معلومة

هل هناك أي بديل للفحص الأبيض / الأزرق x-gal لرصد نشاط pseudomonas aeruginosa beta-galactosidase على لوحة أجار؟

هل هناك أي بديل للفحص الأبيض / الأزرق x-gal لرصد نشاط pseudomonas aeruginosa beta-galactosidase على لوحة أجار؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أريد فحص أ الزائفة الزنجارية مكتبة متحولة تحمل أ لاكز الاندماج النسخي للطفرات غير المنظمة. حاولت القيام بذلك على لوحات xgal لكن تراكم اللون الأزرق يجعل عملية الفرز صعبة. رأيت أن الأشخاص يستخدمون وسائط macconkey أو endo agar لفحص بيتا غال ثنائي الهجين في بكتريا قولونية على سبيل المثال. أتساءل عما إذا كان سيكون شيئًا ما يجب تجربته حتى مع pseudomonas (الذي يمتلك فقط لاكز الجين ، فلا تصاريح الخ ...) وإذا جربها شخص ما هنا من قبل؟ أو إذا كان من الممكن استخدام ركائز بيتا غال أخرى لهذا التطبيق؟ شكرا جوليان


أعتقد أن مشكلتك ستكون أسوأ عندما تستخدم لوحات MacConkey أو Endo. يمكنك أن ترى الاختلافات بين الأنواع المختلفة من البكتيريا / التعبير عن إنزيمات معينة على تلك اللوحات ، لكن التلوين / إزالة اللون يعتمد على المركبات القابلة للذوبان التي تنتشر بسهولة.

التحلل المائي لل xgal يخلق لا يتحلل في الماء المنتج الذي يبقى أكثر أو أقل في مستعمرتك. بالطبع إنها ليست مثالية وبعد فترة يكون لديك لوحة زرقاء تمامًا ، ولكن هذا سيحدث بشكل أسرع مع مركب قابل للذوبان.

حاول تعديل ظروفك حتى تتمكن من النظر إلى اللوحة قبل أن تصبح زرقاء تمامًا. الأشياء التي يمكنك تجربتها: انظر في وقت سابق ، ضعها في الصفيحة أكثر تمييعًا قليلاً بحيث تكون المستعمرات متباعدة ، استخدم أقل xgal بحيث يكون تلوينك النهائي أقل كثافة ، ابحث عن بعض الأوراق التي تستخدم xgal للفحص وسرقة حيلها.


تقنيات المختبر المعقم: طرق الطلاء

الكائنات الدقيقة موجودة على جميع الأسطح غير الحية مما يخلق مصادر في كل مكان للتلوث المحتمل في المختبر. يعتمد النجاح التجريبي على قدرة العالم على تعقيم أسطح ومعدات العمل وكذلك منع ملامسة الأدوات والمحاليل المعقمة مع الأسطح غير المعقمة. نقدم هنا خطوات العديد من طرق الطلاء المستخدمة بشكل روتيني في المختبر لعزل أو نشر أو تعداد الكائنات الحية الدقيقة مثل البكتيريا والعاثية. تتضمن جميع الطرق الخمس تقنية التعقيم ، أو الإجراءات التي تحافظ على عقم المواد التجريبية. تشمل الإجراءات الموصوفة (1) مزارع بكتيرية لطلاء الخطوط لعزل مستعمرات مفردة ، (2) صب الطلاء و (3) طلاء منتشر لتعداد مستعمرات بكتيرية قابلة للحياة ، (4) تراكبات أجار ناعمة لعزل فج وتعداد اللويحات ، و ( 5) طلاء طبق الأصل لنقل الخلايا من لوحة إلى أخرى في نمط مكاني متطابق. يمكن تنفيذ هذه الإجراءات على طاولة المختبر ، بشرط أن تتضمن سلالات غير مسببة للأمراض من الكائنات الحية الدقيقة (مستوى السلامة الحيوية 1 ، BSL-1). إذا كنت تعمل مع كائنات BSL-2 ، فيجب أن تتم هذه التلاعبات في خزانة السلامة الأحيائية. راجع أحدث إصدار من السلامة الحيوية في المختبرات الميكروبيولوجية والطبية الحيوية (BMBL) وكذلك أوراق بيانات سلامة المواد (MSDS) للمواد المعدية لتحديد تصنيف الخطر البيولوجي وكذلك احتياطات السلامة ومرافق الاحتواء المطلوبة للكائن الدقيق المعني. يمكن الحصول على السلالات البكتيرية ومخزون العاثيات من الباحثين والشركات والمجموعات التي تحتفظ بها منظمات معينة مثل مجموعة الثقافة الأمريكية (ATCC). يوصى باستخدام السلالات غير المسببة للأمراض عند تعلم طرق الطلاء المختلفة. باتباع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول ، يجب أن يكون الطلاب قادرين على: & # x025cf تنفيذ إجراءات الطلاء دون تلويث الوسائط. & # x025cf عزل المستعمرات البكتيرية المفردة بطريقة الطلاء الخطي. & # x025cf استخدام طرق الطلاء بالسكب والطلاء بالرش لتحديد تركيز البكتيريا. & # x025cf تنفيذ تراكبات أجار ناعمة عند العمل بالعاثية. & # x025cf نقل الخلايا البكتيرية من لوحة إلى أخرى باستخدام إجراء النسخ المتماثل. & # x025cf في مهمة تجريبية ، حدد طريقة الطلاء المناسبة.


مقدمة

ال بوركولديريا سيباسيا المعقد (Bcc) يشمل بكتيريا وثيقة الصلة وراثيًا ، موزعة حاليًا على 17 نوعًا مسمىًا بشكل صحيح (Vandamme and Dawyndt 2011). تحمل الأنواع المخفية جينومًا كبيرًا متعدد البليكون ، مما يمنحها إمكانية رائعة للتكيف مع المنافذ البيئية المتنوعة. في الواقع ، منذ أول وصف بيئي ل B. cepacia كعامل ممرض في البصل ، تم عزل سلالات Bcc من التربة والمياه والجذور والمرضى الذين يعانون من نقص المناعة والمنتجات الصناعية (Burkholder 1950 Mahenthiralingam et al. 2005 Vial et al. 2011). هناك سببان رئيسيان للقلق بالنسبة للبشر ، وهما أن الأنواع المخفية يمكن أن تكون فعالة في نمو النبات - وتعزز البكتيريا الجذرية (PGPR) ، ولكنها تمثل أيضًا تهديدًا كبيرًا لحياة الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة ، مثل أولئك الذين يعانون من التليف الكيسي (CF) (Govan et al. .2000). كشفت التطورات الهائلة في تقنيات تحديد الهوية والتصنيف أن أعضاء مخفية الوجهة يتم توزيعهم على نطاق واسع ولكن بشكل غير متجانس وفقًا للمنافذ ، وبعض الأنواع تعرض إمكانات ضراوة عالية بشكل خاص تجاه مرضى التليف الكيسي ، بينما تعمل الأنواع الأخرى على أنها فعالة PGPR (Mahenthiralingam et al.2008). ومع ذلك ، تم عزل جميع أنواع مخفية الوجهة تقريبًا عن كل من المصادر البيئية والسريرية ، مما يشير إلى أن التكيف مع مكانة معينة لا يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالانتماء إلى نوع معين (Mahenthiralingam et al. 2008 Vial et al. 2011). وفقًا لذلك ، نظرًا لأن البيئة على ما يبدو خزان للبكتيريا التي تهدد الحياة ، لا يوصى بالاستخدام التجاري لسلالات Bcc ، ويتم وضعها فعليًا تحت حظر فرضته وكالة حماية البيئة الأمريكية (EPA) (Chiarini et al.2006).

استشعار النصاب (QS) هو نظام اتصال بكتيري من خلية إلى خلية ، يعتمد على إطلاق جزيئات الإشارة في البيئة المكروية عندما ينمو عدد البكتيريا ، ويزداد تركيز الجزيئات ، ويصل إلى عتبة تؤدي إلى تنظيم الجينات المستهدفة (Williams 2007) ). تم اكتشاف أول نظام QS في فيبريو فيشيري وتورطت LuxI synthase ، المسؤولة عن إنتاج ن-اسيلهوموسرين لاكتون (AHL) كجزيء إشارة ، والذي يربط منظم النسخ المتماثل LuxR (Engebrecht and Silverman 1984). تم تحديد أنظمة QS من نوع LuxRI ، والتي تعتمد على جزيئات AHL ، منذ ذلك الحين في معظم البكتيريا سالبة الجرام. في الأنواع المخفية ، يوجد نظام من نوع LuxRI يسمى CepRI (Lewenza et al. 1999). يعتمد CepRI على ن-أوكتانويل هوموسرين لاكتون (سي8-HSL) و ن- هكسانويل هوموسرين لاكتون (سي6-HSL) كجزيئات إشارة ، والأولى بشكل عام هي الأكثر وفرة (Lutter et al. 2001). تم وصف بعض الأنماط الظاهرية ، مثل إنتاج حامض الحديد ، وأنشطة التحلل للبروتين ، وتكوين الأغشية الحيوية ، لتكون تحت سيطرة QS في بكتيريا Bcc (Eberl 2006). نظرًا لأن QS متورط عادةً في تنظيم عوامل الفوعة ، فقد ركزت معظم الدراسات بشكل أساسي على البكتيريا المسببة للأمراض (سوكول وآخرون ، 2007). ومع ذلك ، يمكن اعتبار QS بشكل عام كوسيلة للبكتيريا لاستشعار بيئاتها الدقيقة والتفاعل معها (Williams 2007 Mellbye and Schuster 2011). الدراسات الحديثة تورط غير مسببة للأمراض بوركولديريا أظهرت سلالات أن QS مهم للعلاقات البكتيرية داخل الجذور ، للتفاعل مع النباتات وكذلك في المجتمعات متعددة الميكروبات (Chan et al. 2011 Suarez-Moreno et al. 2012).

نسخة مخفية الوجهة Burkholderia ambifaria يتم عزل الأنواع في الغالب من التربة وهي سائدة بشكل خاص في منطقة الجذور للعديد من المحاصيل (Coenye et al. 2001 Coenye and Vandamme 2003). سلالة النوع ب. أمبفاريا تم عزل LMG19182 T (أو AMMD) من الغلاف الجذور الصحي للبازلاء واستخدم بعد ذلك كعامل للمكافحة الحيوية (Coenye et al. 2001 Chiarini et al.2006). نادرًا ما يتم عزل هذا النوع من مرضى التليف الكيسي ، حيث يتسبب في التهابات عابرة وغير قابلة للانتقال (Chiarini et al. 2006 Mahenthiralingam et al.2008). ومع ذلك ، فقد ثبت أن السلالة السريرية AU0212 نسيلي لـ AMMD ، مما يشير إلى أن البيئة تمثل مستودعًا للسلالات السريرية (باين وآخرون ، 2005). نظام QS الخاص بـ ب. أمبفاريا لم يدرس بالتفصيل. ومع ذلك ، فقد تم تضمينه في عدد قليل من الدراسات التي تقارن أعضاء مخفية الوجهة ، وكشف عن أنها تمتلك أيضًا نظام CepRI ، بالاعتماد على C6- HSL و C.8- جزيئات إشارة HSL (Lutter et al. 2001 Zhou et al.2003). النشاط التحلل للبروتين ، وتشكيل الأغشية الحيوية ، والفوعة تجاه الديدان الخيطية هي أنماط ظاهرية يتم التحكم فيها بواسطة QS ، ولكنها تبدو معتمدة على الإجهاد (Wopperer et al.2006). ومن المثير للاهتمام أن إنتاج الجزيئات المضادة للفطريات يتم التحكم فيه أيضًا بواسطة QS في هذا النوع Bcc (Zhou وآخرون 2003 Schmidt وآخرون 2009). لقد أجرينا دراسة النمط الظاهري وفحص الطفرات في الجينوم الكامل لتحديد الجينات التي تسيطر عليها QS ووظائف السريرية. ب. أمبفاريا سلالة أبلغنا عنها سابقًا (Vial et al. 2008 ، 2010). ستساهم هذه الدراسة في فهم الوظائف التي تنظمها QS في أنواع Bcc سيئة الضراوة مع خصائص التكنولوجيا الحيوية الكبيرة.


