions except that particles adsorbed to the carbon film in experiment 3 (Figure 4D) were apparently undamaged. These results show that FAS at the air-water interface is denatured, whereas it remains intact when adsorbed to a solid substrate in liquid.

Denaturation by controlled exposure to air as analyzed by negative-stain EM.

(أ) Untreated FAS sample (control). (ب) A thin film of FAS solution flowing over a glass rod. Most complexes are denatured. (ج) Denatured FAS particles picked up from the top of the droplet. (د) Undamaged FAS particles adsorbed to amorphous carbon at the opposite drop surface.

Hydrophilized graphene-coated grids prevent denaturation at the air-water interface

To find out whether adsorption to a continuous support film would prevent damage also under cryo-conditions, we prepared FAS on EM-grids coated with a layer of graphene rendered hydrophilic with 1-pyrene carboxylic acid (1-pyrCA). To assess the quality of the graphene, all grids were examined by electron diffraction before vitrification. Sharp diffraction spots indicated flat monolayers of graphene (Figure 5—figure supplement 1A,B). The hydrophobic nature of the untreated graphene film was apparent from the repulsion of a water droplet pipetted onto the grid (Figure 5—figure supplement 1C). The same grids were then chemically doped with a solution of 1-pyrCA, which did not degrade the crystalline order of the graphene layer (Figure 5—figure supplement 1D,E). The hydrophilic character of the 1-pyrCA-doped graphene was indicated by the reduced contact angle of a water droplet on the grid (Figure 5—figure supplement 1F). The FAS solution was applied as before, and grids were blotted and plunge-frozen as for unsupported vitreous films. The hydrophilized graphene/FAS grids were then used for cryo-ET and single-particle cryo-EM.

Cryo-ET indicated the position of the air-water and graphene-water interfaces by atmospheric ice crystals and small patches of contaminants (Figure 5A,B). When the graphene layer was rendered hydrophilic by 1-pyrCA, FAS had a strong preference for the graphene-water interface over the air-water interface (Figure 5B, Figure 5—figure supplement 2 and Figure 5—video 1).

Sub-tomogram averaging of FAS vitrified on hydrophilized graphene.

(أ) Zero degree view of tomographic tilt series. (ب) Slab of vitrified buffer delimited by carbon and ice contaminants, indicating adsorption of FAS complexes to the graphene-water interface. (ج) Subtomogram averaging confirms the structural integrity of FAS. (د) Three-dimensional impression (not drawn to scale) indicating the relative position of Quantifoil carbon film (dark grey) and hydrophilized graphene (mid-grey) on the copper support grid (dark red). The solution containing FAS particles (light grey) was applied from the uncoated side of the grid.

To investigate the state of preservation of FAS on hydrophilized graphene, we hand-picked a set of 2090 subvolumes and performed subtomogram averaging and multi-reference classification as for unsupported vitrified samples. Reconstructions both before (Figure 5C and Figure 5—figure supplement 3) and after (Figure 5—figure supplement 4) multi-reference alignment indicated that all particles were intact. The best sub-tomogram averages yielded maps at 24.6 Å and 17.1 Å resolution before and after masking (Figure 5—figure supplement 5). Since few if any particles stuck to the air-water interface and multi-reference alignment did not reveal any damage, we conclude that FAS does not denature on hydrophilized graphene.

Hydrophilized graphene is suitable for high-resolution cryo-EM

To find out whether hydrophilized graphene films are suitable for high-resolution structure determination, we analyzed FAS on these grids by single-particle cryo-EM. Typical micrographs recorded at 0.9 μm defocus showed well-preserved particles (Fig. Figure 6—figure supplement 1A), although the background is not completely transparent. Presumably, the pristine graphene surface became contaminated to some extent with atmospheric hydrocarbons during specimen preparation, and the high dopant concentration may contribute to some loss of contrast. These factors may compromise the detection and alignment of particles that are significantly smaller than yeast FAS. The 2D (Figure 6—figure supplement 1B) and rotationally averaged 1D power spectra (Figure 6—figure supplement 1C) indicated oscillations beyond 3 Å spatial frequency (Figure 6—figure supplement 1C).

All 2D class averages displayed high-resolution detail (Figure 6A) and confirmed that FAS was structurally undamaged. This was verified by 3D classification, which showed intact complexes with well-resolved secondary structure. Note that this dataset contained only intact particles (Figure 6B), whereas 90% of the particles in the single-particle FAS dataset from unsupported vitrified samples had suffered major damage (Figure 1B classes 2, 3), and even the remaining 10% were compromised (Figure 1B class one and Figure 1C).

Single-particle cryo-EM results on hydrophilized graphene.

