معلومة

نشاط الجلوكوكيناز

نشاط الجلوكوكيناز


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

من Solomon et al ، 2013 علم الأحياء التركيبي ACC ومن هذا الفيديو:

هنا ، هناك تفاعلان متنافسان للجلوكوز - أحدهما يحتوي على glk باعتباره إنزيمًا والآخر يحتوي على gdh على شكل إنزيم.

في الرسم البياني ، يمثل المحور y إنتاجية غلوكونات والمحور x هو نشاط glk. منطقيا ، مع زيادة نشاط glk ، يجب أن ينخفض ​​إنتاج الجلوكونات.

هذا هو الحال بالنسبة لمعظم الرسم البياني. ولكن لماذا هناك زيادة في إنتاج الغلوكونات في البداية (عندما يكون نشاط glk في مكان ما بين 0.2 و 0.27)؟


بادئ ذي بدء ، دعنا نلقي نظرة على ما يريد هؤلاء الأشخاص تحقيقه: إنهم يريدون استخدام البكتيريا لصنع منتجات معينة. للقيام بذلك ، يريدون استغلال التمثيل الغذائي البكتيري في خطوات لا تتوفر فيها مسارات بديلة. إحدى هذه الخطوات هي الخطوة الأولى لتحلل الجلوكوز ، عندما يتحول الجلوكوز إلى جلوكوز 6 فوسفات (G6P). في البكتيريا ، تتم الفسفرة أثناء استيراد الجلوكوز إلى الخلية عن طريق "phosphoenolpyruvate (PEP): نظام كربوهيدرات فوسفوتانسفيراز" ، والذي يستخدم الفوسفورينول بيروفات كمصدر للفوسفات. هذا له عيب ، أنه لا يوجد جلوكوز حر داخل الخلية تقريبًا ، ولكن في الغالب G6P.

للتغلب على هذه المشكلة ، عبّرت المجموعة عن ناقلات بديلة (تنقل الجلوكوز إلى الخلية) و Glucokinase (Glk) للسماح للخلايا بالبقاء على قيد الحياة. أدت هذه الخطوات إلى فصل الاستيراد والفسفرة للجلوكوز وأسفرت عن جلوكوز حر داخل الخلية. يمكن الآن استخدام هذا الجلوكوز المجاني من خلال عمليات مختلفة. كما أنه يسمح بتحلل الجلوكوز ، لأن Glk فسفوريلات الجلوكوز الذي يدخل بعد ذلك مسار تحلل السكر. تم وضع Glk تحت مروجين مختلفين لعمل طفرات مختلفة من أجل اختبار كيفية تأثير التعبير المختلف لـ Glk على قابلية الخلايا للحياة.

لإحضار إنزيم آخر يقوم أيضًا باستقلاب الجلوكوز ، استخدموا الجلوكوز ديهيدروجينيز (Gdh) الذي تم التعبير عنه من البلازميد مع محفز قوي ومحفز IPTG. ثم استخدموا تركيزات مختلفة من IPTG لاختبار التأثير على إنتاج الجلوكونات وحيوية الخلية (لن أخوض في هذا).

الشكل أعلاه هو الشكل 5 من الورقة ويظهر تأثير تركيزات IPTG الثلاثة المختلفة المستخدمة للحث على التعبير عن Gdh. بالنسبة لـ 10 و 25 uM IPTG ، يقل إنتاج الغلوكونات ، وكلما زاد نشاط Glk. فقط النشاط الصغير يظهر عائدًا أقل. هذا مختلف تمامًا بالنسبة لأعلى تركيز ، ولكن هنا من المحتمل أن تتعطل الخلايا بسبب التعبير العالي لـ Gdh (الذي يستهلك أيضًا الكثير من الطاقة).

في الورقة لم يقدموا أي تفسير أو على الأقل يناقشون سلوك محصول الغلوكونات في أصغر نشاط Glk (أود قراءة تعليقات المراجعين على ذلك). من البيانات أتوقع إنتاجًا أعلى. من الممكن أن يكون لانخفاض إنتاج الطاقة (الكميات المنخفضة من G6P يعني القليل من تحلل السكر) آثار جانبية سلبية على الخلايا. من الممكن أيضًا أن يتم تثبيط Gdh في أنشطة Glk المنخفضة بواسطة بعض المواد الأخرى في الخلية. يتم تثبيط نشاط Gdh على سبيل المثال عن طريق تركيزات أعلى من nucleotidtriphosphates (ATP وما إلى ذلك) ، انظر هنا. نظرًا لأن Glk يحتاج إلى ATP كعامل مساعد ، فمن الممكن أن يكون لتركيز ATP في أنشطة Glk الأقل تأثيرًا سلبيًا على نشاط Gdh (تخميني الخاص).

أو أنها مجرد قطعة أثرية من التجربة. يحتوي هذا على بعض النقاط التي يمكن نقدها (أود أن أرى تعليقات المراجعين هنا أيضًا). أولاً ، تكون أشرطة الخطأ كبيرة جدًا ، لذا يمكن أن يكون هذا أيضًا مختلفًا إلى حد ما. في النص يذكرون أن البيانات تم الحصول عليها من قبل

ما لا يقل عن 2 ثقافات متوازية في تجربة تمثيلية

أتوقع المزيد من التكرار (ثلاث تجارب مستقلة على الأقل) ، مما يجعل البيانات أكثر موثوقية. ثم (وهذه النقطة أكثر أهمية) لا يمكنهم قياس نشاط Glk و Gdh في نفس الثقافة بسبب القيود في نظام الكشف. تستخدم قياسات نشاط Glk نظامًا مقترنًا يقيس في النهاية تغير التركيز في NADH ، بينما يستخدم Gdh NADPH كعامل مساعد. لا يمكن التمييز بين كلا الإصدارين من خلال قياس الطيف ، لذلك لا يمكن إجراء قياسات نشاط Glk إلا في الخلايا غير المنقولة. نظرًا لأن التعبير يغير الظروف في الخلية (ولا نعرف كيف) ، أتوقع على الأقل بعض النقاش حوله ، لكنه مفقود.


السيطرة قصيرة المدى على نشاط الجلوكوكيناز: دور البروتين التنظيمي

الجلوكوكيناز هو واحد من أربعة سداسيات موجودة في أنسجة الثدييات. يتم التعبير عنه في نوعين من الخلايا التي يجب أن تستجيب للتغيرات في تركيز الجلوكوز في الدم ، خلية الكبد المتني وخلايا بيتا في جزر البنكرياس. الأول مسؤول عن التمثيل الغذائي وتخزين جزء مهم من الجلوكوز المبتلع ، في حين أن الأخير يفرز الأنسولين استجابة لزيادة مستوى الجلوكوز في الدم. تتمثل إحدى الخصائص الرئيسية للجلوكوكيناز في أنه يحتوي على تقارب منخفض نسبيًا للجلوكوز ويعرض تعاونًا إيجابيًا لهذه الركيزة ، على الرغم من حقيقة أنه إنزيم أحادي. علاوة على ذلك ، على عكس الهكسوكينازات الأخرى ، لا يتم تثبيطه بواسطة تركيزات ميكرومولار (فسيولوجية) من الجلوكوز 6-فوسفات ولكن عن طريق البروتين التنظيمي الذي ينقل تأثير الفركتوز 6-فوسفات والفركتوز 1-فوسفات. الغرض من هذه المراجعة هو وصف هذه الجوانب من تنظيم الجلوكوكيناز. - Van Schaftingen، E.، Detheux، M.، Veiga da Cunha، M. التحكم قصير المدى في دور نشاط الجلوكوكيناز للبروتين التنظيمي. FASEB J. 8: 414-419 1994.