مقدمة

يشكل اكتساب وانتشار مقاومة المضادات الحيوية بين البكتيريا المسببة للأمراض تهديدًا كبيرًا للصحة العامة ، خاصة في ضوء ندرة المضادات الحيوية الجديدة التي يتم تطويرها [1]. وبالتالي ، هناك حاجة لمضادات جرثومية جديدة يمكن استخدامها كبدائل للمضادات الحيوية التقليدية. تعتبر الببتيدات المضادة للميكروبات والبكتريوسينات من البدائل المحتملة [2 ، 3]. البكتريوسينات عبارة عن ببتيدات مصنعة من الريبوسومات مع نشاط مضاد للميكروبات ينتج عن العديد من الأنواع البكتيرية. في معظم الحالات ، تمنع البكتريوسينات نمو البكتيريا وثيقة الصلة ، على الرغم من أن بعضها يظهر طيفًا مثبطًا واسعًا ضد تلف الطعام والبكتيريا المسببة للأمراض [4]. يتم تصنيع الغالبية العظمى من هذه الجزيئات مبدئيًا داخل الخلايا على شكل سلائف أكبر غير نشطة ، والعديد منها يخضع أيضًا لتعديلات إنزيمية مختلفة ، مثل التحلل والجليكوزيل وإدخال اللانثيونين وبيتا ميثيل لانثيونين [5]. وفقًا لأحدث مخطط التصنيف ، يمكن تقسيم البكتريوسينات إلى ثلاث مجموعات رئيسية [2 ، 6]. يتم تمثيل الفئة الأولى بواسطة الببتيدات المضادة للميكروبات التي تم تعديلها إنزيميًا من الفئة الثانية ، والتي تشمل الببتيدات غير المعدلة أو المعدلة بالحد الأدنى ، والتي تنقسم أيضًا إلى عدة مجموعات فرعية من الدرجة الثالثة ، تحتوي على بروتينات مضادة للميكروبات كبيرة غير معدلة حساسة للحرارة مع آلية للجراثيم أو آلية أخرى من العمل.

البكتيريا من الجنس عصية والأجناس ذات الصلة تنتج العديد من المواد ذات النشاط المضاد للميكروبات ، بما في ذلك الببتيدات المصنعة غير الريبوسومية والببتيدات الدهنية [7-9] ، مركبات البوليكيتيد [10] والبكتريوسينات. في الواقع، عصية سلالات تنتج البكتيريا من جميع الفئات الثلاث [11]. ممثلو الفئة الأولى هم subtilin و ericin A و ericin S و mersacidin و paenibacillin و sublancin 168 [11 و 12] و haloduracin و lichenicidin و subtilosin A [13-15]. تم العثور على بكتيريا الفئة الثانية في عصية سلالات تشمل coagulin ، التي تنتجها تجلط العصيات [16] ، lichenocin 50.2 ، التي تنتجها ب. حزاز الشكل VPS50.2 [17] وآخرون [18]. في عصية، يتم تمثيل الفئة الثالثة ببروتينات كبيرة لها نشاط إنزيمي ، مثل عائلة megacin من البكتيريا التي تنتجها سلالات من Bacillus megaterium [18–20].

المركبات المضادة التي تنتجها البكتيريا من الجنس Brevibacillus كما تمت دراستها في السنوات الأخيرة [21] وسلالات Brevibacillus laterosporus هم منتجون معروفون للعوامل المضادة للبكتيريا والفطريات [22-24]. تعتبر أداة مهمة للمكافحة البيولوجية بسبب خصائصها المبيدات الحيوية ضد الحشرات والديدان الخيطية [25 ، 26]. تميزت مؤخرا Br. لاحقة OSY-I1 ينتج brevibacillin ، وهو ببتيد شحمي مضاد للميكروبات 1583 Da بهيكل خطي يحتوي على 13 من الأحماض الأمينية و C6 الأحماض الدهنية عند الطرف N [27]. يُظهر Brevibacillin نشاطًا قويًا مضادًا للميكروبات ضد بعض البكتيريا المسببة للأمراض وتلف الطعام ، وخاصة البكتيريا المقاومة للميثيسيلين المكورات العنقودية الذهبية, الليسترية المستوحدة و بكتيريا سيريوس العصويه. تعتمد آلية عمل هذا الجزيء على الأرجح على طبيعته البرمائية وقدرة الأحماض الأمينية الموجبة على التفاعل مع الدهون الفسفورية سالبة الشحنة لغشاء الخلية ، مما يتسبب في تمزق الغشاء وإزالة الاستقطاب [27]. لوحظت آلية مماثلة في حالة البينيباكتيرين ، وهو ببتيد شحمي واسع الطيف مضاد للميكروبات ينتج عن Paenibacillus thiaminolyticus [28]. بالإضافة إلى ذلك وجد أن البكتريا البحرية المعزولة Brevibacillus laterosporus أظهر PNG-276 نشاطًا واسع النطاق للمضادات الحيوية (إنتاج بوليكيتيدات البازيليسكاميدات A و B والببتيدات غير الصبغي: loloatins A-D و bogorols A-E) ضد مسببات الأمراض البشرية MRSA ، VRE ، السل الفطري, المبيضات البيض، و الإشريكية القولونية [29].

من منظور البكتريوسين ، يعد اللاتوسبورولين مثالًا على بكتريوسين من الفئة IId ينتج عن سلالة GI-9 ، تم تحديدها مسبقًا على أنها Br. لاحقة [30]. Laterosporulin نشط ضد البكتيريا موجبة الجرام وسالبة الجرام ووجد أنه مقاوم لمجموعة من الإنزيمات المحللة للبروتين. كشفت الدراسات الهيكلية أن الببتيد يتكون من صفائح β ملتوية ويتضمن ثلاثة روابط ثاني كبريتيد [31]. Laterosporulin غني نسبيًا بالسيستين والأحماض الأمينية القطبية ، وهو أمر غير نمطي للبكتريوسينات بشكل عام ، بينما أظهر تركيبه تشابهًا مع ديفينسينس الثدييات. في الآونة الأخيرة ، لاحقة الأبواغ 10 ، التي تنتجها السلالة Brevibacillus ص. تم تمييز SKDU10 [32] وعلى الرغم من اعتباره متشابهًا ، إلا أنه يظهر فقط 57.6 ٪ من الهوية مع لاتيروسبورولين. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي هذا البكتريوسين الجديد على طيف مضاد للميكروبات مختلف عن لاتيروسبورولين حيث يقتصر نشاطه على البكتيريا موجبة الجرام. ومع ذلك ، فقد أثبت اللاتوسبورولين 10 أيضًا أنه جزيء جديد واعد مضاد للسرطان يُظهر تأثيرًا سامًا للخلايا على الخلايا السرطانية [33].

عدد من Br. لاتيروسبوروس تم تسلسل السلالات وترسبت جينوماتها في Genbank. وتشمل هذه LMG 15441 (تحت رقم المُدخل AFRV00000000 ، [34]) ، GI-9 (تحت أرقام المُدخل CAGD01000001 إلى CAGD01000061 ، [35]) ، B9 (تحت أرقام المُدخل CP011074-CP011076 ، [36]) ، لاك 1210 (تحت الانضمام رقم NDIP00000000 ، [37]) ، OSY-I1 (تحت رقم المُدخل NOLX00000000 ، [38]) ، DSM25 (رقم المُدخل ARFS00000000) ، ZQ2 ، UBA5783 ، DSM25 ، PE36 (رقم المُدخل NZ_AXBT00000000.1) و Uniss_18.

ركزت الدراسة الحالية على عزل البكتيريا الجديدة القابلة للزراعة التي تنتج جزيئات طبيعية مضادة للميكروبات فعالة ضد مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة للإنسان والحيوان والنبات ، بغض النظر عن تصنيفها. يؤدي هذا النهج إلى توصيف وتحديد النشاط المضاد للميكروبات لثلاث سلالات معزولة جديدة من Br. لاحقة من السيلاج من أجل تحديد إمكاناتها كعوامل للمكافحة الحيوية.


نتائج

اختيار البكتيريا المهينة من AHL

تم عزل 450 سلالة تمت دراستها في هذا البحث من مفرخ للأسماك في Salobre & # x000f1a (غرناطة ، إسبانيا) وتم اختيارها على أساس شكل مستعمراتها المختلفة. لقد أجرينا فحصًا أوليًا لنشاط تحلل AHL للعزلات في 96 طبقًا ميكروتيترًا جيدًا في وجود AHLs التجاري مع سلاسل الأحماض الدهنية بأطوال مختلفة (C6- HSL و C.10- HSL انظر المواد والطرق). تم اكتشاف AHLs المتبقية في الوسائط باستخدام سلالات المستشعر الحيوي C. فيولاسيوم CV026 (الشكل التكميلي S1) ، الذي ينتج الكمان في وجود AHLs مع سلاسل الأحماض الدهنية القصيرة والمتوسطة و C. فيولاسيوم VIR07 (الشكل التكميلي S1) ، والذي ينتج عنه صبغة فيولاسين في وجود C10- HSL. لقد وجدنا أن المواد الطافية المرتبطة بـ 112 سلالة لم تنشط سلالتي المستشعرات الحيوية المستخدمة مما يعني أنها تحطمت كلاً من C6- HSL و C.10- HSL. أجريت هذه التجارب في ثلاث نسخ وحصلنا على نفس النتائج. أجريت جميع التجارب عند الرقم الهيدروجيني 7 لمنع تحلل اللاكتون في AHL (الذي يحدث عند الأس الهيدروجيني الأساسي) وتعطيل أجهزة الاستشعار الحيوية ، مما أعطى نتائج إيجابية خاطئة (Yates et al. ، 2002).

كفحص ثانٍ ، تم إجراء اختبار لوحة أجار جيد الانتشار للبكتيريا المختارة أعلاه 112 في وجود سبعة AHLs تجارية (C4-هسل ، سي6-هسل ، سي8-هسل ، سي10-هسل ، سي12- HSL ، 3-أوكسو سي12-هسل ، و 3-أوه-ج10-HSL). كانت النتيجة اختيار 12 سلالة مع القدرة على تحطيم مجموعة واسعة من AHLs. كما هو موضح في جدول & # x200B جدول 1 1 تتحلل السلالات الـ 12 من AHLs المتوسطة والطويلة السلسلة بشكل أو بآخر ، بما في ذلك AHLs غير المستبدلة ، Oxo- والهيدروكسيل المستبدلة. ومع ذلك ، لا يظهر أي منهم نشاط QQ ضد C4- HSL.

الجدول 1

نشاط إخماد النصاب (QQ) للبكتيريا البحرية المختارة والتعريف التصنيفي.

أضنىج4- HSLج6- HSLج8- HSLج10- HSLج12- HSL3-أوكسو سي12- HSL3-أوه-ج10- HSLتحديد التصنيف٪ هوية
PQQ-1-+++++++++-الزائفة الزائفة paragorgicola99.78%
PQQ-5-++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis99.7%
PQQ-8-+++++++++-Alteromonas stellipolaris99.59%
PQQ-18-+++++++++-Pseudoalteromonas carrageenovora99.7%
PQQ-20-++++++++++-Pseudoalteromonas atl & # x000e1ntica99.44%
PQQ-31-++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis100%
PQQ-33-++++++++++-Alteromonas genovensis99.6%
PQQ-37-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-39-+++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis99.48%
PQQ-42-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-44-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-84-+++++++++-الزائفة الزائفة المميزة99.7%

توصيف نشاط تدهور AHL بواسطة HPLC-MS

طبقنا تحليل HPLC-MS لمزيد من التأكيد على تدهور AHL بواسطة سلالات محددة من AHL. لهذا الغرض اخترنا AHL متوسط ​​وطويل السلسلة (C6- HSL و C.10-HSL). أشارت النتائج إلى أن السلالات الـ 12 المختارة كانت قادرة على تقليل تركيز كلا النوعين من AHLs بشكل ملحوظ على الرغم من أن هذه السعة كانت أعلى ضد C.10-HSL (البيانات غير معروضة). بناءً على هذه النتائج جنبًا إلى جنب مع تلك التي تم الحصول عليها من فحوصات لوحة أجار جيدة الانتشار (جدول & # x200B جدول 1 1 ) ، تم اختيار السلالة PQQ-42 للدراسات اللاحقة.لقد أدى إلى تدهور جميع مستويات AHL التي تم فحصها ، مما أظهر نشاطًا يقارب 100 ٪ في جميع الحالات (الشكل & # x200B الشكل 1 1 ).

تحليل كروماتوجرافي سائل عالي الأداء بالإضافة إلى قياسات تحليل مطياف الكتلة (HPLC-MS) لـ C.6- HSL و C.10- HSL في وسائط الثقافة الخالية من الخلايا في ن- لاكتونات اسيلهوموسرين (AHL) - سلالة متدهورة PQQ-42 بعد 24 ساعة. تم استخدام وسيط MB الخالي من الخلايا كعنصر تحكم سلبي. كان تركيز AHL الأولي 10 & # x003bcM. تمثل أشرطة الخطأ انحراف معياري واحد.

التعريف التصنيفي لسلالات مختارة

لتحديد البكتيريا المهينة لـ 12 AHL ، حددنا تسلسل الجين 16S rRNA. تشترك التسلسلات في تناظرات عالية مع تلك الخاصة ببعض الأنواع من الأجناس التيروموناس (خمس سلالات) و الزائفة الزائفة (سبع سلالات) (جدول & # x200B جدول 1 1 ) بالمقارنة مع التسلسل الجيني 16S rRNA المرجعي الذي تم الحصول عليه من قواعد بيانات GenBank و EMBL باستخدام بحث BLAST وبرنامج EzTaxon-e EzBioCloud.

سلالة PQQ-42 تحط من مقتطفات AHL من مسببات الأمراض فيبريو النيابة.

