معلومة

تخليق الببتيد غير الريبوسومي: لماذا لا يستطيع الريبوسوم إنتاج الجلوتاثيون؟

تخليق الببتيد غير الريبوسومي: لماذا لا يستطيع الريبوسوم إنتاج الجلوتاثيون؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

قضية: أكتب ملخصًا لفصل في بنية البروتين ووظيفته ، وقد طُلب مني وصف بعض الطرق المختلفة التي يتم بها تصنيع الببتيدات (التي لا تتضمن الريبوسوم). أفهم أن الجلوتاثيون عبارة عن ثلاثي الببتيد يتكون من L-cystine مع رابطة "جاما" مع L-glycine والذي يرتبط بعد ذلك بحمض الجلوتاميك.

مشكلة: لماذا لا يستطيع الريبوسوم إنتاج هذا الببتيد؟ ما الذي يميز رابطة الببتيد-جاما؟

تفكيري: الببتيد قصير جدًا ، مما يعني أن مركب الريبوسوم الكبير لا يمكنه الارتباط بـ mRNA بهذا الطول لأنه يحتاج إلى العديد من نقاط الربط المختلفة حتى تتجمع الوحدة الفرعية الكبيرة والصغيرة معًا. أيضًا ، رابطة "جاما" خاصة جدًا ، ولا يستطيع الريبوسوم إنتاج الببتيدات إلا باستخدام روابط الببتيد "القياسية".

  • هل هذا صحيح ، وهل هناك شيء آخر مفقود؟

  • هل ترتبط رابطة "جاما" بحقيقة أن الجلوتاثيون لا يتحلل بسهولة عن طريق الببتيدات في العصارة الخلوية؟


إنه بالتأكيد ليس الطول. على الرغم من أن الريبوسومات لا تستطيع صنع ببتيدات صغيرة حقًا لأنها تحتاج إلى شيء يتمسك به ، وعلى أي حال تبدأ البروتينات بالميثيونين (عادةً) ، إلا أن هناك حلولاً بديلة. لا يوجد سبب يمنع الجين من ترميز ثلاثي الببتيد مباشرة.

الطريقة "التقليدية" لإنتاج ببتيدات قصيرة جدًا هي إنتاج بروتين أطول وتقطيع جزء منه ، وهو ما يعمل بشكل رائع مع ببتيدات الإشارة وعدد من الأنظمة الأخرى. تصنع إنزيمات مثل هذه الببتيدات الصغيرة جدًا بكفاءة أكبر ، لكن من حيث المبدأ لا يوجد سبب إلى جانب الكفاءة والتعقيد. (أنت بحاجة إلى بروتياز خاص لكل ببتيد صغير وما إلى ذلك وما إلى ذلك)

ومع ذلك ، فإن رابطة جاما هذه هي وحش مختلف تمامًا ، ولا يمكن لأي ريبوسوم إنتاجها على الإطلاق ، حتى في منتصف بروتين أطول. الأحماض الأمينية "تندمج" معًا بطريقة محددة جدًا. ترتبط المجموعة الأمينية بمجموعة الكربوكسيل للحمض الأميني السابق ، مما يجعل السلسلة. المجموعات الجانبية للحمض الأميني غير متضمنة. مثل Legos التي تلتصق ببعضها البعض بطريقة واحدة فقط ويمكن أن تكون بأي لون أو بها أي تصميمات على الجانب. الفرق هنا هو أن الغلوتامات تحتوي على مجموعة كربوكسيل كجزء من سلسلتها الجانبية. إنها مثل لعبة Lego ذات الثقوب على الجانبين. يقوم NRPS هنا بتوصيل السيستين بالسلسلة الجانبية للجلوتامات بدلاً من "القاع" حيث ستذهب إذا كانت رابطة الغلوتامات-السيستين المُصنَّعة من الريبوسوم.