مقالة منظور

  • 1 برنامج العلوم الطبية الحيوية المترجم ، كلية الدراسات العليا ، جامعة أوهايو ، أثينا ، أوهايو ، الولايات المتحدة
  • 2 معهد السكري ، كلية التراث لطب تقويم العظام ، جامعة أوهايو ، أثينا ، أوهايو ، الولايات المتحدة
  • 3 قسم العلوم الطبية الحيوية ، كلية التراث لطب تقويم العظام ، جامعة أوهايو ، أثينا ، أوهايو ، الولايات المتحدة

خلايا بيتا البنكرياس هي الخلايا الوحيدة في الجسم التي يمكنها تصنيع الأنسولين وإفرازه. من خلال عملية إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز ، تطلق خلايا بيتا الأنسولين في الدورة الدموية ، مما يحفز امتصاص الجلوكوز المعتمد على GLUT4 في الأنسجة المحيطية. يُفرز الأنسولين عادة في نبضات تعزز الإشارات في الكبد. قبل وقت طويل من تشخيص مرض السكري من النوع 2 ، تصبح خلايا بيتا شديدة الحساسية للجلوكوز ، مما يتسبب في ضعف النبض والإفراط في التحفيز في مستويات الجلوكوز الصيام. يمكن أن يتسبب فرط إفراز الأنسولين الناتج في ضعف إشارات الأنسولين وتخليصه في الكبد ، مما يؤدي إلى فرط أنسولين الدم ومقاومة الأنسولين. يمكن أن يؤدي النشاط المفرط المستمر في النهاية إلى استنفاد خلايا بيتا وفشلها عند النقطة التي يبدأ فيها مرض السكري من النوع 2. لمنع أو عكس الآثار السلبية للإفراط في التحفيز ، يمكن تقليل نشاط خلايا بيتا. كشفت الدراسات السريرية عن إمكانية استعادة خلايا بيتا لعكس حالات مرض السكري الجديدة ، لكن العلاجات تفتقر إلى الفوائد الدائمة. في هذا المنظور ، نقترح تدخلًا يقلل من نشاط الجلوكوكيناز المفرط في خلية بيتا. يُعرف الجلوكوكيناز باسم مستشعر الجلوكوز لخلية بيتا نظرًا لتحكمه العالي في إفراز الأنسولين. لذلك ، قد يكون فرط نشاط حال السكر مسؤولاً عن فرط أنسولين الدم في وقت مبكر من المرض ويمكن تقليله لاستعادة اقتران التحفيز والإفراز الطبيعي. لقد أبلغنا سابقًا أن تقليل نشاط الجلوكوكيناز في جزر الفئران المصابة بمرض السكر يمكن أن يعيد النبض ويعزز إفراز الأنسولين. بناءً على هذه النتيجة غير البديهية ، نراجع أهمية إفراز الأنسولين النابض ونسلط الضوء على كيفية تطبيع استشعار الجلوكوز في خلية بيتا أثناء فرط أنسولين الدم قبل السكري قد يعيد النبض ويحسن توازن الجلوكوز.


نتائج

يتفاعل الجلوكوكيناز مع الأرجينين في خلايا بيتا

لتقييم مدى دعم الأرجينين لـ GSIS ، تم زرع خلايا NIT-1 مسبقًا في وسط مستنفد للأرجينين لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، تمت إضافة الجلوكوز إلى الوسط وتم تحليل إفراز الأنسولين (الشكل 1 أ). أدى استنفاد الأرجينين إلى إضعاف GSIS من خلايا NIT-1. ومن المثير للاهتمام أن إعطاء G6P تسبب في إفراز الأنسولين المعتمد على الجرعة مع أو بدون استنفاد الأرجينين (الشكل 1 ب). تم تأكيد زيادة G6P داخل الخلايا بواسطة إدارة G6P عن طريق قياس الطيف الكتلي (الشكل التكميلي 1 أ ، ب). وبالتالي ، فإن الأرجينين ضروري لإفراز الأنسولين استجابة للجلوكوز ولكن ليس لـ G6P مما يشير إلى أن الأرجينين قد يلعب دورًا في إنتاج G6P بواسطة GCK في خلايا بيتا.

أ, ب أنقذ الجلوكوز 6 فوسفات (G6P) الحد من إفراز الأنسولين في غياب إل-ارجينين في خلايا NIT-1. في حضور إل- إفراز الأنسولين الناجم عن الأرجينين والجلوكوز و G6P. في غياب إل-ارجينين ، فقط G6P (دائرة مفتوحة في ب) ، ولكن ليس الجلوكوز (افتح دائرة في أ) يسبب إفراز الأنسولين. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 4). ج تحضير خيوط نانوية مغناطيسية مثبتة بأرجينين 18. تم تحليل مجموعات الإيبوكسي على حبات FG بواسطة NH4إلى جانب OH و EGDE. تم إعادة aminolyzed مجموعات الايبوكسي بواسطة NH4أوه. ثم تم إقران الخرزات بمجموعات كربوكسيل من إل-ارجينين في DMF الذي يحتوي على EDC و trimethylamine و DMAP (الشكل التكميلي 1). د يرتبط الجلوكوكيناز بـ إل- الأرجينين والجلوكوز مباشرة. تم خلط الجلوكوكيناز المنتج في خلية HEK293 المنقولة بواسطة ناقل تعبير الجلوكوكيناز- HA مع حبات الأرجينين أو الجلوكوز المعطلة باستخدام حبات بدون أرجينين أو جلوكوز كعنصر تحكم سلبي. على حد سواء إل- الأرجينين والجلوكوز يرتبطان بجلوكوكيناز- HA. ه تم التخلص من Glucokinase-HA المرتبط بالجلوكوز المعطّل بواسطة إل- الأرجينين والجلوكوز. منضمة Glucokinase-HA إلى إلتم التصفية من حبات الأرجينين بواسطة إل- أرجينين ولكن ليس عن طريق الجلوكوز. F يتشارك الجلوكوكيناز مع الأنسولين في الحبيبة الإفرازية وليس في الشبكة الإندوبلازمية (ER) وجهاز جولجي في خلايا NIT-1. جلوكوكيناز (أخضر) ، أنسولين (أرجواني) ، ER (أرجواني ، كيديل) ، رابطة الدول المستقلة- تم تلوين جولجي (أرجواني ، GM130) ، والنواة (أزرق) وتم دمج الصور في الأسفل. أظهر الجلوكوكيناز نسبة عالية من التلون مع الأنسولين وأقل تركيزًا مع شبكة ER و Golgi مما يشير إلى أن الجلوكوكيناز يقع أساسًا في الحويصلات الإفرازية. شريط مقياس 20 ميكرومتر.