للتأكد من إمكانية استخدام السلالة PQQ-42 في الجسم الحي لتعطيل أنظمة QS للبكتيريا الأخرى ، قمنا أولاً بتقييم قدرتها على تحلل AHLs التي تنتجها مسببات الأمراض المرتبطة بتربية الأحياء المائية فيبريو سلالات في المختبر. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتقييم نشاط QQ للسلالة PQQ-42 ضد المستخلصات الخام للسلالات الأربعة المسببة للأمراض. V. anguillarum ATCC 19264 T ، خامسا نيجريبولتشريتودو CIP 103195 T ، خامسا ميتشنيكوفي NCTC 8483 T و V. البحر الأبيض المتوسط VibC-Oc-097. تم اختبار الكميات المتبقية من AHLs عن طريق مقايسات لوحة أجار الانتشار (الشكل & # x200B الشكل 2 2 ) ثم تم تحليلها بواسطة TLC الذي أكد نشاط QQ (البيانات غير معروضة). استخدمنا سلالات جهاز استشعار حيوي A. الورم NTL4 (pZLR4) لاكتشاف AHLs المتوسطة والطويلة السلسلة و C. فيولاسيوم CV026 ، الذي يتم تنشيطه في وجود AHLs قصير ومتوسط ​​السلسلة (البيانات غير معروضة). لم نتمكن من اكتشاف جزيئات AHL في جميع الاختبارات فيبريو مستخلصات خام.

تدهور النشاط بواسطة سلالة PQQ-42 من AHLs الناتجة عن مسببات الأمراض فيبريو النيابة. تصور على فحص لوحة أجار عن طريق سلالة المستشعر الحيوي أغروباكتريوم توميفاسيانز NTL4 (pZLR4). تمت إضافة وسيط MB الخالي من الخلايا بامتداد Vibrio mediterranei مقتطفات VibC-Oc-097 AHL (التحكم أ). تمت إضافة ثقافة السلالة PQQ-42 مع V. البحر الأبيض المتوسط مقتطفات VibC-Oc-097 AHL (ب). تمت إضافة وسيط MB الخالي من الخلايا بامتداد خامسا ميتشنيكوفي مستخلصات NCTC 8483 T AHL (تحكم ج). تمت إضافة ثقافة السلالة PQQ-42 مع خامسا ميتشنيكوفي مستخلصات NCTC 8483 T AHL (د). شريط مقياس ، 1 سم.

نوع وموقع نشاط تدهور AHL في PQQ-42

لاكتشاف ما إذا كان نشاط QQ ناتجًا عن إنزيم من نوع اللاكتوناز ، قمنا بتحميض المواد الطافية لثقافات السلالة PQQ-42 بعد الحضانة باستخدام AHLs المختلفة التي تم اختبارها (C6-هسل ، سي8-هسل ، سي10-هسل ، سي12- HSL ، 3-أوكسو سي12-هسل ، و 3-أوه-ج10-HSL). يسمح هذا التحمض لحلقة اللاكتون بإعادة هيكلة نفسها في حالة فتحها سابقًا بواسطة اللاكتوناز. كان استرداد تركيز AHL بعد تحميض الثقافات غير مهم مقارنةً بالتحكم السلبي (تمت إضافة MB بنفس الكمية من AHLs وتحمض في نفس الظروف الشكل التكميلي S2). يشير هذا إلى أن نشاط تحلل السلالة PQQ-42 قد يكون بسبب نشاط إنزيم مختلف عن اللاكتوناز.

لتحديد الموقع الخلوي للإنزيم ، تم الحصول على المادة الطافية و CCE من ثقافات السلالة PQQ-42 وأجريت فحوصات تدهور AHL معهم في وجود C6-هسل ، سي8-هسل ، سي10-هسل ، سي12- HSL ، 3-أوكسو سي12-هسل ، و 3-أوه-ج10- HSL. تم تعديل تركيز البروتين في كل من المادة الطافية و CCE مسبقًا إلى 35 & # x003bcg mL -1. تم العثور على نشاط QQ للسلالة المختارة في CCE في جميع الحالات ولكن لم يتم العثور على أي نشاط في وسائط الثقافة الخالية من الخلايا (الشكل التكميلي S3).

سلالة PQQ-42 تحط من AHLs وتقلل من نشاط البروتياز وحركة فيبريو الأنواع في الثقافة المشتركة

من أجل إجراء تجارب الثقافة المشتركة ، قمنا أولاً بتقييم ما إذا كانت السلالة المهينة من AHL المحددة PQQ-42 تتداخل مع نمو السلالات الأربعة المسببة للأمراض V. anguillarum ATCC 19264 T ، خامسا نيجريبولتشريتودو CIP 103195 T ، خامسا ميتشنيكوفي NCTC 8483 T و V. البحر الأبيض المتوسط VibC-Oc-097 من خلال تجربة عداء (انظر المواد والطرق). تشير نتائجنا إلى أن PQQ-42 لم يكن له أي تأثير سلبي على نمو أي من فيبريو سلالات تم اختبارها (البيانات غير معروضة). وهكذا ، تمت تنمية PQQ-42 في SFSWYE لإجراء تجارب الثقافة المشتركة مع كل من مسببات الأمراض الأربعة. فيبريو سلالات بستة نسب مختلفة (انظر المواد والطرق). بعد 24 ساعة من الحضانة ، تم استخراج AHL من الثقافات المشتركة وفحصها باستخدام جهاز الاستشعار الحيوي A. الورم NTL4. تم الحصول على أفضل النتائج عند 10 2 CFU mL -1 من ثقافة بين عشية وضحاها لأي من فيبريو تمت إضافة السلالات التي تم فحصها إلى ثقافة بين عشية وضحاها من 10 5 CFU mL -1 من PQQ-42. لم يتم الكشف عن AHLs في كل تجربة زراعة. تم الحفاظ على هذه النسبة طوال تجارب الثقافة المشتركة ، كما تم تأكيده من خلال عدد الصفائح في TCBS (حيث فيبريو تنتج مستعمرات صفراء اللون) و MA (حيث فيبريو ينتج مستعمرات بيضاء ناعمة وينتج PQQ-42 مستعمرات بيضاء مقعرة).

كما تم استخدام الثقافات المشتركة في هذه النسبة لتقييم تأثير تدهور AHL على عوامل الفوعة التي تنتجها العوامل الممرضة الأربعة. فيبريو سلالات. باستخدام فحوصات مختلفة (انظر المواد والطرق) ، وجدنا أن أنماطًا مختلفة من فيبريو تأثرت سلالات تحت ظروف الفحص لدينا (جدول & # x200B جدول 2 2 ) ، مثل نشاط الأنزيم البروتيني وحركة السباحة V. البحر الأبيض المتوسط VibC-Oc-097 (الشكل التكميلي S4).

الجدول 2

الأنماط الظاهرية لـ فيبريو سلالات بعد الثقافة المشتركة مع سلالة AHL المهينة PQQ-42.

النمط الظاهريVibrio mediterraneiVibrio mediterranei + PQQ-42Vibrio anguillarumVibrio anguillarum + PQQ-42Vibrio nigripulchtritutdoالضمة السوداء + PQQ-42فيبريو ميتشنيكوفيفيبريو ميتشنيكوفي + PQQ-42
AHLs++-++-++-++-
الحركة++++++++++++
انحلال الدم+++++++++++++++
البروتياز+++++++--+++
الأميليز--+++--+-
دناز+++++++++++++
الكيتيناز+-++++++-
ليباز (توين 20)+++++++++++++
ليباز (توين 80)++++++++++++
ليباز (تريبوترين)--------
حورس--------
بيوفيلم++++++++++++++++

السلالة PQQ-42 يقلل من ضراوة Vibrio mediterranei على المرجان أوكولينا باتاغونيكا

في الجسم الحي أجريت فحوصات على مستعمرات الشعاب المرجانية الصلبة O. باتاغونيكا باستخدام سلالة PQQ-42. تمت معالجة الشعاب المرجانية بالسلالة PQQ-42 و V. البحر الأبيض المتوسط أظهر VibC-Oc-097 تلفًا أقل للأنسجة من المصابين بـ فيبريو سلالة وحدها (الشكل & # x200B الشكل 3A 3A ) ، كما نرى ينعكس في مستويات الكلوروفيل المكتشفة في الأنسجة المرجانية (الشكل & # x200B الشكل 3 ب 3 ب ). تشير هذه النتيجة إلى أن السلالة PQQ-42 تقلل بشكل كبير من الإمراضية V. البحر الأبيض المتوسط VibC-Oc-097 فوق المرجان O. باتاغونيكا تظهر درجة أقل من تلف الأنسجة (29.25 & # x000b1 14.63٪) في وجودها ، مقارنة بوقت إصابة المرجان. V. البحر الأبيض المتوسط VibC-Oc-097 وحده (77.53 & # x000b1 13.22٪). علاوة على ذلك ، كانت مستويات الكلوروفيل أ متشابهة في الشعاب المرجانية الضابطة وفي الشعاب المرجانية المعالجة بسلالة PQQ-42 (الشكل & # x200B الشكل 3 ب 3 ب ) ، مما يدل على أن هذه البكتيريا لا تسبب أي ضرر O. باتاغونيكا (الشكل & # x200B الشكل 3A 3A ).

أوكولينا باتاغونيكا المستعمرات المرجانية بعد العلاج لمدة 10 أيام & # x02019 تظهر المدى المتفاوت للتبييض اعتمادًا على البكتيريا المضافة [1: وسيط MB الخالي من الخلايا (تحكم) ، 2: PQQ-42 ، 3: PQQ-42 +V. البحر الأبيض المتوسط VibC-Oc-097 ، 4: V. البحر الأبيض المتوسط VibC-Oc-097]. شريط مقياس ، 1 سم (أ). مستويات الكلوروفيل أ (ب) وعدد الضمات (CFU g -1 ج) في نسيج O. باتاغونيكا بعد العلاج 5 و 10 أيام و # x02019s. تمثل أشرطة الخطأ انحراف معياري واحد. المجموعات المحددة بواسطة آخر مخصص اختبار SNK بعد ANOVA (صتم إنجاز القيمة & # x0003c 0.05) وتم عرضها بالأرقام.

فيما يتعلق بعدد CFU من فيبريو في الماء (الشكل التكميلي S5) وفي الأنسجة المرجانية (الشكل & # x200B الشكل 3C 3C ) ، يمكننا أن نرى أن إضافة السلالة PQQ-42 لم تؤثر على نمو السلالة المسببة للأمراض.


الملخص

متماثلات CsrA / RsmA هي عائلة واسعة من البروتينات الرابطة للحمض النووي الريبي (RNA) التي تعمل كمنظم عالمي لما بعد النسخ يتحكم في العمليات الخلوية المهمة مثل التمثيل الغذائي الثانوي ، والحركة ، وتشكيل الأغشية الحيوية وإنتاج وإفراز عوامل الفوعة في الأنواع البكتيرية المتنوعة . بينما تمت دراسة ارتباط الحمض النووي الريبي المرسال المباشر بواسطة CsrA / RsmA بالتفصيل لبعض الجينات ، فمن المتوقع أن هناك العديد من الأهداف المباشرة الإضافية ، والتي لم يتم اكتشافها بعد ، والتي تتوسط في تنظيمها العالمي. للمساعدة في اكتشاف هذه الأهداف ، نقترح نهجًا قائمًا على التسلسل للتنبؤ بالجينات التي تنظمها هذه الهيئات التنظيمية بشكل مباشر. في هذا العمل ، نقوم بتطوير رمز كمبيوتر (CSRA_TARGET) لتنفيذ هذا النهج ، مما يؤدي إلى تنبؤات للعديد من الأهداف الجديدة في الإشريكية القولونية و الزائفة الزنجارية. الأهداف المتوقعة في البكتيريا الأخرى على وجه التحديد السالمونيلا المعوية التيفيموريوم المصلي، بكتوبكتيريوم كاروتوفوروم و البكتيريا المستروحة، تشمل أيضًا المنظمين العالميين الذين يتحكمون في الفوعة في مسببات الأمراض هذه ، مما يؤدي إلى تفكيك الأدوار التنظيمية غير المباشرة المعقدة لـ CsrA / RsmA. لقد تحققنا تجريبيًا من صحة أربعة أهداف RsmA متوقعة في P. الزنجارية. يمكن أن يؤدي النهج القائم على التسلسل الذي تم تطويره في هذا العمل إلى عدة تنبؤات قابلة للاختبار للأهداف المباشرة لمثيلات CsrA ، وبالتالي استكمال وتسريع الجهود لكشف التنظيم العالمي من خلال هذه العائلة المهمة من البروتينات.