تشرح رابطة جاما هذه أيضًا زيادة طول عمر المنتج. البروتياز ليس مصممًا للأشياء التي تبدو مثل هذا. لا تتناسب رابطة جاما مع المواقع النشطة للبروتياز وبالتالي يكون النشاط أبطأ.


من قرأت عن الجلوتاثيون ، أعتقد أن الإجابة على سؤالك هي:

"لأنه لا يوجد جلوتاثيون الجين "، وبالتالي ، لا الجلوتاثيون مرنا.

فيما يتعلق برابطة جاما ، يقتبس مقال ويكيبيديا هذا:

يعتبر اقتران الببتيد هذا فريدًا من نوعه من حيث أنه يحدث بين الجزء الأميني للسيستين والحمض الكربوكسيل الطرفي للسلسلة الجانبية للجلوتامات (ومن هنا جاء اسم جاما جلوتاميل سيستين)

نقلا عن هذه الورقة كمرجع.

أيضًا ، يبدو أن ارتباط جاما هو بالفعل السبب في عدم تدهوره في العصارة الخلوية.

لا أعرف كيف ترى ويكيبيديا ، لكن بالنسبة لي ، النسخة الإنجليزية هي طريقة جيدة لجمع معلومات عامة حول موضوع غير معروف ، قبل الخوض في التفاصيل بشكل أعمق مع المخلفات العلمية.


جينومات التعدين لإلقاء الضوء على كيمياء الحياة المتخصصة

تنتج جميع الكائنات الحية جزيئات عضوية متخصصة ، بدءًا من المواد الكيميائية المتطايرة الصغيرة إلى الببتيدات الكبيرة المشفرة بالجينات ، والتي تطورت لتزويدها بوظائف خلوية وبيئية متنوعة. كمنتجات طبيعية ، يتم تطبيقها على نطاق واسع في الطب والزراعة والتغذية. أظهر التراكم السريع للمعلومات الجينومية أن القدرة الاستقلابية لجميع الكائنات الحية تقريبًا لا تحظى بالتقدير إلى حد كبير. تعمل تقنيات استخراج الجينوم ، التي تعتبر رائدة في البكتيريا والفطريات ، على تسريع اكتشاف المستقلبات. يتم الآن توسيع الجهود الأخيرة لتشمل جميع أشكال الحياة ، بما في ذلك الطلائعيات والنباتات والحيوانات ، وتمكن تقنيات omics التكاملية الجديدة من التعدين الفعال بشكل متزايد لهذا التنوع الجزيئي.


الملخص

يتم تقديم نهج ديناميكي حراري للتشكيل الكبير الببتيد مستوحى من حلور ألدهيدات الببتيد غير الريبوسومي. توفر الطريقة الوصول إلى الدورات الكبيرة المتنوعة هيكليًا من خلال استغلال تفاعل إيمينات الببتيد الحلقية العابرة تجاه محبي النواة داخل الجزيئات وداخلها. يتم إجراء التفاعلات في الوسط المائي ، في غياب مجموعات حماية السلسلة الجانبية ، وتكون متسامحة مع جميع المجموعات الوظيفية المكونة للبروتين. يتم تحضير منتجات Macrocyclic التي تحمل أشكالًا هيكلية غير أصلية وصلبة ، وعلامات نظيرية ، ومجموعة متنوعة من المقابض المتعامدة بيولوجيًا ، جنبًا إلى جنب مع نظائرها لأربعة منتجات طبيعية متميزة. الاستجواب الهيكلي للببتيدات الخطية والحلقة الكبيرة باستخدام NMR ذات درجة الحرارة المتغيرة وازدواج اللون الدائري يشير إلى أن التنظيم المسبق للركائز الخطية ليس شرطًا أساسيًا لعملية التدوير الكبير.