لقد أوضحنا سابقًا أن PFK1 و PFK2 و HXK1 في مستخلص خلية هيلا عبارة عن بروتينات مرتبطة بالأرجينين باستخدام تقنية نانوبيدات مغناطيسية معطلة بالأرجينين (الشكل 1 ج ، الشكل التكميلي 1 والمرجع 18). بالنظر إلى أن PFK1 / 2 و HXK1 هما إنزيمات من تحلل السكر 22،23 ، قد يعمل الأرجينين كمنظم رئيسي لتحلل السكر. وهكذا ، افترضنا أن الأرجينين يربط أيضًا GCK ويعمل كمنشط لـ GCK في خلايا بيتا. عند اختباره باستخدام حبيبات نانوية مغناطيسية مثبتة بالجلوكوز أو الأرجينين (الشكل 1 ج ، الشكل التكميلي 1 والمرجع 18) ، يرتبط GCK بكل من الجلوكوز والأرجينين (الشكل 1 د). بعد ذلك ، اختبرنا ما إذا كان الجلوكوز والأرجينين يتنافسان على ربط GCK بالكرات النانوية المغناطيسية المعطلة (الشكل 1 هـ). تم التخلص من GCK المرتبط بالجلوكوز المعطّل بواسطة الجلوكوز والأرجينين ، على الرغم من أن ارتباط GCK بالأرجينين المعطّل كان أقل تنافسًا مع الجلوكوز (الشكل 1 هـ) مما يشير إلى ارتباط أقوى لـ GCK بالأرجينين مقارنة بالجلوكوز. بعد ذلك ، تم تحليل توطين GCK داخل الخلايا بالكيمياء المناعية في خلايا NIT-1 (الشكل 1f). تم دمج إشارة GCK بشكل أساسي مع الأنسولين في الحويصلات الإفرازية وجزئيًا مع proinsulin في ER بالاتفاق مع التقرير السابق 24،25.

إل- يحفز الأرجينين إنتاج G6P وإفراز الأنسولين

يشير الشكل 1 بشكل جماعي إلى أن الأرجينين يروج لـ GSIS من خلال التفاعل المباشر مع GCK. كخطوة تالية ، قمنا بتحليل ما إذا كان الأرجينين يغير نشاط GCK في خلايا NIT-1. إدارة الجلوكوز أو إل- أرجينين إلى خلايا NIT-1 زاد من G6P لكن الأيزومر الفراغي د- الأرجينين يفشل في زيادة G6P (الشكل 2 أ). ومن المثير للاهتمام أن تحريض إفراز الأنسولين كما يظهر على أنه اختلاف في إفراز الأنسولين عند 0.5-1.5 دقيقة عند 7 مليمول / لتر جلوكوز يكون أسرع بعد إل-ارجينين مقارنة مع د-ارجينين (الشكل 2 ب). إل- يحفز الأرجينين إفراز الأنسولين أقوى من د- الأرجينين في وجود الجلوكوز ولكن ليس في حالة عدم وجود الجلوكوز (بدون أرجينين ، والشكل 2 ج ، د). GCK ملزمة إلتم التصفية من الأرجينين بواسطة إل-ارجينين ولكن ليس بها د- أرجينين يشير إلى أن فقط إل-ارجينين يتفاعل مع GCK ​​(الشكل 2 هـ). إلتقطناها معا، إل- الأرجينين يربط بشكل تجسيمي GCK ، ويزيد من محتويات G6P ، ويعزز إفراز الأنسولين. من الجدير بالذكر أنه يمكن تحفيز إفراز الأنسولين المستقل عن الجلوكوز بواسطة كليهما إل- و د- الأرجينين ، والذي يرجع على الأرجح إلى UGGT1 ، وهو بروتين آخر مرتبط بالأرجينين يرتبط بكليهما إل- و د-ارجينين (الشكل التكميلي 2 أ-د) 26.

أ إلحفز الأرجينين (2 مليمول / لتر) والجلوكوز (7 مليمول / لتر) إنتاج G6P في خلايا NIT-1 ، ولكن الأيزومر الفراغي د- الأرجينين (2 مليمول / لتر) لم يحفز إنتاج G6P. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 6). ب مليمول / لتر إليزيد إفراز الأنسولين الناجم عن الأرجينين قليلاً عن 1 مليمول / لتر د- الأرجينين يعمل في خلايا NIT-1 β. إل- أو د- أرجينين كانت تدار إل-الارجينين المستنفد لخلايا NIT-1. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 3). *ص & lt 0.05 (ن = 6). ج في وجود الجلوكوز ، إل- يحفز الأرجينين إفراز الأنسولين أكثر من دأرجينين. في حالة عدم وجود الجلوكوز ، كلاهما إل- و د- يحفز الأرجينين إفراز الأنسولين بالمثل. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 3). *ص & lt 0.05 (ن = 6). د مليمول / لتر إل- الأرجينين يزيد من إفراز الأنسولين المعتمد على الجلوكوز. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 3). *ص & lt 0.05 (ن = 6). ه منضمة الجلوكوكيناز إلى إل-ارجينين لكن لم يلتزم به دأرجينين. من الجدير بالذكر أن UGGT1 يرتبط بـ إل- و د-ارجينين (الشكل التكميلي 2 أ والمرجع 26).

تشارك ثلاث بقايا من الغلوتامات في تأشير الأرجينين

لتحديد المخلفات داخل GCK المطلوبة للربط بـ إل- يحفز إفراز الأرجينين والأنسولين إل-ارجينين ، تم تحضير وتحليل خمسة طفرات من GCK (Y214C و E256K و A456V و E157T و E443Δ) (الشكل 3 والشكل التكميلي 3). تم اختيار المخلفات بناءً على طفرات المريض MODY2 11،26،27،28،29،30 وورقتنا السابقة التي توضح تفاعل الحمض الأميني الموجب أرجينين مع بقايا الجلوتامات الحمضية 26. من النوع البري و E443Δ GCK ملزمة إل- الأرجينين بقوة ملزمة لـ إلبالكاد لوحظ الأرجينين لطفرات GCK E256K و E157T (الشكل 3 أ والشكل التكميلي 3 أ ، ب). عند إفراز الأنسولين استجابة ل إلتمت مقارنة -ارجينين لجميع المسوخات الخمسة ، تم إعاقة إفراز الأنسولين لثلاثة طفرات GCK ، وهي E256K و A456V و E443Δ (الشكل 3 ب). وبالتالي ، يبدو أن بقايا E256 مهمة لكليهما إل- ملزمة الأرجينين و إل- إفراز الأنسولين الناجم عن الأرجينين. من ناحية أخرى ، فإن بقايا E443 ضرورية لـ إل-إفراز الأنسولين الناجم عن الأرجينين ولكن ليس للربط إل-ارجينين إلى GCK. على الرغم من أن E443Δ لم يكن كافياً لمنع ربط إل-ارجينين لـ GCK ، لاحظنا أن هناك مجموعة من المخلفات E (E442 ، و E443) في المنطقة C- الطرفية من GCK 26. باستخدام بيانات بنية GCK (المرجع 31 ، PDB-1V4S ، و 1 V4T) ، توقعنا الموضع ثلاثي الأبعاد لمخلفات E الثلاثة (E256 ، E442 ، و E443) على بروتين GCK (الشكل التكميلي 3 ج ، د) ووجدناه أن هذه البقايا تخلق بنية تشبه البوابة يمكن أن تكون بمثابة جيب ملزم لـ إلأرجينين. لذلك ، صنعنا متحولة ثلاثية E256 / 442 / 443R (الشكل 3e-g) ووجدنا أن متحولة GCK أظهرت ضعفًا ملحوظًا في ارتباط الأرجينين (الشكل 3 هـ) ، الزيادة في G6P بمقدار إل-ارجينين (الشكل 3 و) ، وإفراز الأنسولين الناجم عن الأرجينين (الشكل 3 ز). مجتمعة ، تشارك بقايا E256 و E442 و E443 من GCK إل- ارتباط الأرجينين وإفراز الأنسولين.