الفحص الوظيفي

إنها القدرة على اكتشاف وعزل وتوصيف الجينات المعبر عنها في مكتبة ميتاجينومية تحدد نجاح أي تقييم ميتاجينومي قائم على الوظيفة. يمكن استخدام مجموعة واسعة من طرق الفرز (ملخصة في الشكل 1). من بين هؤلاء ، تم تمييز ثلاث استراتيجيات عامة للكشف (Simon and Daniel 2009):

كشف إدراج النمط الظاهري (PID) ، حيث يتم استخدام التعبير عن سمة معينة لتحديد الحيوانات المستنسخة الإيجابية

الكشف المعدَّل (MD) ، استراتيجية تعتمد على إنتاج منتج جيني ضروري للنمو في ظل ظروف انتقائية

تحريض الركيزة ، وهي استراتيجية تعتمد على التعبير المستحث عن الجينات المستنسخة عبر ركيزة معينة

على الرغم من التمييز بين استراتيجيات الكشف الثلاث هذه ، إلا أن تصنيفها في مجموعات منفصلة سيكون غير صحيح. في كثير من الأحيان ، يتم استخدام مزيج منهم من أجل إجراء الفحص وتحسينه. على سبيل المثال ، يمكن دمج اكتشاف النمط الظاهري من خلال جين مراسل GFP مع التعبير الناجم عن الركيزة لجين الإدراج (Uchiyama et al.2005).

PID هو النهج الأكثر استخدامًا للفحص الوظيفي للمكتبات الميتاجينومية. تعتمد الشاشة على اكتشاف سمات نمطية معينة. تعد شدة (مستوى) التعبير الجيني قضية مهمة هنا حيث يمكن بسهولة تفويت إشارات التعبير الخافتة في الفحوصات عالية الإنتاجية. يتم تقديم مساعدة محتملة من خلال نهج ميكروفلويديك باستخدام أحجام نانوليتر. يمكن أن توفر هذه حساسية متزايدة للمقايسة حيث أن هناك حاجة إلى منتج جيني أقل لإنتاج نمط ظاهري يمكن اكتشافه (Taupp et al. 2011).

يمكن اكتشاف سمات نمطية محددة بطرق متعددة. تعتمد الطريقة الأولى على التعبير المباشر ، على سبيل المثال ، عن طريق الكشف عن التصبغ أو مورفولوجيا المستعمرة (Brady 2007) ، وكلاهما قد ينتج مباشرة من الجين المُدخل المُعبر عنه (Craig et al. 2010 LeCleir et al.2007). طريقة أخرى هي التفاعل (غير المباشر) أو تفاعل مادة مضافة مع منتج الجين المعبر عنه أو منتج نتيجة لهذا التعبير. أخيرًا ، يمكن أن يعتمد الاكتشاف على التعبير المشترك لجين المراسل المرتبط بالجين المستهدف في المكتبة. تم تطوير مجموعة متنوعة من الأساليب بناءً على هذه الاستراتيجيات الثلاث ، والتي سيتم مناقشة أبرزها أدناه.

الكشف المباشر

الاكتشاف البصري هو طريقة فحص نمطية واضحة ومباشرة نسبيًا و "منخفضة التقنية". ومع ذلك ، فهي أيضًا كثيفة العمالة. تعمل طريقة الفرز هذه عن طريق النسخ الإيجابية التي تعرض سمة (كنتيجة للتعبير عن جين المكتبة) والتي يمكن ملاحظتها مباشرة. ومن الأمثلة على هذه السمات التي يمكن ملاحظتها تصبغ المستعمرة ، أو مورفولوجيا المستعمرة غير المنتظمة ، أو تشكيل الهالة على تراكبات الألواح. إن اقتران طريقة الكشف المباشر هذه بتقنيات عالية الإنتاجية ، مثل تلك التي توفرها 384 لوحة جيدة ، وروبوتات انتقاء المستعمرات وقارئات الصفيحة الدقيقة ، لا تقصر وقت المعالجة فحسب ، بل تعزز أيضًا موثوقية وقابلية المقارنة للفحوصات التي يتم إجراؤها على الحيوانات المستنسخة المختلفة. عيب هذه الطريقة هو الدقة أو الحساسية المنخفضة نوعًا ما. على سبيل المثال ، إذا كان التعبير منخفضًا في استنساخ إيجابي معين ، فقد لا يمكن اكتشاف سمة النمط الظاهري بسهولة ، مما يؤدي إلى رفض غير صحيح للنسخ الإيجابية "العتبة الفرعية". علاوة على ذلك ، لا تسمح الطريقة بإعطاء التوجيه للشاشة. في دراسة حديثة (Craig et al. 2010) ، تم فحص الحيوانات المستنسخة بإنتاجية عالية في مضيفين متعددين بناءً على السمات المظهرية الثلاثة المذكورة أعلاه. تم اختيار هذه السمات بناءً على حقيقة أنها مرتبطة بشكل شائع بإنتاج الجزيئات الصغيرة (Craig et al. 2010). يوضح هذا حقيقة أن هذه الأساليب أكثر ملاءمة لاستكشاف واسع النطاق للميتاجينوم للسمات متعددة التغذية من البحث الموجه عن مسار أو مستقلب معين.

متوسط ​​المؤشر

يشكل استخدام وسيط المؤشر طريقة مباشرة لاكتشاف جزيئات صغيرة معينة أو تفاعلات كيميائية أو قدرات أيضية أو تقويضية أو مضاد حيوي للنسخة. إنها طريقة اكتشاف شائعة نظرًا لمدى ملاءمتها للتطبيق عالي الإنتاجية ، فضلاً عن قابليتها للعديد من التجارب ، بدءًا من الفحوصات الواسعة لمنتجات الجينات المتنوعة إلى عزل قدرات التمثيل الغذائي المحددة للغاية (De Vasconcellos et al. 2010 Fan et al. 2011 Morohoshi et al. 2011 Tirawongsaroj et al. 2008). علاوة على ذلك ، فإن الحساسية النسبية لهذه الطريقة تسمح لها باكتشاف التغيرات ، على سبيل المثال ، الأس الهيدروجيني عند مستويات التعبير المعتدلة ، خاصة عند دمجها مع الموائع الدقيقة القائمة على القطيرات ، حيث يمكن الوصول بسهولة إلى التركيزات التي يمكن اكتشافها بسبب الحجم الصغير المستخدم.

من الأمثلة الجيدة على استخدام وسيط المؤشر في عمليات الفحص عزل البروتياز المعدني الجديد من مكتبات metagenomic باستخدام ألواح مملوءة بالحليب. استندت الشاشة إلى اكتشاف نشاط التحلل البروتيني في بكتريا قولونية الحيوانات المستنسخة ، والتي تمنح القدرة على تحلل بروتينات الحليب. تم تحضين استنساخ المكتبة على ألواح أجار تحتوي على حليب منزوع الدسم وتم اكتشاف نشاط تحلل البروتين من خلال تكوين هالات صافية على الألواح (Waschkowitz et al. 2009).

يحمل استخدام وسائط المؤشر وعدًا كبيرًا حيث يمكن مراقبة التعبير الناجح للجينات الأجنبية في المضيف بسهولة وبإنتاجية عالية. الاعتماد على التعبير الناجح للجينات الأجنبية من أجل الاكتشاف قد ينتج عنه كميات منخفضة من الضربات الإيجابية ولكنه يعطي ضمانًا بأن الجين يعمل في مضيف الميتاجينوم. ومع ذلك ، فإن المشكلة هي أن الإنزيمات المستهدفة يتم التعبير عنها فقط داخل الخلايا في مضيف الميتاجينوم ، وقد لا يكون غشاء الخلية بالضرورة نافذًا لمواد المؤشر الموجودة في الوسط. ومن ثم ، فإن إفراز منتج الجين ضروري للكشف. علاوة على ذلك ، يمكن أن تنشأ مشاكل أخرى ، مثل الانهيار الأنزيمي أو تراكم المنتجات داخل الخلايا (Sørensen and Mortensen 2005) ، والتي يمكن أن تؤدي إلى السمية. قد يحتفظ تحلل الخلايا القسري بالمحلول ، لأنه قد يؤدي إلى تلامس مادة المؤشر مع البروتينات المستهدفة داخل الخلايا (Bao et al. 2011). ومع ذلك ، ينبغي الحرص على عدم إفساد البروتينات المعبر عنها بواسطة عوامل lysing حيث قد يتم فقد نشاط البروتين بالإضافة إلى تفاعله مع ركيزة المؤشر. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون الاضطراب الميكانيكي للخلية مستهلكًا للوقت ويتطلب جهدًا كثيفًا. إحدى الطرق الممكنة لتجنب ذلك هي استخدام ناقل ذاتي التحلل. لي وآخرون. (2007) طور ناقل ذاتي للتحفيز بالأشعة فوق البنفسجية لاستخدامه في عمليات الفحص عالية الإنتاجية. ان SRRz تم إدخال جينات تحلل الكاسيت في اتجاه مجرى محرك محفز للأشعة فوق البنفسجية في بكتريا قولونية. تم اختبار كفاءة تحلل الخلية عن طريق التعبير عن β-galactosidase في بكتريا قولونية قبل تحريض الأشعة فوق البنفسجية. بعد التحلل الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية ، تمت مقارنة نشاط جالاكتوزيداز خارج الخلية (طاف) مع إجمالي نشاط جالاكتوزيداز داخل الخلايا (الحبيبات) وخارج الخلية لقياس كفاءة التحلل. لوحظ كفاءة تحلل بنسبة 60٪ أو أكثر عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. هذا مشابه للعلاج التقليدي بالليزوزيم. ومع ذلك ، عند 37 درجة مئوية ، كان معدل التحلل أقل اتساقًا. وبالتالي ، قد يوفر استخدام ناقل التحلل الذاتي هذا بديلاً بسيطًا لتقنيات التحلل الحالية (Li et al.2007).

بالإضافة إلى الشاشة المستندة إلى بيتا جالاكتوزيداز ، فقد ثبت أن العديد من تقنيات المراسل الكروموجينية والفلورية الأخرى فعالة في تحديد أنشطة الإنزيمات المشفرة بواسطة الجين (الجينات) المُدخلة. LeCleir et al. (2007) وهكذا أظهر وجود إنزيمات الكيتين في مكتبة metagenomic مصبات الأنهار عن طريق انقسام نظائر الكيتين الفلورية.

لا يعتمد MD على الاكتشاف المباشر للجين المعبر عنه ، ولكنه يستخدم طريق تعبير مصمم مسبقًا. من خلال تعديل مضيف التعبير و / أو أنظمة ناقلات ، يمكن التلاعب باختيار واكتشاف الجينات المُدخلة ، على سبيل المثال عن طريق تضافر جينات المراسل أو التكامل غير المتجانسة. ينتج عن هذا فحوصات أكثر تحديدًا وإشارات موحدة قابلة للاكتشاف.

جينات المراسل

يعد استخدام جينات المراسل طريقة مناسبة للفحوصات عالية الإنتاجية. ال لاكز الجين المشفر بيتا جالاكتوزيداز (مما يؤدي إلى تلوين المستعمرة عند النمو إكس غال-متوسط ​​الحاوية) كثيرا ما يستخدم كجينة مراسل. في تجربة لفحص الحيوانات المستنسخة الميتاجينومية التي تحتوي على الجينات التي تتداخل مع استشعار النصاب (QS) ، تم استخدام هذا الجين المراسل. تم تحقيق الفرز عن طريق قياس التدهور المحتمل لجزيئات إشارات QS. ان A. الورم سلالة تحتوي على أ تراي لاكز تم استخدام اندماج الجينات في الفحص. عن طريق تحفيز ال traI الجين مع جزيء إشارة QS homoserine lactone 3-أوكسو سي 8 - HSL, لاكز انه مفعل. ينتج عن هذا إنتاج بيتا جالاكتوزيداز ، مما ينتج عنه مستعمرات زرقاء. ولكن إذا، 3-أوكسو سي 8 - HSL تم تقسيمه من قبل المضيف ، لاكز يتم منع الاستقراء ولا يظهر لون أزرق. سيكون هذا مؤشرا على نشاط مثبط لاستشعار النصاب أو تدهور للنسخة. أسفرت التجربة عن 438 مستنسخة إيجابية تظهر تثبيط QS (شيبر وآخرون 2009).

الميزة الكبيرة لهذا النهج هي أن اكتشاف الحيوانات المستنسخة الإيجابية لا يعتمد على التعبير الناجح لمنتج جيني في نهاية عملية النسخ. كما أن التعبير الخافت المحتمل للجين المُدخل لا يعيق الكشف ، كما قد يحدث في طرق الكشف الأخرى. يمكن أن يكون هذا مفيدًا جدًا عند البحث عن الجينات التي قد يكون من الصعب التعبير عنها في المضيف.