الملخص

لا تزال العديد من الخطوات في تطور الحياة الخلوية غامضة. نقترح أن الريبوسوم قد يمثل رابطًا مفقودًا مهمًا بين النهج التركيبي (أو الأيض أولاً) ، وعالم الحمض النووي الريبي (أو الجينات أولاً) والخلوي (آخر سلف مشترك عالمي) لتطور الخلايا. نقدم دليلًا على أن المجموعة الكاملة من نقل الحمض النووي الريبي لجميع الأحماض الأمينية العشرين مشفرة في كل من الرنا الريباسي 16S و 23S من الإشريكية القولونية K12 أن تسلسل النوكليوتيدات الذي يمكن أن يشفر الأجزاء الرئيسية من البروتينات الريبوزومية ، والبوليميراز ، والليغازات ، والتركيبات ، والفوسفاتازات يمكن العثور عليها في كل من إطارات القراءة الستة المحتملة لـ 16S و 23S rRNAs وأن كل تسلسل من القواعد في الرنا الريباسي يحتوي على ترميز معلومات أكثر من وظيفة من هذه الوظائف بالإضافة إلى العمل كمكون هيكلي للريبوسوم. باختصار ، RNA الريبوزومي ليس مجرد سقالة هيكلية للبروتينات ، ولكنه بقايا أثرية من الجينوم البدائي الذي ربما يكون قد قام بتشفير وسيط ذاتي التنظيم والتكاثر الذاتي والتحفيز التلقائي بين الجزيئات الكبيرة والحياة الخلوية.


الملخص

إن تركيبات الببتيد غير الصبغي (NRPSs) هي آلات جزيئية لا تصدق تنتج مجموعة واسعة من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيًا وعلاجيًا. أثناء التخليق ، يتم إجراء استطالة الببتيد بواسطة مجال التكثيف (C) ، حيث يحفز تكوين رابطة الأميد بين الببتيد الناشئ والحمض الأميني الذي يضيفه إلى السلسلة. منذ اكتشافها قبل أكثر من عقدين من الزمن ، خضعت نطاقات C لتحليلات كيميائية حيوية ومعلوماتية حيوية وتحليلات هيكلية ومطفرة. وهي تتألف من فصين ، كل منهما له تماثل مع الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز ، ولهما موقعان للربط لاثنين من الروابط المرتبطة بالبروتين الحامل للببتيد ، ولهما موقع نشط به شكل محفوظ HHxxxDG يقع بين فصين. تناقش هذه المراجعة بعض الأفكار المهمة في البنية ، والآلية التحفيزية ، والخصوصية ، ووظائف الحفاظ على البوابة لنطاقات C التي تم الكشف عنها منذ اكتشافها. بالإضافة إلى ذلك ، نطاقات C هي الأعضاء النموذجيين لعائلة المجال C الفائقة ، والتي تتضمن العديد من الأعضاء الآخرين الذين يعملون أيضًا كنطاقات NRPS. يمكن لأفراد الأسرة الآخرين استبدال المجال C في تركيب NRP ، أو العمل بالتنسيق مع مجال C ، أو يمكنهم أداء وظائف متنوعة وجديدة. تشمل هذه المجالات مجال epimerization (E) ، ومجال heterocyclization (Cy) ، ومجال C المكون لرابطة استر ، ومجال NRPS الطرفي C الفطري (C).تي) ، والحلقة β-lactam التي تشكل المجال C ، والمجال X. نناقش أيضًا البصيرة الهيكلية والوظيفية في C و E و Cy و Cتي و X ، لتقديم نظرة عامة شاملة عن المعرفة التاريخية والحالية للمجال C الفائق. هذا المقال جزء من عدد خاص بعنوان: الفيزياء الحيوية في كندا ، حرره لويس كاي ، وجون بانزيغر ، وألبرت بيرغويز ، وبيتر تيلمان.