أ أظهرت طفرات الجلوكوكيناز E256K و E440 / 442 / 3R و E442 * ارتباطًا منخفضًا بـ إلحبات مثبتة بالأرجينين عند تحليل العديد من بروتينات الجلوكوكيناز (الشكل التكميلي 2 ب). ب أظهرت خلايا NIT-1 التي تعبر عن طفرات E256K و E443Δ و A456V-glucokinase انخفاضًا في إفراز الأنسولين استجابةً لـ إل-ارجينين مقارنة مع تلك التي تعبر عن WT جلوكوكيناز. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 3, أ و ب). ج, د توجد ثلاث بقايا جلوتامات من E256 و E442 و E443 من الجلوكوكيناز بشكل وثيق وتشكل بنية تشبه البوابة لربط إل- الأرجينين بناءً على البيانات الهيكلية لبروتين الجلوكوكيناز (PDB-1V4S 31). ضعف ارتباط الأرجينين (ه) ، إنتاج G6P (F) ، وإفراز الأنسولين (ز) في خلايا NIT-1 التي تعبر عن جلوكوكيناز متحولة E256 / 442 / 443R. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 3). *ص & lt 0.05 (ن = 6, F و ز).

ضعف إفراز الأنسولين في مرضى E442 * MODY2

قمنا بفحص 489 مريضًا من مرضى MODY اليابانيين بحثًا عن متغيرات GCK التي تتضمن E442 و E443 وحددنا موضوعًا باستخدام GCK E442 * المتغير (الأشكال التكميلية 3 أ و S4a والمراجع 27 ، 28 ، 29). عندما تم اختبار موضوع مع GCK ​​E442 * المتغير (الشكل 4 أ ، ب والشكل التكميلي 4 ب) وموضوعين صحيين آخرين ، أظهر الموضوع E442 * قيمة أقل لتقييم نموذج التماثل الساكن للخلايا β (الشكل 4 أ) . أظهر موضوع المتغير GCK E442 * إفرازًا أقل للإنسولين أثناء الصيام. في اختبار تحمل الأرجينين ، أظهر المتغير E442 * نسبة أقل من الببتيد C إلى الجلوكوز (المرجع 32 والشكل 4 ب) ، مما يشير إلى ضعف إفراز الأنسولين استجابة للأرجينين. عندما يتم التعبير عنها في خلايا NIT-1 ، أظهرت طفرات E442 * و E442 / 443R GCK انخفاض إفراز الأنسولين الناجم عن الأرجينين (الشكل 4 ج) ، GSIS (الشكل التكميلي 4 ج) ، ومستويات G6P في وجود أرجينين (الشكل 4 ج). 4 د). تشير بياناتنا من موضوع GCK ​​E442 * والطفرات المماثلة التي تمت دراستها في خلايا NIT-1 إلى ذلك إلينظم الأرجينين إفراز الأنسولين المعتمد على GCK ، والذي لم يكن واضحًا من مجموعة من الطفرات التي درستها دراسة بويو 16.

تقييم نموذج التماثل الساكن للخلية β (HOMAβ ، أ) ونسبة C- الببتيد إلى الجلوكوز (ب) في موضوع مع طفرة الجلوكوكيناز E442 * مقارنة مع اثنين من الضوابط مع WT glucokinase. يشير انخفاض HOMAβ إلى انخفاض القدرة على إفراز الأنسولين بعد حالة الصيام (أ). نسبة C- الببتيد إلى الجلوكوز هي واحدة من العلامات التي توضح كفاءة إفراز الأنسولين 32 (ب). ج إل- تم تقليل إفراز الأنسولين الناجم عن الأرجينين في خلايا NIT-1 التي عبرت عن E442 * و E442 / 3R جلوكوكيناز متحولة عن طريق العدوى بواسطة pCDNA-GCK-HA وناقلات تعبير الأنسولين. د ردا على إنتاج G6P إل- تم تقليل الأرجينين في خلايا NIT-1 التي تعبر عن E442 * و E442 / 3R جلوكوكيناز متحولة عن طريق العدوى مع pCDNA-GCK-HA وناقلات الأنسولين. تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 3). *ص & lt 0.05 (ن = 6).

يحمي الأرجينين GCK من التواجد في كل مكان والتدهور

بعد ذلك ، تناولنا آلية يؤدي من خلالها ربط الأرجينين بـ GCK إلى زيادة مستويات G6P في خلايا بيتا. لاحظنا أن GCK يحتوي على شكل يوبيكويتين المتفاعل (UIM 33،34) في المحطة C 35،36 بالقرب من بقايا E442. لم نلاحظ أي اختلاف في إجمالي البروتينات المنتشرة في المحللات في وجود أو عدم وجود أرجينين عندما تم اكتشاف البروتينات المنتشرة باستخدام ناقل تعبير يوبيكويتين- Myc (الشكل 5 أ). ومع ذلك ، لوحظ وجود GCK في كل مكان فقط بعد استنفاد أرجينين (الشكل 5 أ) مما يشير إلى أن الأرجينين يمنع انتشار GCK. بالنظر إلى أن مستوى الأرجينين في الدم ينخفض ​​أثناء الصيام (الطويل) ، فإن إطلاق الأرجينين من GCK قد يزيد من تحلل البروتين بوساطة يوبيكويتين من GCK عندما يتم تقليل توافر الجلوكوز ومتطلبات إفراز الأنسولين أثناء الصيام. أدى العلاج لمدة 12 ساعة لخلايا NIT-1 بواسطة مثبط البروتوزوم MG132 إلى زيادة مستوى WT GCK بمقدار عشرة أضعاف تقريبًا ولكنه لم يغير مستوى البروتين المتحور E256K (الشكل 5 ب). يسبب إفراز الأنسولين إلتمت زيادة -ارجينين أيضًا في وجود MG132 في خلايا NIT-1 التي تعبر عن WT GCK ولكن ليس تلك التي تعبر عن E256K (الشكل التكميلي 5 أ). أشارت البيانات إلى ذلك

يتحلل 90 ٪ من وزن GCK في غضون 24 ساعة مما يدعم الفرضية القائلة بأن استنفاد الأرجينين يسرع من تدهور GCK من خلال الانتشار. ومع ذلك ، يبدو أن وجود مستويات منخفضة من GCK يكفي لزيادة إفراز الأنسولين استجابة لذلك إل- أرجينين مما يدل على أن التفاعل المباشر بين إليزيد الأرجينين و GCK بشكل حاد من GSIS (الشكل التكميلي 5 ب ، ج). بعد ذلك ، لمعالجة كيفية تسريع انتشار GCK في كل مكان في غياب الأرجينين ، اختبرنا دور cereblon ، وهو E3 ubiquitin ligase الوحيد الذي يحرضه الدواء (الثاليدومايد ومثيلاته ، عقاقير imonomodulation imide) بين أكثر من 500-1000 E3 يوبيكويتين ligases في البشر 19،20،21. في خلايا HEK293 التي تم فيها إخراج المخيخ ، وجدنا أن المخيخ لا غنى عنه لمراقبة انتشار GCK (الشكل 5 ج والشكل التكميلي 5 د). باستخدام تحليل الطفرات ، تبين أن اثنين من بقايا اللايسين من K458 و K459 مسؤولان عن التواجد المعتمد على المخ والذي يتم تقليله بواسطة الأرجينين (الشكل 5 د). منعت طفرة K458 / 459R التواجد في كل مكان في غياب الأرجينين مما يشير إلى أن هذه البقايا مسؤولة عن التواجد المعتمد على الأرجينين من بين 26 بقايا ليسين في GCK (الشكل 5 د). عندما تم نقل خلايا HEK293 باستخدام نواقل تعبير GCK و ubiquitin و cereblon ، انخفض كلا التعبير عن GCK المحدد بواسطة لطخة غربية ومحتويات G6P لأكثر من 4 ساعات تحت استنفاد أرجينين في WT معربًا عن الخلايا بينما ظل كلا المستويين دون تغيير في E256K معربًا عن الخلايا (الشكل 5 هـ). ، F). بالإضافة الى، إل- أظهر الأرجينين أنه يقلل من التفاعل بين GCK و cereblon (الشكل 5g). وعلاوة على ذلك، إل- يحفز الأرجينين نشاط GCK في المختبر (الشكل 5 ح والشكل التكميلي 5 هـ). مجتمعة ، يبدو أن cereblon يرتبط بـ GCK في غياب الأرجينين ويوجد GCK ، بينما تفصل إدارة الأرجينين GCK عن cereblon وتعزز فسفرة الجلوكوز بواسطة GCK للحث على إفراز الأنسولين (الشكل التكميلي 5f).