Two-dimensional (أ) and three-dimensional (ب) classification both show intact particles. A final map calculated without (ج) or with (د) imposed D3 symmetry indicated a resolution of 4.8 Å or 4.0 Å.

After merging the best 3D classes, we obtained a final set of ∼28,000 particles. Auto-refinement without symmetry (C1) or with imposed D3 symmetry yielded maps at 4.8 and 4.0 Å resolution, respectively (Figure 6C,D). Local resolution estimates indicated better than 3.5 Å resolution for the rigid alpha wheel (Figure 6—figure supplement 2). For an unbiased comparison to the 9.5 Å map obtained from FAS in unsupported vitrified buffer (Figure 6—figure supplement 3A), we randomly selected 8000 particles from the dataset collected on hydrophilized graphene. The resulting map (Figure 6—figure supplement 3B) attained a resolution of 6.4 Å, confirming that hydrophilized graphene works very much better as a substrate for single-particle cryo-EM of FAS than unsupported vitrified buffer. The particles were intact and the map contained all the main features of the best non-symmetrized 4.8 Å map (Figure 6—figure supplement 3C). Finally, although not random, particle orientation was much more evenly distributed on hydrophilized graphene, compared to unsupported vitrified buffer (Figure 6—figure supplement 4).


مناقشة

The preferential solubilization properties of Triton X-114 were employed to construct a two-dimensional gel database enriched in hydrophobic human sperm proteins [ 30]. Peptide sequencing by mass spectrometry indicated that four protein spots with molecular weights of 30–34 kDa and pأناs of 4.5–5.4 contained common peptide sequences. Two possibilities existed to account for the variation in mobility. First, since human cDNA is often a composite of differentially spliced exons, the protein molecular sizes could be different due to joining of different sets of exons. Second, posttranslational modification, such as phosphorylation, can affect the migration of proteins on a gel. The finding by mass spectrometry that a serine residue was phosphorylated indicated that posttranslational modification might be responsible at least in part for the molecular weight and pأنا differences. Furthermore, the following observations do not support the possibility of alternative splicing: 1) a single mRNA species was detected in Northern analysis, 2) EST database searches did not reveal sequences suggestive of alternative splicing, and 3) no new amino acid sequences were obtained in a separate peptide sequencing experiment that cored additional spots from two-dimensional gels. All of the peptide sequences obtained, however, were accounted for in the single open reading frame ( Table 1).

Cloning of SAMP32 resulted in a cDNA of 1455 bp. This is most likely a full-length sequence because 1) its size correlates well with a message of 1.5 kb noted on the Northern blot (discussed subsequently), 2) the translation start site contains a canonical Kozak consensus sequence [ 35], and 3) the predicted molecular weight closely matches the apparent molecular weight of SAMP32 on two-dimensional gels. Search of the GenBank database using the deduced protein sequence indicated that SAMP32 was novel. The search also indicated that an amino terminal domain of SAMP32 was homologous to an amino terminal domain in Malaria circumsporozoite protein (CSP) and that شيزوساكارومايس بومب KRP1 and SAMP32 shared carboxyl terminus region. It is interesting to note that CSP is a surface antigen found in the circumsporozoite, which is the infectious stage of Malaria [ 36]. On the other hand, fission yeast KRP1 protein belongs to the family of type I membrane-bound endopeptidases. Through cleavage after pairs of dibasic residues, KRP1 is involved in ص-factor maturation [ 37]. The significance of these homologies is unclear at present, although it is possible that SAMP32 may have the same basic pattern of folding to CSP in its N-terminus and to KRP1 in the C-terminus according to the protein global alignment study [ 38, 39]. This could also imply that SAMP32 is responsible for proteolytic processing in the acrosome if it does possess endopeptidase activity. We are now testing this possibility.

From mass spectrometry, phosphorylation of serine 256 was observed in vivo, and the PredictProtein program indicated that SAMP32 contained three consensus phosphorylation sites for casein kinase II. Serine 256 was among them (others include serine 203 and 274), which suggested that casein kinase II is the enzyme responsible for phosphorylation at this site. Casein kinase II, a constitutively active enzyme most abundant in the testis and the brain [ 40], is thought to play an important role in many processes including DNA replication and transcription, RNA processing and translation, and cell metabolism and motility [ 41]. Known substrates of casein kinase II include molecules involved in signal transduction, transcription, DNA replication, and the cell cycle.

A Northern blot of eight human tissues initially suggested that the RNA transcript is about 1.5 kb long, a size comparable to the cDNA, and that SAMP32 is expressed only in the testis. In agreement with this finding, an EST database search did not reveal any other tissues expressing SAMP32. This testis specificity is reinforced by our comprehensive study of RNA expression by RNA dot blot hybridization, which contained 76 human tissues. This finding may indicate that SAMP32 is a gene required for a structure or a function unique to spermatozoa.