4 وحدات فرعية ، وحدة ، ونطاق NRPS

4.1 تبادل الوحدات الفرعية NRPS

الشكل 15 (أ) رسم تخطيطي لجينات NRPS المسؤولة عن التخليق الحيوي للببتيدات الدهنية ذات الصلة daptomycin و A54145 و CDA. (ب) إستراتيجية تبادل الوحدات الفرعية حيث تم حذف الوحدة الفرعية DptD لأول مرة ثم تكملتها عبر التحويل باستخدام إما DptD أو ما يعادلها من التخليق الحيوي A54145 أو CDA لإنتاج نظيرتين جديدتين من daptomycin (60) و (61). 48 R = حمض ديكانويك.

دابتومايسين هو ببتيد دهني دوري مكون من 13 حمض أميني وهو نتاج ثلاث وحدات فرعية من NRPS الاصطناعية ، DptA ، DptBC و DptD. في أول سلسلة من الدراسات ، حيث تمت هندسة مسار التخليق الحيوي بنجاح لإنتاج مشتقات جديدة من دابتومايسين ، تم حذف dptD. يشفر الجين dptD لوحدة فرعية NRPS مسؤولة عن دمج الأحماض الأمينية الأخيرة ، 3-methylglutamate (3mGlu) و kynurenine (Kyn) ، في الطرف C (في الموضع 12 و 13 على التوالي) بالإضافة إلى دمج مجال TE لـ تحلل الببتيد وإطلاقه (الشكل 15). بعد هذه الضربة القاضية ، وتأكيد إلغاء إنتاج الدابتومايسين ، تم إثبات التكامل الناجح في الترانس باستخدام محفز تأسيسي قوي لدفع التعبير ليس فقط عن dptD من النوع البري ولكن أيضًا الجينات غير المتجانسة cdaPS3 و lptD من CDA و A54145 التخليق الحيوي على التوالي. كل من هذين الجينين غير المتجانسين مسؤولان أيضًا عن تثبيت آخر نوعين من الأحماض الأمينية في مسار NRPS الخاص بهما. يدمج CdaPS3 Glu (أو 3mGlu) و Trp في نهاية التخليق الحيوي CDA ، بينما يقوم LptD بتثبيت Glu (أو 3mGlu) وإما Ile أو Val لإنهاء التخليق الحيوي A54145 (الشكل 15). كانت إحدى المزايا في اختيار هاتين الوحدتين الفرعيتين للتبادل غير المتغاير أنهما يشتملان على مجال أولي محدد لـ Glu / 3mGlu ، على غرار DptD. يبدو أن هذا التشابه كافٍ للحفاظ على تفاعل المجال C المعدل مع PCP المنبع وساعد في دمج الحمض الأميني غير الأصلي اللاحق (إما Trp أو Ile أو Val) في الطرف C. ميزة أخرى لاختيار هذه الوحدة الفرعية النهائية هي أن تضمين مجال TE يعني أنه لا توجد تفاعلات لاحقة يمكن أن تتأثر سلبًا. على الرغم من أن كلا التبادلين الوحيدين غير المتجانسين أنتجا نظائر دابتومايسين معدلة ، فقد جاءت هذه التغييرات على حساب انخفاض في المحصول في نطاق 25-50٪ من مستويات النوع البري (الشكل 15). 48

في دراسة متابعة ، تم إجراء تعديلات وراثية إضافية في سلالة ΔdptD للمساعدة في تحسين الغلات. تم أيضًا حذف الوحدة الأولى من التخليق الحيوي للدابتومايسين ، dptA. هذه الوحدة مسؤولة عن بدء عملية التخليق الحيوي عن طريق اقتران سلائف حمض الديكانويك مع التربتوفان N-terminal. كان من المتصور أن استكمال هذا الجين في الترانس تحت سيطرة مروج ermE التأسيسي القوي * سيؤدي إلى الإفراط في التعبير عن وحدة البدء وبالتالي التأثير بشكل إيجابي على الغلات. باستخدام هذه الطريقة ، تم تعزيز إنتاج مشتقات الدابتومايسين إلى حوالي 40-69٪ من مستويات النوع البري عند استكمالها بالجينات المتماثلة dptD من التخليق الحيوي لـ CDA أو A54145. 49 ومن المثير للاهتمام أنه بينما تم التعبير عن جميع جينات الدابتومايسين الحيوية في نسخة واحدة ، لم تكن الترجمة المتسلسلة مطلوبة لإنتاج قوي ، مما يعني أن الحذف والتكامل العابر للوحدات الفرعية NRPS كان ممكنًا.