أ أرجينين يمنع انتشار الجلوكوكيناز. تم نقل خلايا NIT-1 باستخدام ناقل تعبير يوبيكويتين- Myc وتعرضت لنضوب أرجينين. تم تصور مقتطفات Lysate ، و control ، و glucokinase-IPed مع الأجسام المضادة لـ Myc. ب منعت فترة الحضانة لمدة 24 ساعة مع مثبط البروتوزوم MG132 تقليل الجلوكوكيناز WT ، ولكن كان لها تأثير ضئيل على التعبير ومستوى انتشار الجلوكوكيناز المتحول E256K. ج شوهد تواجد الجلوكوكيناز- HA في خلايا WT HEK293 ، ولكن ليس في خلايا cereblon KO HEK293. يظهر الحد من المخ في خلايا cereblon KO في الشكل التكميلي 5 أ. د بقايا K458 و K459 من الجلوكوكيناز مطلوبة من أجل التواجد في كل مكان الذي يعتمد على الأرجينين والمعتمد على cereblon في غياب الأرجينين. تم تحضين خلايا NIT-1 المنقولة باستخدام WT أو E442 * أو K458 / 459R ، وناقلات تعبير الجلوكوكيناز جنبًا إلى جنب مع ناقلات التعبير cereblon-FLAG و ubiquitin-Myc في وسط مستنفد من الأرجينين. أدى استنفاد الأرجينين إلى خفض بروتين WT glucokinase (ه) والنشاط (F). تمثل البيانات المتوسط ​​± S.E. (ن = 3). *ص & lt 0.05 (ن = 6). ز أرجينين يمنع تفاعل الجلوكوكيناز والمخيم. ح يزيد الأرجينين من إنتاج G6P بواسطة بروتين الجلوكوكيناز المؤتلف في النظام الخالي من الخلايا. (ن = 6).


النتائج

GFP الموسوم بعلامات GFP نشط تحفيزيًا عند التعبير عنه في MIN6.

تعداء عابر لـ MIN6 مع GK الموسومة بـ GFP في أي من NH2- أو COOH-terminal كان مرتبطًا بالنشاط المناعي لـ GK عند 62-64 كيلو دالتون ، كما هو متوقع ، وبزيادة من 7 إلى 10 أضعاف في نشاط GK ، مما يؤكد أن GK الموسوم بـ GFP نشط تحفيزيًا (الشكل 1).أ). نظرًا لأن الفحص المجهري الفلوري أظهر عدم تجانس كبير بين الخلايا في تعبير GFP بعد تعداء عابر ، فقد أنشأنا خطوطًا مستقرة للخلايا غير النسيليّة عن طريق اختيار G418. كان نشاط GK الممنوح بواسطة GFP الموسوم GFP مستقرًا خلال الممرات المبكرة (& ltp9) ولكنه انخفض في المقاطع اللاحقة (الشكل 1).ب). وبالمثل ، انخفض GK-mRNA البشري مع المرور التدريجي (خمسة إلى ثمانية أضعاف بين p9 و p19). كان التعبير عن GK-mRNA الداخلي (الفئران) مشابهًا في خطوط الخلايا GK GFP و GFP GK (125 و 93 ٪ ، على التوالي) كما هو الحال في MIN6 غير المنقولة. كان تقارب GK للجلوكوز (مليمول / لتر) متشابهًا في مقتطفات من خلايا GK GFP و GFP GK (8.9 ± 0.3 و 8.9 ± 0.8 ، على التوالي) كما في MIN6 overexpressing GK غير الموسومة مع ناقل غدي (8.5 ± 0.6). تمت زيادته بالمثل بواسطة GKA (32) في خطوط الخلايا (2.3 ± 0.3 و 2.1 ± 0.1) كما هو الحال في MIN6 غير المنقولة (2.8 ± 0.3) ، مما يشير إلى أن علامة GFP لا تؤثر على تقارب الجلوكوز أو التنشيط بواسطة GKA .

آثار تنشيط GK والإفراط في التعبير على إفراز الأنسولين.

كان إفراز الأنسولين الناجم عن الجلوكوز مشابهًا في خطوط الخلايا GK GFP و GFP GK كما هو الحال في المرور المبكر غير المنقوص MIN6 (الشكل 2).أ). يعتمد إفراز الأنسولين في خلايا بيتا على نشاط GK (36) وعلى الحالة المتمايزة ، والتي تنخفض في MIN6 مع مرور (37). تم اعتبار خطوط الخلايا النسيليّة المنقولة باستخدام GFP وحدها عنصر تحكم غير مناسب لأنها أظهرت زيادة أكبر في الانخفاض كم هيكسوكيناز مع مرور متزايد من خطوط خلايا GFP GK ، مما يشير إلى زيادة التمايز (النتائج غير معروضة). على العكس من ذلك ، قد يمثل الممر المبكر غير المنقوص MIN6 حالة أكثر تمايزًا من خطوط خلايا GFP GK ، والتي يمكن أن تفسر إفراز الأنسولين المماثل الناجم عن الجلوكوز (الشكل 2).أ). للتحقيق في تأثير نشاط GK وتركيزه على إفراز الأنسولين بشكل مستقل عن رقم المرور أو الحالة المتمايزة لـ MIN6 ، قمنا بمقارنة تأثير الإفراط في التعبير الغدي المعاير لـ GK غير الموسوم مع تنشيط GK الدوائي. في حين أن الإفراط في التعبير عن GK كان له تأثير ضئيل على إفراز الأنسولين بغض النظر عن تركيز الجلوكوز (الشكل 2).أ) ، تسبب GKA في تحفيز كبير عند 3 مليمول / لتر جلوكوز (الشكل 2ب). تم الحصول على نتائج مماثلة عندما تم تحديد إفراز الأنسولين في جزر الفئران. تسبب GKA في تحفيز بمقدار 2.6 ضعفًا (ص & lt 0.01) ، في حين أن التعبير الزائد GK (الذي أكده التجلط المناعي) لم يكن له تأثير كبير (الشكل 2).ج).

الموقع دون الخلوي للوهم GK الموسومة بـ GFP في MIN6 وخلايا الكبد.

تم توضيح تحديد موقع GK مع حبيبات الأنسولين في خلايا البنكرياس عن طريق الفحص المجهري المناعي (38-41) (الشكل 3)أ) ، المجهر الإلكتروني (38،41) ، والتجزئة تحت الخلوية (31). لتحديد ما إذا كان GK الموسوم بعلامات GFP مع حبيبات الأنسولين ، كانت خطوط خلايا GFP GK وخلايا MIN6 المنقولة بشكل عابر باستخدام GFP GK ملطخة للأنسولين (أحمر) وتم تصورها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. أظهر GK الداخلي تآلفًا واضحًا مع الأنسولين الداخلي (الشكل 3أ) ، في حين أظهر GFP GK المعبر عنه بشكل عابر تلازمًا ضئيلًا (الشكل 3ب) وأظهر GFP GK المعبر عنه بثبات تآلف جزئي مع الأنسولين (الشكل 3ج).