تكملة غير متجانسة (HC)

يعتمد التكملة غير المتجانسة (HC) على استكشاف الجينات الأجنبية لتحقيق التكامل الجيني في المضيف ، مما يؤدي إلى التعبير عن منتج جيني ضروري للنمو في ظل ظروف انتقائية. تسمح هذه التقنية بانتقائية كبيرة ، وبالتالي ، يمكن توجيه الشاشة بدقة للبحث عن جينات معينة (Kellner et al. 2011 Simon et al.2009). مثال قدمه Simon et al. (2009) الذي قام بفحص مكتبات metagenomic plasmid و fosmid المشتقة من الجليد الجليدي لجينات ترميز DNA polymerase. تم تحقيق ذلك باستخدام ملف بكتريا قولونية سلالة تحمل طفرة حساسة للبرودة في مجال نوكلياز خارجي 5′ – 3 لبوليميراز الدنا I ، وهي مادة قاتلة عند درجات حرارة أقل من 20 درجة مئوية. من خلال تنمية الحيوانات المستنسخة على لوحات تحتوي على مضاد حيوي متوافقة مع مقاومة ناقلات الأمراض ، عند درجة حرارة 18 درجة مئوية ، يمكن تحديد الحيوانات المستنسخة الإيجابية التي تكمل الطفرة القاتلة. باستخدام هذا النهج ، تم استرداد 17 بلازميد و 1 فوسميد مع النمط الظاهري المطلوب من مكتبة النسخ. أشار تحليل تسلسل تسعة مستنسخات إيجابية إلى أنه تم بالفعل عزل جينات DNA polymerase من المكتبة. مع الأخذ في الاعتبار الطبيعة المحفوظة لجينات بوليميريز الحمض النووي ودرجة التماثل مع جينات بوليميريز الحمض النووي المعروفة ، أدت هذه النتيجة إلى استنتاج مفاده أن الجينات قد تم استردادها من كائنات دقيقة لم يتم استكشافها بعد (Simon et al. 2009).

مثال آخر على HC يتم توفيره من خلال دراسة حاولت عزل جينات lysine racemase الجديدة من metagenome (Chen et al. 2009). ان بكتريا قولونية تم استخدام سلالة تحمل طفرة lysine auxotrophy لفحص الجينات المذكورة أعلاه في مكتبة metagenomic مشتقة من تربة الحديقة. نمت الحيوانات المستنسخة على وسط مكمل بالليسين. نظرًا لأن الحيوانات المستنسخة المؤتلفة الناجحة فقط هي التي ستكون قادرة على تقويض d -lysine ، فإن الحيوانات المستنسخة غير الناجحة سوف تتضور جوعًا في الوسط. باستخدام هذه الطريقة ، تم تحديد استنساخ إيجابي وتسلسله. للتأكد من أن الجين المُدخل مشتق من الميتاجينوم وليس من شظايا الحمض النووي المهضوم أثناء بناء المكتبة ، فإن البادئات تعتمد على الاكتشاف لير تم تصميم جين (lysine racemase). ثم نجحت هذه الاشعال في تضخيم لير الجين مباشرة من الحمض النووي الميتاجينومي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (Chen et al. 2009).

الحث بواسطة الركيزة

يعد تحريض التعبير الجيني بواسطة الركيزة عمليًا بشكل خاص للكشف عن الجينات التقويضية. غالبًا ما يتم تحفيز التعبير عن الجينات التقويضية بواسطة ركائز و / أو مستقلبات الإنزيمات التحفيزية. تقع العناصر التنظيمية لهذه الجينات التقويضية عمومًا بالقرب من الجينات نفسها. وقد ثبت أن هذه العناصر تعمل في الكائنات الحية المضيفة مثل بكتريا قولونية.

التعبير الجيني الناجم عن الركيزة

Uchiyama et al. طور (2005) ما يسمى بنظام التعبير الجيني الناجم عن الركيزة (SIGEX) لاستخدامه كطريقة فحص لجينات تقويضية معينة. لجعل هذه الطريقة متوافقة مع الإنتاجية العالية ، تم استخدام ناقل تعبير GFP ، مما أدى إلى التعبير عن GFP المشترك عند التعبير الناجم عن الركيزة عن أي جين مدرج مستجيب. مكّن تعبير GFP هذا لاحقًا من فصل الحيوانات المستنسخة الإيجابية عن طريق فرز الخلايا بمساعدة التألق (FACS). في الدراسة ، تم العثور على الجينات الميتاجينومية من المياه الجوفية التي يمكن أن يسببها البنزوات والنفتالين. أسفر هذا عن 58 استنساخًا إيجابيًا للبنزوات وأربعة نفتالين (Uchiyama et al. 2005). عن طريق تغيير الركيزة ، يمكن تعديل نطاق الشاشة ويمكن استهداف جينات تقويضية مختلفة. قد يتم استنتاج وظائف الجين غير المعروفة من الركيزة المحرضة المستخدمة. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي تحريض التعبير بواسطة مؤثرات أخرى غير الركيزة المستخدمة إلى اكتشاف الإيجابيات الخاطئة.

التعبير الذي ينظمه المستقلب

يشكل التعبير الذي ينظمه المستقلب أسلوبًا مشابهًا للتقنية المذكورة أعلاه (Williamson et al. 2005). يهدف إلى الكشف عن الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيًا بواسطة داخل الخلايا لوكسأنا – luxR نظام الاستشعار البيولوجي. في هذا النظام ، سيتم تحفيز التعبير الجيني أو تثبيطه عن طريق استشعار النصاب. بعد استيفاء تركيز معين من المنتج الجيني ، سيحدث تحريض التعبير عن المنشط النسخي عن طريق ربط لوكسرالذي ينشط لوكس سوف يترتب على ذلك التعبير اللاحق عن الجين المراسل. يسمح التعبير الناجح لجين المراسل بفحص الإنتاجية العالية بواسطة FACS. من مزايا هذا النظام أنه لا يعتمد على إفراز منتج جيني مثل الشاشات التي تحتوي على مؤشرات الكائنات الحية (تقنية شائعة لتحديد المضادات الحيوية). بدلاً من ذلك ، تفحص هذه التقنية داخل الخلايا للجزيئات الصغيرة المعبر عنها (Williamson et al. 2005).


خيارات الوصول

احصل على الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


النتائج

الإثراء البيولوجي للعاثية التي تعرض تسلسل الببتيد الملزم Hsp16.3 من خلال بيوبانينج.

بعد الجولة الثالثة من دراسة مكتبة Ph.D.-7 على Hsp16.3 ، وجد أنه من بين ثمانية مستنسخات من الملتهمة المختارة عشوائيًا (معرفات التسلسل من 1 إلى 8) ، والتي تم تسلسلها لمنطقة ترميز الببتيد ، خمسة كانت متطابقة (الجدول & # x200B (الجدول 1). 1). يمثل معرف التسلسل 9 تسلسل إجماعي ، Lys-Met-His-Ala-Thr-Asn-His ، الخارج من تجربة التحريك هذه. في حالة مكتبة Ph.D.-12 ، كانت النتائج أكثر إثارة للإعجاب. من بين النسخ العشر المتسلسلة بعد التنظيف الثالث ، كانت 9 مستنسخات (معرفات التسلسل 11 إلى 20) متطابقة ، وكان تسلسل الببتيد الإجماعي (رقم التسلسل 21) في هذه الحالة هو Tyr-Pro-His-His-Phe-Lys-His- Arg-His-Ile-Pro-Ile. عندما تمت مقارنة تسلسلي الإجماع (معرف التسلسل 9 و 21) ، وجد أن بقاياه الثالثة والسابعة موجودة في وضع محاذي. تم تأكيد ارتباط استنساخ الملتهمة التي تعرض الببتيدات (معرفات التسلسل 9 و 21) بـ Hsp16.3 عن طريق إجراء ELISA العكسي العكسي (الشكل & # x200B (الشكل 1). 1). لاشتقاق الببتيدات الاصطناعية ، تمت إضافة فاصل Gly-Gly-Gly-Ser إلى تسلسلات الإجماع في الأطراف C للحصول على تسلسلات الربط الفعالة التي لها معرفات 10 و 22.

عكس الملتهمة ELISA لتأكيد ارتباط استنساخ الملتهمة التي تعرض تسلسل الببتيد ، معرف التسلسل 9 و 21 ، إلى Hsp16.3. تم تضخيم استنساخ الملتهمة ، وتركيزها بواسطة ترسيب PEG ، وتفاعلت مع Hsp16.3 أو هدف غير محدد BSA مطلي على آبار لوحة ميكروتيتر. تمت إزالة الملتهمة غير المربوطة عن طريق الغسل باستخدام TBST (0.5٪ توين 20) ، وتم اكتشاف الملتهمة المقيدة باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة مترافق مع بيروكسيداز الفجل (1: 5000) وركيزة ABTS. تمت مراقبة تطور اللون بطريقة طيفية عند 405 نانومتر. وقد تم كل تجربة في ثلاث نسخ. يوضح الرسم البياني الشريطي نشاط الربط لنسخ الملتهمة التي تعرض معرف التسلسل 9 (& # x025a1) ومعرف التسلسل 21 (& # x025aa) إلى Hsp16.3 و BSA (ربط الخلفية). تمثل أشرطة الخطأ SE.

الجدول 1.

تم تحديد تسلسلات الببتيد الملزمة Hsp16.3 بعد غسل الجولة الثالثة

تم استخدام مكتبة عرض Phageمعرف التسلسل أتسلسل الأحماض الأمينية ب
دكتوراه - 71جلايفالغلوأسنفالسرTRP
2ليسالتقىلهعلاءThrأسنله
3ليسالتقىلهعلاءThrأسنله
4ليسالتقىلهعلاءThrأسنله
5ليوطليعةعلاءليسأسنPheله
6Pheطليعةطليعةليوليسسرطليعة
7ليسالتقىلهعلاءThrأسنله
8ليسالتقىلهعلاءThrأسنله
9 & # x0002aليسالتقىلهعلاءThrأسنله
10 & # x02020ليسالتقىلهعلاءThrأسنلهجلايجلايجلايسر
دكتوراه - 1211صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
12صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
13صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
14صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
15صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
16علاءصورليسطليعةإيلعلاءلهPheإيلسرطليعةعلاء
17صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
18صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
19صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
20صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
21 & # x0002aصورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيل
22 & # x02020صورطليعةلهلهPheليسلهأرجلهإيلطليعةإيلجلايجلايجلايسر

إن متواليات الببتيد الملزمة Hsp16.3 المختلفة المذكورة في هذه الدراسة ، وطريقة اشتقاقها ، ومقايسة أنشطتها المثبطة كلها مغطاة بطلب براءة اختراع (معلق) مقدم إلى مكتب براءات الاختراع والعلامات التجارية بالولايات المتحدة.

تقارب ملزمة من روابط الببتيد لـ Hsp16.3.

معرفات التسلسل 10 و 22 ، المشار إليها باسم الببتيدات 10 و 22 من الآن فصاعدًا ، تم تصنيعها كيميائيًا وتم تصنيفها باستخدام FITC في النهايات الطرفية N.

تم استخدام الببتيدات المفلورة لقياس الارتباط بـ Hsp16.3 عن طريق تباين التألق. يوضح الشكل 2 أ و ب معايرة الببتيدات المقترنة بـ FITC 10 و 22 (800 نانومتر) ، على التوالي ، مع زيادة تركيزات Hsp16.3. تم إجراء ثلاث معايرات مستقلة لكل ببتيد ، وتم رسم متوسط ​​التباين & # x000b1 SE مقابل تركيز البروتين. زاد تباين الخواص كدالة لتركيز Hsp16.3. تم تركيب البيانات على معادلة ربط الموقع المفرد (المعادلة 2) ، وتم تحديد ثابت التفكك. ال كد تم العثور على القيم التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة 54.2 & # x000b1 13.7 & # x003bcM (ص & # x0003d 0.001) و 45.7 & # x000b1 18.0 & # x003bcM (ص & # x0003d 0.023) للببتيدات 10 و 22 ، على التوالي.

تحديد ثابت التفكك والقياس المتكافئ للببتيد المرتبط بـ Hsp16.3. زيادة تباين الخواص في الببتيد المسمى FITC 10 (A) والببتيد 22 (B) كدالة لتركيز Hsp16.3 في محلول فوسفات الصوديوم 50 ملي مولار (درجة الحموضة 7.5) يحتوي على 300 ملي مول كلوريد الصوديوم في درجة حرارة الغرفة. قيم تباين الخواص تعني & # x000b1 SE (المشار إليها بواسطة أشرطة الخطأ) لثلاث تجارب مستقلة. كانت أطوال موجات الإثارة والانبعاثات عند 495 و 519 نانومتر ، على التوالي. في حالة الببتيد 10 ، تم تحديد قياس العناصر المتكافئة (C) من التبريد المعتمد على الجرعة من مضان التيروزين الجوهري لـ Hsp16.3 في نفس الظروف العازلة. تم رسم الخطوط لتحديد قياس العناصر المتكافئة الملزمة.