A two-dimensional Western blot incubated with antibody to rSAMP32 revealed immunoreactivity with all of the protein spots that we originally cored for peptide sequencing. The trace amount of higher molecular weight spots at ∼60 and ∼90 kDa most likely represented aggregates since 1) these protein spots had sizes two or three times that of the single molecule 2) the amount of high molecular weight protein decreased drastically when urea was included in the gel (urea keeps the protein denatured, thus preventing it from forming aggregates) and 3) independent sequencing showed that a 120-kDa spot cored from a two-dimensional gel contained several peptide sequences embedded in SAMP32 (data not shown).

Biotinylation of at least one of the SAMP32 protein spots suggested a surface localization. However, the absence of immunofluorescent staining of freshly ejaculated live sperm (few if any acrosome reacted) indicated that SAMP32 is not exposed on the sperm plasma membrane. Electron microscopy indicated that SAMP32 is localized to the equatorial segment and the inner acrosomal membrane of capacitated sperm. Thus, biotinylation of some SAMP32 may have resulted from damage to the sperm acrosome or spontaneous acrosomal reaction (10% average) during biotinylation and processing of live sperm.

Initially, Triton X-114 phase partitioning experiments indicated that SAMP32 was found only in the detergent phase, which suggested that SAMP32 was hydrophobic and thus possibly associated with membranes. On cloning the cDNA, a putative transmembrane domain residing in amino acids 222–242 was found, suggesting that SAMP32 was a potential transmembrane protein. Labeling along the inner acrosomal membrane in our immunogold staining study indicated that SAMP32 was associated with the acrosomal membrane. Taken together, these observations suggest that SAMP32 is a membrane protein (most likely a transmembrane protein). Although PH-20 is known to associate with the acrosomal membrane by virtue of its GPI anchor [ 15– 20], few intra-acrosomal membrane proteins with functional transmembrane domains have been described to date.

Male germ cells require 72 days in humans to finish the developmental process of differentiating into mature sperm. The specific pattern of SAMP32 expression during spermiogenesis suggests the SAMP32 gene expression is tightly regulated developmentally. By staining testicular cells dissociated with enzyme, SAMP32 was clearly shown to be a differentiation antigen [ 42], expressed exclusively in germ cells during acrosomal biogenesis. The fact that humans make antibodies to SAMP32 indicates that the immune system is not tolerant to SAMP32, suggesting that like other postmeiotic gene products, SAMP32 has not been exposed to the immune system until the onset of spermatogenesis at puberty.

By coupling two-dimensional gel Western blotting with protein microsequencing, we showed that SAMP32 was likely an isoantigen. To rule out the possibility that the ASA + infertile man’s serum was recognizing other proteins that comigrated with SAMP32, we blotted the rSAMP32 with sera from both infertile and fertile men. Recombinant SAMP32 was indeed an isoantigen since rSAMP32 strongly reacted with serum from an ASA + infertile man. This is potentially interesting since it suggests that SAMP32 may be one of the many antigens causing immunoinfertility. From a contraceptive vaccine development perspective, the fact that antibodies from ASA + humans reacts with rSAMP32 indicates that at least some of the immunogenic epitopes recognized by the human response are present in the expressed and purified recombinant antigen. This indicates that rSAMP32 is suitable for vaccine testing in primates. It is worth mentioning that the high-molecular weight spot (C108) in Figure 10A (Celis extracts) did not show up in Figure 6 (detergent extract). This suggests that the proteins differentially partition according to the extraction conditions and may reflect different properties or subcellular localization (e.g., cytosolic vs. transmembrane).

One mechanism by which sperm antigens may cause immunoinfertility is to induce antibody formation in the female reproductive tract and in turn block single or multiple points of sperm and egg interaction. Our hamster egg penetration assay demonstrated that antiserum against SAMP32 significantly inhibited both the binding and the fusion of sperm with hamster eggs. These results suggested that SAMP32 might have a role in one or more events of primary and secondary binding and in fusion of sperm with the oolemma or in sperm internalization. It is important to point out that sperm in the process of fusing with the egg were not directly measured but rather intracellular sperm resulting from fusion. Since fusion is dependent on binding, the inhibition of sperm-egg fusion seen here may at least partly be the result of binding inhibition. Inhibition of binding alone, however, cannot account for all inhibition of fusion because binding was only inhibited by 50%, whereas fusion was inhibited by more than 80%. Since we have identified the mouse SAMP32 (data not shown), experiments are under way to clarify its role in the fertilization process.


شاهد الفيديو: كيف تصنع الخلية البروتين إعجاز الهي يكشفه العلم التجريبي. (شهر نوفمبر 2022).