عندما تم نقل بنيات GK GFP و GFP GK عابرًا إلى خلايا كبدية ، تراكم كلا البروتينين في النواة أثناء الحضانة باستخدام 5 مليمول / لتر من الجلوكوز (النتائج غير معروضة) ، مما يشير إلى أن علامة GFP لا تتداخل مع الارتباط بـ GKRP النووي ، بالاتفاق مع النتائج السابقة مع NH2- علامة GFP الطرفية (42).

تأثير MG132 على التعبير عن chimeras GK الموسومة بـ GFP.

اختبرنا ما إذا كان يمكن منع الانخفاض في التعبير الجيني في المقاطع المتأخرة عن طريق تثبيط التحلل البروتيني باستخدام MG132. لم يكن لـ MG132 أي تأثير في MIN6 غير المنقولة أو MIN6 المفرط في التعبير عن GK غير الموسوم ، ومع ذلك ، فقد زاد نشاط GK والنشاط المناعي (64 كيلو دالتون) في خطوط خلايا GK GFP (الشكل 4).أ). لاختبار ما إذا كانت هذه الزيادة في نشاط GK والنشاط المناعي ناتجة عن تثبيط تدهور البروتين ، حددنا تأثير MG132 في وجود سيكلوهيكسيميد لتثبيط تخليق البروتين. على الرغم من انخفاض نشاط GK في وجود سيكلوهكسيميد ، لم يتم منع هذا الانخفاض بواسطة MG132 ، باستثناء التأثير على تدهور البروتين (الشكل 4).ب). تسبب MG132 في زيادة كبيرة في GK mRNA البشري في خطوط خلايا GFP GK (100 إلى 200 ضعف) (الشكل 4).ج). تم إلغاء هذا بواسطة مثبط النسخ ، أكتينوميسين D (الشكل 4ج) ، مما يشير إلى أن MG132 زاد من التعبير الجيني. تم استخدام MG132 في بقية الدراسة لزيادة التعبير الجيني.

التفعيل الدوائي لـ GK.

أظهرت الدراسات الحركية السابقة للإنزيم على بروتينات الانصهار GST-GK المنقى أن طفرات V62M و G72R تحتوي على نسبة أقل من س0.5 للجلوكوز من GK من النوع البري ولم يتم تنشيطه بواسطة GKA (24،25). لقد حددنا تقارب الجلوكوز في GFP V62M و GFP G72R في مقتطفات الخلايا لخطوط الخلايا النسيليّة المزروعة مسبقًا باستخدام MG132 (انظر أعلاه). كان كلا الطافرين أقل س0.5 للجلوكوز من النوع البري (النوع البري ، 9.0 ± 1.0 V62M ، 5.2 ± 0.4 G72R ، 4.6 ± 1.0 مليمول / لتر) ، ولم يتم تنشيط أي منهما بشكل كبير بواسطة GKA (32) (الشكل 5)أج). لم يكن هناك تأثير MG132 على ألفة الجلوكوز (الشكل 5د).

نشاط GK والنشاط المناعي لـ GFP V62M و GFP G72R في خطوط الخلايا النسيليّة.

تم تحديد النشاط التحفيزي والنشاط المناعي للطفرات GK في خطوط الخلايا النسيليّة GFP V62M و GFP G72R ومقارنتها مع خطين من الخلايا النسيليتين يعبران عن GFP من النوع البري GFP (WT3B و WT10B). تم تحديد نشاط GK ، والنشاط المناعي ، و mRNA بعد الاستزراع الأولي مع MG132 أو بدونه ، مما تسبب في زيادة كبيرة في التحوير mRNA ، وبروتين GK ، والنشاط (الشكل 6).أج). كان لدى GFP V62M و GFP G72R نشاط GK أقل من الحيوانات المستنسخة من النوع البري (الشكل 6).د) عند التعبير عنها بالنسبة إلى النشاط المناعي أو الرنا المرسال (الشكل 6ه و F). لم يكن هناك فرق كبير في نشاط مناعة GK بالنسبة لمستويات الرنا المرسال لأي متحولة مقارنة مع الحيوانات المستنسخة من النوع البري ، مما يشير إلى عدم استقرار النشاط التحفيزي ولكن ليس البروتين المناعي.

دراسات تعداء عابرة مع GFP V62M و GFP G72R.

تم تحديد نسبة النشاط إلى النشاط المناعي أيضًا بعد تعداء عابر لـ MIN6 بكميات متفاوتة من البلازميد من GFP GK (النوع البري) و GFP V62M و GFP G72R (الشكل 7).أ و ب). أظهرت مخططات نشاط GK ضد النشاط المناعي انخفاضًا في نسبة النشاط إلى النشاط المناعي لكل من GFP V62M و GFP G72R مقارنةً بالنوع البري GFP GK (الشكل 7).ج) ، وهو ما يتوافق مع النتائج المستخلصة من خطوط الخلايا النسيليّة.

تم تحديد تأثير GKA (35) على إفراز الأنسولين في MIN6 التي كانت إما غير منقولة أو منقولة بشكل عابر باستخدام تركيبات GFP. زاد GKA (ص & lt 0.05) إفراز الأنسولين عند 5 مليمول / لتر من الجلوكوز في جميع الظروف الأربعة المختبرة (غير المنقولة ، 1.7 ± 0.2 إلى 2.7 ± 0.1 GFP GK ، 1.8 إلى 0.1 إلى 3.6 ± 0.1 GFP V62M ، 1.7 ± 0.1 إلى 3.0 ± 0.1 و GFP G72R ، 1.5 ± 0.1 إلى 3.7 ± 0.2 ميكروغرام · ساعة −1 · مجم بروتين −1).

استقرار GK بواسطة الكبد PFK2 / FDP2 و GKRP.

تعدل البروتينات الرابطة لـ GK PFK2 / FDP2 و GKRP نشاط GK في خلايا البنكرياس والكبد ، على التوالي. لذلك قمنا باختبار ما إذا كانت الطفرات تظهر تنشيطًا أو استقرارًا متغيرًا عندما يتم التعبير عن هذه البروتينات بشكل غير متجانس في خلايا MIN6. أدى التعبير عن PFK2 / FDP2 باستخدام ناقل غدي في خطوط الخلايا النسيلية إلى زيادة نشاط GK في الحيوانات المستنسخة من النوع البري وفي GFP V62M ولكن ليس في GFP G72R أو في الخلايا غير المنقولة (الشكل 8).أ). قد يكون نقص التأثير في الخلايا غير المنقولة نتيجة للتأثير المشبع لـ PFK2 / FDP2 الداخلي على GK الداخلي.

أدى الإفراط في التعبير عن بروتين GKRP للكبد إلى زيادة صغيرة ولكنها مهمة في نشاط GK في GFP GK من النوع البري ولكن ليس في خطوط الخلايا الطافرة أو في MIN6 غير المنقولة (الشكل 8).ب). تم أيضًا اختبار تفاعل المسوخ مع GKRP عن طريق تعداء عابر لبنى GFP في خلايا الكبد. على عكس GFP GK ، الذي تراكم في النواة عند 5 مليمول / لتر من الجلوكوز وانتقل إلى السيتوبلازم عند 25 مليمول / لتر من الجلوكوز ، لم يتراكم GFP V62M ولا GFP G72R في النواة عند 5 مليمول / لتر جلوكوز (الشكل 8)ج).