تم أيضًا استخدام إخماد التيروزين الفلوري لبروتين Hsp16.3 لدراسة ارتباط الببتيد 10. نظرًا لأن الببتيد 10 لا يحتوي على بقايا من التيروزين ، فيمكن استخدامه كمخمد ، ولكن لا يمكن إجراء تمرين مماثل في حالة الببتيد 22 منذ ذلك الحين يشكل التيروزين جزءًا من التسلسل. يوضح الشكل & # x200B الشكل 2C 2C ملف تبريد مضان التيروزين لـ Hsp16.3 (15 & # x003bcM) عند ربط الببتيد 10. قيمة الإحداثيات لتقاطع الخط المقارب وتلك المرسومة من خلال الأولي F/F0 تمثل القيم نر & # x0002b كد، أين ن هو عدد مواقع ربط الببتيد لكل وحدة فرعية من Hsp16.3 و صر هو تركيز البروتين الكلي من حيث المونومر. من أجل تحديد ن، أجريت تجارب التبريد بتركيزين من Hsp16.3: 15 & # x003bcM (الشكل & # x200B (الشكل 2C) 2C) و 5 & # x003bcM (البيانات غير معروضة). تم العثور على قيم الإحداثي لتكون 20.0 (الشكل & # x200B (الشكل 2C) 2C) و 10.2 & # x003bcM ، على التوالي. ومن ثم لدينا كد & # x0002b 15ن & # x0003d 20.0 و كد & # x0002b 5ن & # x0003d 10.2. عن طريق القضاء كد من هاتين المعادلتين ، قيمة ن تم تحديده ليكون 0.98. يمكن الاستنتاج أن هناك موقع ربط واحد للببتيد 10 لكل وحدة فرعية من Hsp16.3.

تثبيط محدد لنشاط Hsp16.3 المرافق بواسطة الببتيدات.

يتجمع نازعة هيدروجين الكحول (ADH) (5 & # x003bcM) عند تسخينه إلى 50 & # x000b0C (الشكل 3 أ ، ب ، د ، هـ). يتم منع هذا التجميع إلى حد ca. 85٪ عند احتضان ADH مع Hsp16.3 (الشكل 3A و D) عند نسبة مولارية من ADH إلى Hsp16.3 من 5: 4. أدت إضافة كميات متزايدة من الببتيد 10 إلى فقدان تدريجي لنشاط المرافق لـ Hsp16.3. عند أعلى تركيز 100 & # x02009 & # x003bcM ، على سبيل المثال ، عند & # x0223c25 أضعاف الزائدة المولية ، لوحظ تثبيط كبير (& # x0003e70 ٪) لنشاط المرافق (الشكل & # x200B (الشكل 3 أ). ). وبالمثل ، في حالة الببتيد 22 ، كان مدى التثبيط عند 100 & # x003bcM كاليفورنيا. 60٪ (الشكل & # x200B (الشكل ثلاثي الأبعاد). ثلاثي الأبعاد). لم يكن لإضافة الببتيد وحده أي تأثير على معدلات تراكم ADH (الشكل 3 أ ود). باستخدام نفس الإعداد التجريبي ، تم استبدال Hsp16.3 بـ alphaB-crystallin ، وتم تحليل التأثير المثبط ، إن وجد ، للببتيدات على هذا البروتين. كما هو متوقع ، عندما تم خلط ADH (5 & # x003bcM) مع alphaB-crystallin (2.5 & # x003bcM) ، لوحظت حماية كاملة ضد التجميع ، ولكن لا يمكن عكس هذه الحماية بإضافة الببتيد 10 أو الببتيد 22 (الشكل .3B و E ، على التوالي) بتركيز 100 & # x003bcM ، والذي يعطي بشكل فعال & # x0223c40 أضعاف المولي الزائد من الببتيد فوق البروتين المستهدف alphaB-crystallin. للحصول على تفسير أكثر كميًا ، تم رسم النسبة المئوية لنشاط المرافق المتبقي (يعني & # x000b1 SE لثلاث تجارب مستقلة) مقابل تركيز الببتيد. أسفر هذا عن منحنى الاستجابة للجرعة (الشكل 3C و F) الذي من خلاله IC50 قيم 53.0 & # x000b1 8.47 & # x003bcM (ص & # x0003d 0.0079) للببتيد 10 و 57.1 & # x000b1 4.37 & # x003bcM (ص & # x0003d 0.0058) للببتيد 22. كما توضح منحنيات الاستجابة للجرعة لكل من الببتيدات بيانياً أنه في سياق alphaB-crystallin لم يكن هناك أي تأثير تقريبًا.

تثبيط يعتمد على الجرعة لنشاط مرافق Hsp16.3 بواسطة الببتيدات 10 و 22. تم إجراء فحوصات التجميع عن طريق تسخين 5 & # x003bcM ADH عند 50 & # x000b0C مباشرة في مقياس طيف ضوئي باستخدام حامل كوفيت حراري في حجم رد فعل إجمالي قدره 500 & # x003bcl في محلول فوسفات الصوديوم 100 ملي (درجة الحموضة 7.0) يحتوي على 100 ملي كلوريد الصوديوم. تمت مراقبة الامتصاصية عند 360 نانومتر لمدة 1200 ثانية ، وتم أخذ القراءات في كل 100 ثانية. يتراكم ADH عند التسخين (A و B و D و E & # x025b4). يؤدي دمج Hsp16.3 بنسبة مولارية تبلغ 5: 4 (A و D) أو alphaB-crystallin بنسبة مولارية 1: 1 (B و E) إلى انخفاض في نشاط التجميع (& # x02022). ثم تمت إضافة تركيزات متزايدة من الببتيد الملزم Hsp16.3 10 (A و B) والببتيد 22 (D و E) كما هو موضح بالتركيزات التالية: 25 & # x003bcM (& # x025a1) ، 50 & # x003bcM (& # x025aa ) و 100 & # x003bcM (& # x025b5). تمثل النجوم تراكم ADH في وجود الببتيد 10 (A و B) والببتيد 22 (D و E). IC50 بالنسبة للببتيد 10 (C) والببتيد 22 (F) تم حسابه من مؤامرة نسبة نشاط المرافقة المتبقية مقابل تركيز الببتيد. كل نقطة مسند في اللوحات C و F هي متوسط ​​ثلاث نتائج مشتقة بشكل مستقل. تشير أشرطة الخطأ إلى SE.

تؤثر الببتيدات على استقرار مجمعات الركيزة Hsp16.3.

لقد ثبت في وقت سابق أن alpha-HSPs تشكل مجمعات قابلة للذوبان مع بروتينات معرضة للتجمع عند تسخينها معًا عند 50 & # x000b0C (14). من أجل التحقيق في الآلية المحتملة لعمل مثبطات الببتيد ، تم فحص تأثيرها على تكوين مركب الركيزة Hsp16.3 باستخدام الركيزة النموذجية مالات ديهيدروجينيز (MDH). تم أخذ MDH بتركيز 2 & # x003bcM وتم تسخينه عند 50 & # x000b0C. كما هو متوقع ، شكلت مجاميع وترسبت. عندما تم تحليل الحبيبات والطاف بواسطة SDS-PAGE ، تم العثور على البروتين بأكمله في جزء الحبيبات (الشكل. & # x200B (الشكل 4A ، 4A ، الممر 2). Hsp16.3 (80 & # x003bcM) تمت إضافته بعد ذلك إلى MDH عند زيادة 40 ضعفًا في الأضراس قبل التسخين لمنع التجميع. أعطى دمج هذا المقدار حماية قصوى ، وتم الاحتفاظ بمعظم MDH في المادة الطافية (الشكل & # x200B (الشكل 4 أ ، 4 أ) ، الممر 3). للتحقيق في تأثير الببتيد 10 على التكوين المعقد ، تمت إضافة جرعات متزايدة من الببتيد لتعطيل Hsp16.3. يوضح الشكل & # x200B الشكل 4B 4B تحولًا تدريجيًا في نطاق MDH من المادة الطافية إلى جزء الحبيبات (الممرات المميزة بنقاط سوداء) عند إضافة كميات متزايدة من الببتيد 10. ومع ذلك ، ظلت Hsp16.3 قابلة للذوبان حتى تركيز 3.2 ملي مولار من الببتيد 10 (40 ضعفًا من المولي الزائدة) ، على الرغم من التركيز الأعلى (4.8 ملي مولار ، على سبيل المثال ، زيادة الضرس بمقدار 60 ضعفًا) تم ترسيبها أيضًا (الشكل & # x200B (الشكل 4D). 4D) إضافة الببتيد 22 أدى لعواقب مماثلة (الشكل. & # x200B (الشكل 4C) ، 4C) ، ولكن في هذه الحالة حدث هطول شبه كامل للمركب بتركيز ببتيد 1.2 ملي مولار (15 ضعفًا زائدًا مولاريًا) مقارنة بـ 4.8 ملي مولار (60 ضعفًا زائدًا) في الحالة من الببتيد 10. كان هناك اختلاف ملحوظ آخر هو أنه ، على عكس الحالة السابقة ، حدث هطول Hsp16.3 و MDH بالتوازي عندما تم استخدام الببتيد 22 كمثبط (الشكل & # x200B (الشكل 4E). 4E). نظرًا لأنه في كلتا الحالتين لوحظ وجود خسارة يمكن اكتشافها في قابلية ذوبان Hsp16.3 ، فقد تم فحص تأثير هذه الببتيدات على قابلية ذوبان Hsp16.3 نفسها عند تركيزات الببتيد التي ترسبت عندها المجمعات. تشير النتائج إلى أنه في حالة الببتيد 10 (الشكل & # x200B (الشكل 4F) ، 4F) ، كاليفورنيا. 70 ٪ من البروتين الموجود أصبح غير قابل للذوبان عند زيادة 60 ضعفًا (4.8 & # x02009mM) ، بينما في حالة الببتيد 22 (الشكل & # x200B (الشكل 4G) ، 4G) ، ما يقرب من 90 ٪ منه فقدت قابلية الذوبان عند زيادة الضرس بمقدار 15 ضعفًا (1.2 ملم).

تأثير الببتيدات على استقرار مركب Hsp16.3-MDH. (A) MDH (2 & # x003bcM) إما بمفرده أو بعد خلطه مع Hsp16.3 (80 & # x003bcM) تم تسخينه إلى 50 & # x000b0C لمدة 30 دقيقة ، متبوعًا بالطرد المركزي عند 15000 & # x000d7 جم. تم تحليل المواد الطافية والكريات بواسطة SDS-PAGE على هلام 15٪. تمثل الممرات المميزة بنقاط سوداء كسور الحبيبات في جميع الحالات. تم بعد ذلك تكوين مركب MDH-Hsp16.3 في وجود الببتيد المثبط 10 أو الببتيد 22 (B و C) ، على التوالي.يشار إلى التجاوزات المولية للببتيدات المستخدمة بالنسبة إلى Hsp16.3 أسفل الممرات. تم مسح العصابات ضوئيًا بطريقة قياس الكثافة ، وتم رسم جزء البروتين (إما Hsp16.3 أو MDH) الذي ظهر في المادة الطافية على أنه النسبة المئوية للذوبان مقابل الزيادة المولية للببتيد 10 أو الببتيد 22 (D و E) ، على التوالي. (F و G) تم اختبار تأثير الببتيدات 10 و 22 على قابلية ذوبان Hsp16.3 باستخدام الفائض المولي المحدد. (H) تم تحديد التأثير المقارن للببتيد 22 (الممرات المميزة بنقاط سوداء) على alphaB-crystallin جنبًا إلى جنب مع عنصر التحكم Hsp16.3. (1) وبالمثل ، تم اختبار تأثير الببتيد 22 على تكوين مركب قابل للذوبان بين alphaB-crystallin و MDH جنبًا إلى جنب مع عنصر تحكم Hsp16.3-MDH. في التجربتين الأخيرتين ، تم استخدام فائض من الببتيد المولي بمقدار 15 فوق Hsp16.3 أو alphaB-crystallin.

على الرغم من أن الترسيب لوحظ بتركيزات عالية نسبيًا من الببتيدات ، إلا أن الظاهرة محددة لأنها لا تحدث في حالة BSA و DnaK (البيانات غير معروضة) ، كما أنها لا تؤثر على متماثل alphaB-crystallin ذي الصلة (الشكل & # x200B ( الشكل 4H). 4H). وهكذا ، عندما تمت إضافة فائض المولي بمقدار 15 ضعفًا (1.2 ملي مولار) من الببتيد 22 إلى Hsp16.3 (80 & # x003bcM) ، لوحظ خسارة كبيرة في القابلية للذوبان كما هو متوقع (الشكل & # x200B (الشكل 4H ، 4H ، الممر 4) ، ولكن عندما تمت إضافته إلى alphaB-crystallin ، لم يلاحظ أي تأثير (الشكل & # x200B (الشكل 4H ، 4H ، الممر 8). تأثير الببتيدات على المركب بين MDH و alphaB-crystallin تم أيضًا التحقيق (الشكل رقم 4I) .4I) تظهر النتائج المقدمة للببتيد 22 أنه عند تركيز الببتيد الذي يترسب فيه مجمع Hsp16.3-MDH (الشكل & # x200B (الشكل .4I ، 4I ، lane 4) ، لم يلاحظ أي تأثير على معقد alphaB-crystallin-MDH (الشكل & # x200B (الشكل 4I ، 4I ، الممر 8). تكررت المقايسات عدة مرات ، وتم العثور على نمط الترسيب تثبت هذه الملاحظات أيضًا أن مثبطات الببتيد لها خصوصية مستهدفة.

هطول الأمطار ليس ميزة أساسية للتثبيط.