4.2 تبادلات الوحدة والمجال

الشكل 16 (أ) هيكل دابتومايسين ونظائرها المنتجة من خلال تبادل وحدة NRPS. (ب) تنظيم NRPS لمجموعة دابتوميسين وتخطيطي يظهر إستراتيجية تبادل الوحدة. تم تبديل الوحدتين 8 و 11 لبعضهما البعض أو للوحدة Asn8 من التخليق الحيوي A54145 (انظر الشكل 15 أ). ثم تم التعبير عن هذه الكيميرات NRPS جنبًا إلى جنب مع الوحدة الفرعية DptD من النوع البري أو الوحدات الفرعية LptD / cdaPS3 المماثلة من التخليق الحيوي A54145 / CDA. (C) تضمن مبادلة الوحدة الإضافية مبادلة أربع وحدات فرعية كاملة من DptBC للوحدات الفرعية ذات الصلة من التخليق الحيوي A54145. تظهر وحدات دابتوميسين باللون الأسود ، ووحدات A54145 باللون الأحمر ووحدات CDA باللون الأزرق. 50 المجالات الناشئة من وحدة DptBC 8 مظللة باللون الرمادي الصلب ، والنطاقات التي تنشأ من وحدة DptBC 11 مظللة.

بعد هذا الدليل على المفهوم ، تم استخدام الجينات من مجموعة التخليق الحيوي المماثلة A54145 (وحدة ترميز D -Asn 11) لتحل محل أي من D -Ser8 او د -علا11 المواقف مع D -Asn (الشكل 16 ب). أثبت هذا أيضًا نجاحه وتم عزل نظيرتين جديدتين (D -Asn11 (69) و D -Asn8 (70)) ، ومع ذلك تم تخفيض مستويات الإنتاج بشكل أكبر بالنسبة إلى النوع البري (D -Asn11 (69) نظير يُظهر إنتاجًا أعلى قليلاً من D-Asn8 (70)). أدى استبدال المجال E الأصلي بمجال E غير المتجانس من A54145 أيضًا إلى تكوين نظائر جديدة ، مما يدل على أن استبدال الوحدة الكلية (C – A – T – E) ممكن ، لكن هذا التغيير تسبب في انخفاض كبير في إنتاجية المنتج مقابل يُظهر المجال E الأصلي أن الحفاظ على مناطق رابط الوحدة النمطية الأصلية أمر مهم للنشاط. أظهر 50 نشاط فحوصات أن D-Asn8 نظير دابتوميسين (70) كان أقل نشاطًا من دابتومايسين ، ولكن D-Asn11 التناظرية (69) قوة الاحتفاظ.

تم إجراء تغييرات أكثر تطرفًا أيضًا على البنية الأساسية للدابتوميسين من خلال تبادل أربع وحدات داخل DptBC (D -Ala8-اس9-Gly10- د - سير11) مع أربع وحدات من LptC (D -Lys8-OmAsp9-جلو10- د - أسن11) من مجموعة A54145 (الشكل 16C). على الرغم من ظهور إنتاج المنتج المتوقع من هذه الوحدة النمطية (ناقص O- ميثيل Asp9 بسبب عدم وجود إنزيمات الخياطة الضرورية في كتلة دابتومايسين) (76) ، انخفض المحصول بشكل كبير ، حيث كان الإنتاج أقل من 0.5 ٪ من مستويات التحكم.