محتويات

الجلوكوكيناز (GK) في خلايا الكبد فسفوريلات الجلوكوز ، وتحضيره للاندماج في الجليكوجين أو لتحلل الجلوكوز. During periods of ample glucose supply, most GK activity can be found in the peripheral cytoplasm where glycogen synthesis is occurring. [5] As the glucose supply declines during periods of fasting, GK activity in the cytoplasm diminishes. GKRP participates in this modulation of GK activity and location by binding free cytoplasmic GK as glucose levels decline, and moving it into the nucleus, where it is held in reserve in an inactive form. [6] As glucose and insulin levels rise, as during digestion of a meal, GK is released from GKRP and moves back to the cytoplasm, where much of it associates with the bifunctional enzyme. [7]

In hepatocytes of various mammals, GKRP has always been found in molar excess of the amount of GK, but the GKRP:GK ratio varies according to diet, insulin sufficiency, and other factors. Free GKRP shuttles between the nucleus and the cytoplasm. It may be attached to the microfilament cytoskeleton. [8]

GKRP competes with glucose to bind with GK, but inactivates it when bound. In conditions of low glucose, GKRP then pulls the GK into the nucleus. Rising amounts of glucose coming into the hepatocyte prompt the GKRP to rapidly release GK to return to the cytoplasm.

GKRP itself is subject to modulation. Fructose and sorbitol can both be converted to fructose-1-phosphate, which inhibits GKRP and frees GK. [1] Fructose 6-phosphate binds to the same site of GKRP, but enhances the ability of GKRP to bind and inactivate GK. In contrast, phosphorylation of GKRP by AMP-activated protein kinase, induced by elevated levels of AMP, reduces its capacity to inactivate GK. [9]

A presence and role of GKRP in other organs and tissues beyond the liver remains uncertain. Some researchers have finding small amounts of GKRP, or at least RNA coding for it, in small amounts in certain rat lung cells, in pancreatic islet cells, and in periventricular neurons of the hypothalamus in rats, [10] but physiological function and significance in these organs are unknown.

GKRP was originally discovered in rat liver. GKRP was found to serve a similar function in livers of mice and humans as well as other animals. [11] Cats are unusual in lacking GK activity, and have also been found to lack GKRP, though the genes for both GK and GKRP can be identified in the feline genome. [12]

Many mutant forms of human GK are associated with impaired or amplified insulin secretion or action, resulting in higher or lower blood glucose levels, and either diabetes (MODY2) or hyperinsulinemic hypoglycemia, respectively. Some of these variants have altered interaction with GKRP, which may contribute to the hyperglycemia. [13] [14] [15] [16]

The glucokinase of "knockout mice" who lack GKRP has a reduced expression and is entirely found in the cytoplasm. The knockout mice do not respond rapidly to glucose, exhibiting impaired glucose tolerance. [17] Mutations of the GKRP gene (GCKR) in humans have been sought as possible causes of monogenic diabetes (MODY), but no examples have yet been discovered. However, variant forms of GCKR have been found to be associated with small differences in levels of glucose, insulin, triglycerides, C-reactive protein, and higher or lower risks for type 2 diabetes mellitus. [18] [19] [20] [21]

Activators of GK are being investigated as possible medicines for type 2 diabetes. One of the mechanisms of activation may be protection from binding by GKRP. [22]


Molecular mechanism of catalysis: critically dependent on sulfhydryl groups

The sulfhydryl groups of several cysteines surround the glucose binding site. All except cys 230 are essential for the catalytic process, forming multiple disulfide bridges during interaction with the substrates and regulators. At least in the beta cells, the ratio of active to inactive glucokinase molecules is at least partly determined by the balance of oxidation of sulfhydryl groups or reduction of disulfide bridges.

These sulfhydryl groups are quite sensitive to the oxidation status of the cells, making glucokinase one of the components most vulnerable to oxidative stress, especially in the beta cells.


Correlation Between the Presence of GCK and Glucose Response by Cells Contributing to Glucose Homeostasis

Many different, functionally specialized glucose sensing cell types have evolved to assure blood glucose is maintained within a narrow, physiologically safe range of 4𠄸 mM. These cells complement each other in providing continuous measure and adjustment of the concentration of glucose in blood. We hypothesize that GCK is the primary glucose sensor utilized for maintaining glucose homeostasis, i.e., GCK is responsible for sensing blood glucose not only by β-cells but also by other cells involved in regulating blood glucose. In the case of α-cells, a recent and striking advance was made by specifically deleting GCK from the α-cells in mice, the deletion resulting in substantial loss of glucose induced suppression of glucagon release (Basco etਊl., 2018). The resulting hyperglucagonemia causes overactive glucagonogenesis, consistent with metabolism of glucose by GCK having a central role in α-cell function in glucose homeostasis. The authors conclude that glucose sensing is by GCK and that downstream signaling in α-cells is similar to that of β-cells: increased glucose increases the [ATP]/[ADP] ratio leading to closure of ATP-regulated K + channel and membrane depolarization. In α-cells, however, depolarization leads to voltage-dependent inactivation of voltage-gated Na + channels involved in action potential firing. Diminution of action potential height decreases activation of the P/Q Ca 2+ channels that mediate Ca 2+ entry, and this decreases glucagon release. Note that Le Marchand and Piston (2012), have provided evidence that glucose induced suppression of glucagon secretion does not involve decreased intracellular [Ca 2+ ].

Pancreatic δ-cells respond to increased glucose by releasing somatostatin which acts locally as a paracrine inhibitor of insulin and glucagon release rather than a systemic hormone (Boden etਊl., 1981, Gylfe, 2016 Rorsman and Huising, 2018). Glucose sensing by δ-cells most likely involves GCK for sensing as indicated by substantial expression of the gene as measured by single cell RNA-seq. It should be noted that pancreatic α-, β-, and δ-cells have a common progenitor cell (Sosa-Pineda etਊl., 1997 Gradwohl etਊl., 2000 Chung and Levine, 2010) which could help explain the obvious similarities in their glucose sensing pathways. δ-cells also respond directly to a physiological amino acid mixture independently of glucose, perhaps the consequence of membrane depolarization caused by sodium co-transport being sufficient to reach the threshold for secretory response (Boden etਊl., 1981 Rorsman and Huising, 2018).

Similar GCK-dependent sensing paths have been proposed for glucose excited (GE) and glucose inhibited (GI) neurons of the CNS. Dunn-Meynell etਊl. (2002) reported that GCK mRNA is expressed in norepinephrine neurons of locus ceruleus, and in hypothalamic neuropeptide Y, pro-opiomelanocortin, and γ-aminobutyric acid neurons. Moreover, in GE neurons intracellular Ca 2+ oscillations were inhibited and in GI neurons Ca 2+ oscillations were stimulated by four selective GCK inhibitors. Lamy etਊl. (2014) studied GLUT2-expressing excitatory neurons (GE) in the nucleus of tractus solitarius of the vagus nerve. These neurons form a distinct population of hypoglycemia-activated neurons. The authors concluded that glucose is sensed through GCK because hypoglycemia decreases energy state and increases [AMP]. Increased [AMP] then activates AMP-dependent protein kinase and this suppresses a K + leak current, hyperpolarizes the cells, and increases afferent electrical activity. Similar results have been presented for GI neurons of the hypothalamic arcuate nucleus (Burdakov etਊl., 2005 Routh, 2010 Hussain etਊl., 2015). There are a large number of different types of neurons for which glucose sensitivity has been reported (Levin etਊl., 2004 Jordan etਊl., 2010 Thorens, 2012 Lamy etਊl., 2014 Steinbusch etਊl., 2015, 2016) and in most of these neurons glucose sensing appears to be through GCK, although orexin neurons of the hippocampus are apparently an exception (see section on alternate glucose sensors).