من أجل التحقيق فيما إذا كان فقدان نشاط المرافِق لـ Hsp16.3 الذي لوحظ في مقايسات التجميع الطيفي الضوئي كان بسبب ترسيب البروتين ، تم إجراء اختبار (الشكل & # x200B (الشكل 5A) 5A) بشكل أساسي كما هو موصوف في الأقسام السابقة وبعد ذلك ، بعد الوصول إلى تجميع الحالة المستقرة ، تم طرد العينات بالطرد المركزي ، وتم تحليل كسور الحبيبات بواسطة SDS-15 ٪ PAGE (الشكل & # x200B (الشكل 5C) .5C). يمنع وجود Hsp16.3 (4 & # x003bcM) التجميع إلى حد 60٪ (الشكل 5 أ و ب). أدت إضافة الببتيد 10 أو الببتيد 22 عند زيادة بمقدار 50 ضعفًا (200 & # x003bcM) إلى استعادة التجميع إلى المستوى الأولي تقريبًا (ADH وحده). لا يُظهر Hsp16.3 نفسه أي تجميع. كشف تحليل SDS-PAGE أنه في وجود Hsp16.3 كان هناك انخفاض بنسبة 55 ٪ في شدة نطاق ADH (الشكل 5C و D ، الممر 3) بما يتناسب مع الانخفاض الملحوظ في المقايسة الطيفية. في وجود الببتيدات ، عادت الكثافة إلى ما يقرب من 100٪ ، مما يشير إلى تثبيط نشاط Hsp16.3 (الشكل 5C و D ، الممران 4 و 5 مقارنةً بالحارة 2). حدثت التقلبات في الشدة فقط في حالة نطاقات ADH ولكن ليس في Hsp16.3 ، والتي ظلت شدتها عند مستويات الخلفية (الشكل & # x200B (الشكل 5D). 5D). يشير هذا إلى أنه في ظل ظروف المقايسة الطيفية ، فإن التعطيل بواسطة الببتيدات لا يتضمن تجميع Hsp16.3. تشير النتيجة إلى أن ارتباط الببتيدات يغير شكل Hsp16.3 بحيث يصبح أقل قابلية للذوبان ، لكن فقدان القابلية للذوبان يتجلى بالفعل عندما تكون تركيزات الببتيدات عالية ، أي في النطاق الملي. وبالتالي ، فإن الهطول ليس الظاهرة نفسها بل هو انعكاس للتغيير التوافقي المحتمل في Hsp16.3 نتيجة ارتباط الببتيد.

تعطيل Hsp16.3 بوساطة الببتيد في ظل الظروف المستخدمة للمقايسة الطيفية لنشاط المرافق. (أ) تم قياس نشاط المرافقة طيفيًا كما هو موضح في الشكل. & # x200B الشكل 3. 3. يتم تمثيل تجميع ADH (5 & # x003bcM) بدون مرافقة بالمنحنى المميز بدوائر بيضاء ، والحماية بواسطة Hsp16.3 (4 & # x003bcM) بواسطة الدوائر السوداء ، وتثبيط Hsp16.3 بواسطة الببتيدات 10 و 22 (200 & # x003bcM) بمربعات بيضاء وسوداء ، على التوالي. يُشار إلى تجميع Hsp16.3 وحده بواسطة المثلثات البيضاء. (ب) يتم تمثيل تجميعات الحالة المستقرة (1200 ثانية) التي لوحظت في اللوحة أ بيانياً. (C) تم الطرد المركزي للعينات المجمعة ، وتم تحليل كسور الحبيبات بواسطة SDS-PAGE على ممرات هلامية بنسبة 15٪ تتوافق مع منحنيات التجميع موضحة برموز متطابقة. يشار إلى مجموعات البروتينات والببتيدات المستخدمة في الأعلى. يوضح المخطط الشريطي (D) شدة النطاق لمكونات ADH (& # x025a1) و Hsp16.3 (& # x025aa) في كل حارة.

دليل على تورط مخلفاته في تفاعل الببتيد مع Hsp16.3.

من أجل مزيد من التحقيق في التفاعل بين الببتيدات و Hsp16.3 ، أجريت تجارب الرنين المغناطيسي النووي. يمثل الشكل & # x200B الشكل 6A 6A أطياف TOCSY المتراكبة لمنطقة NH - & # x003b1H من الببتيد 10 (2 مم) في غياب Hsp16.3 (أحمر) وفي وجود Hsp16.3 (أزرق) عند مقياس التكافؤ الفرعي تركيز (0.1 ملم). في ظل هذه الظروف الزائدة من الترابط ، لا تظهر سوى قمم الببتيد. يسمح التبادل السريع بين الأشكال الحرة والمرتبطة بالمستقبل بحساب متوسط ​​التحولين الكيميائيين تحت حالتين مختلفتين. وبالتالي ، فإن تغيير التحول الكيميائي ، مقارنة بالببتيد الحر ، يمثل التحولات الكيميائية التي تختلف في حالة ارتباط المستقبل والنقاط المحتملة للتفاعل بين الببتيد والمستقبل. يمثل الشكل & # x200 ب الشكل 6 ب 6 ب بيانياً اختلافات التحول الكيميائي لبروتونات الأميد لببتيد 10 بقايا في المحاليل العازلة في وجود أو عدم وجود Hsp16.3. يتضح من المخطط الشريطي أن عددًا قليلاً فقط من المخلفات يتحول وأن التحول الكيميائي لمعظم البقايا يظل دون تغيير. تم تعيين أنواع المخلفات من اتصال الدوران ومعلومات التحول الكيميائي (البيانات غير معروضة). لم يتم ملاحظة قمم Met في أطياف TOCSY ، ربما بسبب توسيع القمم بسبب التبادل التوافقي. ومع ذلك ، يمكن ملاحظة ذروة Met ، عندما تم اشتقاق الأطياف في الماء عند 27 & # x000b0C (البيانات غير معروضة) ، مما يؤكد أن الببتيد يحتوي على Met. كشفت مقارنة أطياف TOCSY للببتيد 10 التي تم الحصول عليها في وجود أو عدم وجود Hsp16.3 عن تغيرات كبيرة في التحول الكيميائي لكل من بقايا الببتيد 10 في وجود Hsp16.3. في حالة علاء ، لوحظ تأثير طفيف ، ولكن بالنسبة للآخرين كان التأثير ضئيلًا. من هذه النتيجة ، يبدو أن منطقة His-X-Y-Y-His من الببتيد 10 قد تكون ضرورية للتفاعل مع Hsp16.3 ، حيث يشير X إلى Ala أو حمض أميني مماثل ويمثل Y أي حمض أميني آخر. لم يكن من الممكن إجراء تحليل مماثل باستخدام الببتيد 22 نظرًا لأن مركب الببتيد 22-Hsp16.3 يترسب بتركيز عالٍ ، كما تم توضيحه سابقًا.

التغييرات في التحول الكيميائي لمخلفات الببتيد 10 بسبب التفاعل مع Hsp16.3. (أ) تراكب أطياف 2D TOCSY في منطقة بصمة الإصبع (المحددة) من 2 مم من الببتيد 10 في 20 ملي محلول فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة 7.0) تحتوي على 250 ملي كلوريد الصوديوم في 90٪ H2س و 10٪ د2O عند 5 & # x000b0C في غياب (أحمر) أو في وجود (أزرق) 0.1 ملي مولار Hsp16.3 بروتين. يتم تحديد الأحماض الأمينية باستخدام رمز مكون من حرف واحد. (ب) تمثيل رسومي لاختلافات التحول الكيميائي (& # x00394 & # x003b4 هرتز) لبروتونات أميد من ببتيد 10 بقايا في محلول عازلة في وجود أو عدم وجود Hsp16.3 ، كما هو مذكور في وسيلة الإيضاح للوحة A.


المواد والأساليب

سلالات بكتيرية، البلازميدات، وظروف النمو

الإشريكية القولونية السلالات المستخدمة هي DH5α [52] ، C600 [53] ، MV10Nal R [54] ، JM109 [17] ، HB101 [55] ، Nissle1917 [56] ، AL1 (هذه الدراسة ، Rif R متحولة من الفئران ه. القولونية سلالة معزولة من قبل أليساندرو لازدينز في سيدني). يتم سرد البلازميدات المستخدمة في الجدول S2. تم استزراع البكتيريا هوائيًا ، إما في مرق L / L-agar [33] ، أو M9 Minimal Medium [33] (مكمل بالأحماض الأمينية عند 50 ميكروغرام مل -1) عند 37 درجة مئوية. كانت تركيزات المضادات الحيوية النهائية هي: الأمبيسلين (Ap أو Amp) ، 100 ميكروغرام مل -1 كاناميسين (كم أو كان) ، 50 ميكروغرام مل -1 كلورامفينيكول (سم أو كام) ، 50 ميكروغرام مل -1 حمض الناليديكسيك (نال) ، 25 ميكروغرام مل -1 ريفامبيسين (ريف) 100 ميكروغرام مل -1 وتتراسيكلين (Tc أو Tet) ، 25 ميكروغرام مل -1. بالنسبة للفحص الأزرق / الأبيض ، تم استكمال L-agar بـ X-gal (20 ميكروغرام مل -1) و IPTG (0.5 ملم).

تحليل الحمض النووي والتلاعب به

تم شراء إنزيمات التقييد من نيو إنجلاند Biolabs T4 DNA ligase و Taq DNA polymerase من Invitrogen Velocity Pro قراءة بوليميريز الحمض النووي من Bioline Q5 عالي الدقة كان بوليميريز Taq من NEB. تم تحقيق تضخيم PCR للحمض النووي باستخدام البادئات (AltaBioscience ، جامعة برمنغهام ، المملكة المتحدة أو Sigma Aldrich) المدرجة في جدول S3. تم تدوير التفاعلات في مختبر SensoQuest Lab Cycler باتباع الإجراءات القياسية [57]. تمت تنقية منتجات PCR باستخدام Illustra GFX TM PCR DNA و Gel Band Purification Kit (GE TM Healthcare). تم إجراء تحضيرات DNA البلازميد على نطاق صغير باستخدام مجموعة استخراج DNA AccuPrep Plasmid MiniPrep (Bioneer) المقتبسة من طريقة التحلل القلوي في Birnboim و Doly [58]. تم تحضير تفاعلات تسلسل الحمض النووي وتشغيلها على محلل DNA ABI 3730 (مرفق الجينوم الوظيفي ، جامعة برمنغهام ، المملكة المتحدة) باتباع طريقة إنهاء السلسلة [59].

مقارنة رقم نسخة البلازميد

ما لا يقل عن ثلاث نسخ انتقائية بين عشية وضحاها (16 ساعة) ثقافات من ه. القولونية تحمل استعلام البلازميدات بالإضافة إلى 2 كيلو بايت مشتق pACYC194 pDS3 كمعيار داخلي نما في LB مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية ثم يتم حصادها ثم استخراج DNA البلازميد كما هو موضح أعلاه. تم هضم البلازميد DNA باستخدام إنزيم يقطع مرة واحدة فقط ، لخطي الحمض النووي وجعل بروميد الإيثيديوم موحدًا. تم تحديد شدة النطاق باستخدام برنامج QuantityOne من Biorad وتم تطبيعها مقابل نطاق pDS3. تم طلاء المستعمرات من التخفيف المتسلسل للثقافات المتماثلة لتحديد نسبة نقل البلازميد.

التحويل المقترن

بعد النمو بين عشية وضحاها ، تم خلط 100 ميكرولتر من المتبرع مع 1 مل من ه. القولونية متلقي MV10 Nal R ويتم ترشيحه في مرشح ميليبور معقم 0.45 ميكرومتر. تم وضع المرشحات على ألواح L agar التي تم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات. تم إعادة تعليق الخلايا من المرشح في 1 مل من محلول ملحي معقم بنسبة 0.85 ٪ (وزن / حجم) وتم تخفيفها بشكل متسلسل قبل الانتشار على أجار انتقائي وحضانة عند 37 درجة مئوية.

الهندسة التأشبية (إعادة التركيب) لجينومات بلازميد IncP-1 المقترنة

بالنسبة لعمليات الإدراج أو الحذف أو الاستبدال ، تم استخدام مواد أولية (جدول S3) لتضخيم ما يقرب من 500 نقطة أساس من الأسلحة على جانبي النقطة أو المنطقة المراد تغييرها. تم ضم الأذرع من خلال تصميم الاشعال الداخلية ليكون لها التكامل ، وأحيانًا تتضمن مواقع تقييد جديدة ، للسماح بالانضمام معًا بواسطة SOEing (Splicing by Overlap Extension) PCR [60]. تم تنقية منتجات PCR الأولية وخلطها ثم تمديدها لمدة ثلاث دورات قبل إضافة البادئات الخارجية للدورات المتبقية. تم استنساخ المنتج بشكل روتيني بين مواقع HindIII و SalI لمشتق pACYC184 pMEL1 الذي يحتوي على سايب الجين (السماح بالاختيار المضاد مع السكروز) الذي تم إدخاله بين موقعي XbaI و HindIII. لدمج الكاسيت المضاد لـ F و antiK في بلازميد اقتران ، تم إدخال أذرع التماثل أولاً لإعطاء pMILL1 (جدول S2) ثم الأشرطة المستنسخة بين الذراعين (باستخدام مواقع التقييد المصممة في البادئات الداخلية) لإعطاء pMILL2 و pSLK1 على التوالي (S2 طاولة).