GCK has also been implicated in glucose sensing in the anterior pituitary gland of rat and monkey (Zelent etਊl., 2006 Sorenson etਊl., 2007). GCK activity was measured spectrophotometrically in whole pituitary extracts and identified as a generalized cytoplasmic staining co-localized in cells with follicle-stimulating hormone (FSH) or luteinizing hormone (LH). In addition to gonadotropes, GCK was observed in a minor subpopulation of corticotropes and thyrotropes (Sorenson etਊl., 2007). It is puzzling, however, that in gonadotropes of the cynomolgus monkey GCK appeared to be clearly confined to cytosolic substructures, tentatively identified as Golgi complex (Sorenson etਊl., 2007). Pulsatile stimulation of the gonadotropes FSH and LH is mediated by GNRH released from GNRH neurons of the preoptic nucleus, which in turn are regulated by hypothalamic Kisspeptin neurons. GNRH receptor activation results in phospholipase C activation, IP3 mediated ER-calcium release causing secretion of the hormones (Stojilkovic etਊl., 2005). It remains to be tested whether, and if so how, glucose might influence these cells as they control puberty and/or reproduction. Nutrient supply profoundly influences reproductive biology, and GCK-dependent glucose regulation at the level of the pituitary might play a hitherto not considered role. Note that in the case of gonadotropes, glucose sensing might influence the release of FSH and/or LH which would impact glucose homeostasis directly عبر sex steroids or indirectly through increased nutrient consumption due to the pubertal growth spurt or pregnancy.

A case can also be made that GCK is the glucose sensor for cells in the adrenal gland which secrete epinephrine and corticosteroids to counteract hypoglycemia. Three lines of evidence support this contention. A rather mild form of hypoglycemia, observed clinically, later found to be caused by an activating mutation of GCK (M197 T?), was initially diagnosed as adrenal insufficiency. The patient was treated for 12 years with a maintenance dose of 10 mg cortisol to ameliorate hypoglycemia symptomatology (Morishita etਊl., 2017). After reevaluation of the original diagnosis, steroid treatment was discontinued because hypertension had developed and adrenal insufficiency was discounted. It is noteworthy that this particular GCK mutation increases activity of the enzyme only moderately as indicated by a thorough kinetic analysis (Sayed etਊl., 2009). It is therefore not unreasonable to hypothesize the clinical presentation resulted from complex additive effects of GCK activation that involved altered glucose sensing by both pancreatic α- and β-cells as well as cells of the adrenal gland. This interpretation is strengthened by a recent demonstration of GCK mRNA in mouse adrenal glands (see Supplement figure in Steinbusch etਊl., 2016) and immunohistochemical data indicating GCK is present in cells of the human adrenal gland (online Human Atlas showing histochemical staining of GCK).

These examples illustrate that each cell type having a role related to blood glucose levels expresses GCK and there is evidence that glucose is sensed through the activity of GCK. Our hypothesis predicts that all utilize similar metabolism to couple GCK activity to energy state and their metabolic response to changes in glucose concentration closely approximate those in pancreatic α- and β-cells and in glucose sensing neurons. The mechanism and metabolism related to glucose sensing is similar for all of the cells, while differences in coupling of energy state to membrane permeability, specific hormone and/or neurotransmitter released determining outcome and role in glucose/energy metabolism regulation. Examples of how similar changes in energy state elicit different cell specific responses have been presented for β-cells, α-cells, and glucose sensing neurons.

It is also important that GCK is absent or very low in cells and tissues that do not serve as glucose sensors as defined. These cells express hexokinase instead of GCK and the higher affinity for glucose (0.05𠄰.2 vs 1.5� mM, (Cárdenas, 2004)) results in cellular metabolism being insensitive to changes in glucose concentration in the physiological ranges found in different species. Zelent etਊl. (2006), for example, measured expression of GCKmRNA in islets of Langerhans (pancreas), pituitary, adrenal gland, whole brain, acinar pancreas, liver, skeletal muscle, adipose tissue, lung, kidney, and spleen. Of these, GCK mRNA was expressed in substantial amounts in the islets of Langerhans, pituitary, and liver with only trace amounts in the other tissues. Even more telling is that in brain, GCK mRNA is expressed in only a very small fraction of neurons and then only in neurons that respond to changes in physiological glucose concentrations (see Hussain etਊl., 2015 De Backer etਊl., 2016).


مقدمة

Glucokinase (GK) * activity is a major determinant of β cell glucose metabolism and insulin secretion (Sweet et al., 1996 Matschinsky et al., 1998 Matschinsky, 2002). Thus, a complete model of its regulation is central to our understanding of glucose homeostasis and the pathogenesis of diabetic disease states. To maintain physiological glucose responsiveness, GK activity needs to be constrained within a very narrow range (Wang and Iynedjian, 1997 Matschinsky et al., 1998). Regulation of GK expression in β cells has been widely studied and is induced mainly by glucose, although it can be modulated by other factors, including insulin (Leibiger et al., 2001 Matschinsky, 2002). Posttranslational regulation of GK has only more recently been described, and the mechanisms involved in this mode of regulation are not well known. Recent studies have shown that low levels of glucose cause an association of GK with secretory granules (Toyoda et al., 1999 Stubbs et al., 2000 Rizzo et al., 2002) and that this association correlates with a decrease in GK activity (Rizzo et al., 2002). Prolonged exposure to high glucose (>20 min) causes dissociation of GK from the granule along with conformational changes associated with activation. Glucose-stimulated GK regulation is blocked by inhibitors of insulin secretion, and insulin by itself can rapidly (<2 min) induce similar changes to GK localization and activity (Rizzo et al., 2002). This suggests that minute-to-minute regulation of GK activity and localization occurs through receptor-mediated signaling and not by interaction between glucose and GK.

The molecular mechanism of GK association with secretory granules and the processes that modulate this association are unknown. To address the mechanism of GK association with secretory granules, we examined the role of nitric oxide synthase in this regulation. Neuronal nitric oxide synthase (nNOS) is activated by a rise in intracellular calcium, which is a known response of β cells to glucose or insulin stimulation (Aspinwall et al., 2000) and nNOS is also known to be localized on insulin secretory granules (Lajoix et al., 2001). Nitric oxide (NO) has also been shown to have a stimulatory affect on glucose-stimulated insulin secretion from both cultured β cell lines and pancreatic islets (Smukler et al., 2002 Kaneko et al., 2003). However, these findings are highly controversial, and an inhibitory effect on insulin secretion has also been shown using a variety of experimental approaches. (Salehi et al., 1996 Lajoix et al., 2001 Henningsson et al., 2002). This controversy points to the need for more careful consideration of potential targets for NO in the regulation of glucose-stimulated insulin secretion in order to understand the role of NO synthase (NOS) in β cell function. GK is one potential target for regulation by NO, since GK contains several cysteines that have been shown to be critical for maintaining catalytic activity (Tiedge et al., 2000).


Loss of function mutations cause diabetes

Over 190 of these mutations reduce the functional efficiency of the glucokinase molecule. Heterozygosity for alleles with reduced enzyme activity results in a higher threshold for insulin release and persistent, mild hyperglycemia. This condition is referred to as maturity onset diabetes of the young, type 2 (MODY2).

Homozygosity for GCK alleles with reduced function can cause severe congenital insulin deficiency resulting in persistent neonatal diabetes.

Gain of function mutations cause hyperinsulinemic hypoglycemia

As of 2004, 5 mutations have been found to enhance insulin secretion. Heterozygosity for gain of function mutations reduces the threshold glucose that triggers insulin release. This creates hypoglycemia of varying patterns, including transient or persistent congenital hyperinsulinism, or fasting or reactive hypoglycemia appearing at an older age.


شاهد الفيديو: Fatty acid synthesis Part 1 شرح بالعربي (ديسمبر 2022).