تم إدخال البلازميد المعاد تجميعه في ه. القولونية يحتوي C600 بالفعل على البلازميد المستهدف ، ويختار باستخدام الكاميرا ومضادًا حيويًا مناسبًا للبلازميد المستهدف (بشكل روتيني Tet). تم بعد ذلك إجراء النقل المقترن إلى MV10nal R باختيار كل من الواسمات ويجب ألا ينتقل Nal- البلازميد المشتق من pMEL1 ما لم يتم اتحاده مع البلازميد المقترن. تم تنقية المستعمرات الفردية عن طريق التسليط إلى مستعمرات مفردة واستخدمت هذه الصفائح لتلقيح الثقافات السائلة التي نمت بين عشية وضحاها بدون كام. تم بعد ذلك اختيار منتجات الدقة إما عن طريق الانتشار على L-agar مع السكروز (5٪ وزن / حجم) أو عن طريق عزل DNA البلازميد والقطع بـ XbaI الذي يقطع في pMEL1 ولكن ليس في العمود الفقري IncP-1 لخطي البلازميدات غير المرغوب فيها لذلك أنها لن تحول البكتيريا.

اختبار كفاءة المعالجة

للنقل عن طريق الاقتران ، الثقافات السائلة بين عشية وضحاها ه. القولونية تم غسل C600 الذي يحمل البلازميد pCURE المراد اختباره ، أو عنصر تحكم مناسب ، لإزالة أي مضادات حيوية انتقائية ، ثم خلط 1: 1 و 1:10 مع سلالة تحمل البلازميد المستهدف وتزاوج مرشح قياسي يتم إجراؤه عند 37 درجة مئوية من أجل 1 ح. تم بعد ذلك تعليق البكتيريا من الغشاء في محلول ملحي معقم سعة 1 مل (0.85٪ وزن / حجم) وتم تخفيفه بشكل متسلسل قبل الطلاء على أجار انتقائي لتحديد العدد الإجمالي للمتحولين والمتحولين الذين لا يزالون يحملون البلازميد المستهدف. نزوح F 'برولاك تم تحديده بطريقتين: أولاً ، عن طريق الانتشار على وسط M9 مكملًا بشكل مناسب مع وبدون برولين لتحديد النسبة المئوية لفقدان النمط الظاهري Pro + ثانيًا ، عن طريق النمو على L-agar مع IPTG و X-gal عندما تحمل السلالة المستهدفة بالإضافة إلى ذلك pUC18 (تم تحديده) مع Amp) لإعطاء النمط الظاهري Lac + بسبب وجود جزء lacZ المشفر بواسطة pUC18 ، بحيث يتم فقدان Fبرولاك أعطى النمط الظاهري لاك. عند إدخال بلازميد المعالجة عن طريق التحويل ، تم جعل البكتيريا المستهدفة مؤهلة وفقًا لمعيار CaCl2 تم إجراء العلاج والتحول باستخدام DNA pCURE المنقى.

تم إجراء اختبار الغزو غير المختار عن طريق الخلط المتكرر على أغشية النايلون كما وصفها فوكس وآخرون [35]. تم خلط البكتيريا المانحة مع سلالة مستهدفة لإعطاء ما يقرب من 10 6 متبرعين و 10 9 بكتيريا متلقية قبل نشر 100 ميكرولتر على مرشح النيتروسليلوز (قطر 25 مم ، حجم مسام 0.45 ميكرون ، EMD-Millipore ، دارمستاد ، ألمانيا) على صفيحة L-agar. بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، تم إعادة تعليق البكتيريا في 1 مل من محلول ملحي ، وخلطها جيدًا وتم تخفيفها بشكل متسلسل لتحديد كل من النقل والمعالجة. تم نشر المعلق غير المخفف (100 ميكرولتر) على غشاء نايلون جديد على صفيحة L-agar لبدء فترة التزاوج التالية.

معالجة البلازميدات المصغرة RK2

كان صنع مشتقات pCT549 أمرًا محرجًا بسبب إدخال EcoRI-BglII oriV أثبتت شظايا أو شظايا BglII-PacI في هذا البلازميد أنها صعبة. لإدخال EcoRI-BglII oriV شظايا بدون كاسيت مضاد لـ oriV تم إنشاء المقطع بواسطة PCR ، وتم ربطه بـ pGEM-T Easy ومتسلسل. تم بعد ذلك قطع مشتق pGEMT و pCT549 بـ BglII وربطهما قبل التحول إلى ه. القولونية C2110 ، وهو نقص في DNA polI ، لذلك لا يسمح بتكرار نسخة pMB1 في pGEM-T ، وبالتالي اختيار المشتركين الذين يحتويون أيضًا على نسخة IncP التي تكون مستقلة عن بولي. تم فحص DNA البلازميد من المحولات من أجل الاتجاه النسبي للقطاعات المتصلة والجزء المختار الذي يمكن قطعه باستخدام EcoRI وإعادة تدويره بالربط ليحل محل القديم oriV مع الجديد.

لإدخال الكاسيت المضاد بجانبه oriV، تم تصميم الاشعال لوضع مواقع XbaI + EcoRI في اتجاه مجرى النهر oriV ومواقع MfeI + PacI المنبع ، حيث يكون BglII بشكل طبيعي. بعد استنساخ MfeI-XbaI oriV جزء في pGEM-T Easy والتحقق من التسلسل الذي تم ربطه بمشتق pLAZ2 pACYC184 الذي تم قطعه باستخدام EcoRI و XbaI. في pLAZ2 ، تحدد EcoRI أحد طرفي الكاسيت المضاد للتلف ويوجد موقع XbaI على نفس الجانب مفصولة بذراع تجانس واحد و سايب الجين. يتم تحديد الطرف الآخر من الكاسيت المضاد في pLAZ2 بواسطة موقع BglII. يمكن أن تنضم نهايات MfeI / EcoRI ولكن لا تجدد أيًا من الموقعين ، لذا فإن هذا البناء يولد BglII-antiF-PacI-oriV- تم إدخال مقطع EcoRI-XbaI في pCT549 كما هو موضح أعلاه والذي يتضمن قطع BglII وربطه وتحويله إلى C2110. تم إدخال الكاسيت المضاد لـ F بالمثل في mini-RK2 plasmid pRK2501 الذي يفتقر بالفعل كورب.

لإزالة أجزاء من كورا-المؤتمر الوطني العراقي-كورب-كورف-كورج-كفرك المنطقة وبقايا trbB قرب trfA، تم إجراء PCR العكسي على شريط pCT549 + antiF مع بادئات تتضمن موقع XbaI نظرًا لأن XbaI لا يقطع العمود الفقري RK2 أو الكاسيت المضاد لـ F. تم إجراء PCR بعيد المدى باستخدام بوليميراز Taq عالي الدقة Q5 باستخدام تصميم التمهيدي الموصى به وإزالة الظروف كورف-trbB, كورب-trbB و المؤتمر الوطني العراقي-trbB. تمت تنقية المنتج ، وتقطيعه باستخدام XbaI ، وإعادة تدويره وتحويله إلى DH5α. لازالة المؤتمر الوطني العراقي لكن لا كورب ال كورب تم تضخيم orf وهو بالإضافة إلى Δكورف-trbB تم ربط البلازميد بعد القطع بـ XbaI (القطع المنبع من trbBع) و SphI الذي يقطع المؤتمر الوطني العراقي.

تجارب الماوس

تمت الموافقة على جميع إجراءات وتجارب رعاية الحيوان من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في منطقة الصحة المحلية في غرب سيدني (بروتوكول 4276.08.17) وفقًا لـ "مدونة الممارسات الأسترالية لرعاية الحيوانات واستخدامها للأغراض العلمية" وتم تنفيذها بشكل أساسي على أنه وصفت سابقا [9]. تم إيواء الفئران الإناث BALB / c البالغة من العمر خمسة أسابيع (مركز الموارد الحيوانية بيرث ، واشنطن ، أستراليا) في مجموعات من ثلاثة في أقفاص البولي بروبيلين M1 مفتوحة الغطاء (Able Scientific ، أستراليا) في دورة فاتحة / مظلمة لمدة 12 ساعة ، مع الطعام والماء available ad libitum (مرفق الخدمات البيولوجية ، معهد ويستميد للأبحاث الطبية). اشتمل كل علاج مختلف على مجموعات من 3 فئران. تم تأقلم الفئران (d-6 إلى d0) قبل التجارب ، متبوعة بالتشغيل (d1-d3) في الغرفة التجريبية لتحديد خط الأساس. تم صيام الفئران لمدة 6 ساعات قبل السماح لها بالوصول إلى ماء السكروز ثم كان الطعام الطبيعي متاحًا بشكل مستمر. تم إعادة تعليق الثقافات البكتيرية التي تحمل البلازميد في ماء السكروز (8 ٪ ، وزن / حجم) إلى OD 600 من

0.4 ± 0.05 وإطعامها للفئران في أيام محددة و / أو المضادات الحيوية (10-50 مجم لتر -1) حسب الاقتضاء. في الأيام المحددة ، تم نقل كل فأر لفترة وجيزة إلى صندوق بلاستيكي منفصل للوزن وجمع البراز الطازج. تم تعليق البراز (100 مجم لكل فأر) في محلول ملحي مخزّن من الفوسفات سعة 1 مل (PBS) ، والتخفيفات المطلية على CHROMagar بالمضادات الحيوية المناسبة والمستعمرات التي تم عدها بعد الحضانة O / N عند 37 درجة مئوية. تم انتقاء 100 مستعمرة بشكل دوري على المزيد من اللوحات لتحديد النسب الدقيقة للأنماط المظهرية المقاومة. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن النسخ المتماثل IncK البلازميد في ريف S. ه. القولونية تم باستخدام البادئات AL_IncK_F و AL_IncK_R (جدول S3). تم تخفيف محاليل براز الفأر (100 مجم في 1 مل من محلول ملحي) بنسبة 1: 100 مرة في الماء و 3 ميكرولتر تستخدم كقالب في تفاعل 50 ميكرولتر و ه. القولونية حمل pCT ::أف تم استخدامه كعنصر تحكم إيجابي. في نهاية التجربة تم إجراء PCR لتحديد ما إذا كان هناك أي pCT:أف يمكن الكشف عن DNA البلازميد إذا لم يكن ذلك واضحًا من خلال الطلاء المباشر. تم قتل الفئران بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون2 فور الانتهاء من التجارب.

كانت مجموعات الفئران على النحو التالي. مجموعة 1 (المجموعة الضابطة): تلقوا طعامًا وشرابًا عاديين بالإضافة إلى ماء السكروز عندما تلقته مجموعات أخرى ولكن بدون بكتيريا أو مضادات حيوية. المجموعة 2 (مجموعة التحكم بالمضادات الحيوية): تناول الطعام والشراب العادي بالإضافة إلى ماء السكروز مع المضادات الحيوية عندما تلقت المجموعتان 3 و 4 المضادات الحيوية. المجموعة 3 (مجموعة التحكم في الاستعمار): تم استلامها ه. القولونية AL1 (pCT ::أف) في ماء السكروز للأيام 3-5 بالإضافة إلى كاناميسين للأيام 4-6 ، ثم الطعام العادي والماء لبقية التجربة ، المراقبة ه. القولونية AL1 (pCT ::أف) في البراز حتى نهاية التجربة. المجموعة 4 (علاج المجموعة التجريبية أ): تم استلامها ه. القولونية AL1 (pCT ::أف) في ماء السكروز لمدة 3 أيام بالإضافة إلى Kan (3 أيام) كمجموعة 3 ، ثم التحدي بـ ه. القولونية Nissle1917 (pCURE-K-307) للأيام 10-12 و Tet للأيام 11-13 والبراز الخاضع للمراقبة لمجموعات مختلفة من ه. القولونية (المستعمر الداخلي ، سلالات المعالجة والمتحدى). المجموعة 5 (علاج المجموعة التجريبية ب): وردت ه. القولونية AL1 (pCT ::أف) في ماء السكروز لمدة 3 أيام بالإضافة إلى Kan (3 أيام) ، ثم التحدي بـ ه. القولونية Nissle1917 (pCURE-K-307) لمدة 3 أيام ولكن بدون مضادات حيوية وبراز خاضع للمراقبة على النحو الوارد أعلاه. المجموعة 6 (علاج المجموعة التجريبية ج): تم استلامها ه. القولونية AL1 (pCT ::أف) في ماء السكروز لمدة 3 أيام بالإضافة إلى Kan (3 أيام) ، ثم التحدي بـ ه. القولونية Nissle1917 (pCURE-K-307) كل يوم لمدة 8 أيام (D10-17) وتم رصد البراز على النحو الوارد أعلاه.