أدى الإنتاج الناجح للمركبات مع التغييرات في الموضعين 8 و 11 إلى الجمع بينهما مع التغييرات الناجحة سابقًا للأحماض الأمينية النهائية في الموضعين 12 و 13 من خلال تبادل dptD لـ lptD (62–66) أو cdaPS3 (71–75) (بالإضافة إلى التعديلات الأخرى التي تم إجراؤها على الذيل الدهني) مما أدى إلى إنتاج مركبات هجينة متعددة من دابتومايسين (الشكل 16 ب) مع مستويات إنتاج تتراوح بين 0.5-45٪ تقريبًا من مستويات التحكم ، ويلاحظ وجود اتجاه عام أنه كلما زاد عدد التغييرات المفروضة كلما انخفضت مستويات الإنتاج. تم تقييم كل مركب من حيث النشاط المضاد للبكتيريا وعلى الرغم من أنه لم يكن ، بشكل عام ، أقوى من دابتومايسين (باستثناء واحد ضد طفرة E. coli imp) ، فإن الإنتاج الناجح لمركبات جديدة بطريقة اندماجية يشير إلى أن هذا نوع من النهج ممكن.

في متابعة للدراسة ، تم اختيار dptD مرة أخرى ليكون موضوعًا للتعديل. المجالات C – A أو C – A – T للوحدة 13 (تتضمن Kyn13 في daptomycin) لمجالات مختلفة من cdaPS3 (يتضمن Trp11 في CDA) أو lptD (يدمج Ile13 في A54145) (الشكل 15 أ). على الرغم من عدم ملاحظة أي إنتاج في مقايضات المجال C – A – T ، إلا أن التبادل في المجالات C – A فقط أدى وحده إلى إنتاج Trp المتوقع13 و IIe13 نظائر الدابتومايسين عند مستويات تقارب 20٪ من السيطرة. لسوء الحظ ، تم العثور على المركبات الجديدة المنتجة لتكون أقل فعالية من دابتومين عندما تم تقييمها في المقايسات المضادة للبكتيريا. 51 حقيقة أن Cubist فشل في تحديد أي متغيرات دابتومايسين ذات نشاط مضاد للميكروبات محسّن ، على الرغم من الجهد الصناعي الكبير ، ربما لا يكون مفاجئًا. هناك علاقة تطورية وثيقة للغاية بين وحدات daptomycin و CDA و amp A54145 NRPS والمجالات التي تم تبادلها. على الأرجح أن الطبيعة قد أخذت عينات بالفعل من هذه التوليفات واختيرت ضد المركبات التي أنشأها التكعيبي ، لصالح دابتومايسين الذي يظل المضاد الحيوي الأكثر نشاطًا في هذه العائلة الكبيرة من المتغيرات الدهنية الطبيعية والمصممة هندسيًا.

تم توضيح نهج مبادلة المجال أكثر دقة قليلاً مع الإنتاج في الجسم الحي لمشتقات pyoverdine الجديدة بواسطة Pseudomonas aeruginosa PAO1 من خلال بدائل المجال الأصغر حيث اقتصرت التعديلات على المجال A وحده (A) أو جنبًا إلى جنب مع المجال C (C – A) . 52 على غرار dptD ، يشفر pvdD وحدة فرعية NRPS مسؤولة عن دمج المتبقيين النهائيين ، وهما ثريونين في الموضعين 10 و 11 من البيوفيردين (الشكل 17 أ ، ب). فشلت محاولة سابقة حيث كانت التغييرات تهدف إلى تغيير الأحماض الأمينية قبل الأخيرة في البيوفيردين ، ربما بسبب الاضطرابات في التفاعلات بين الوحدات في النظام. 15 في محاولة لتقليل هذه الاضطرابات فقط الحمض الأميني النهائي في pyoverdine (Thr11) بأحماض أمينية بديلة. بطريقة مماثلة لتجارب daptomyin السابقة ، تم حذف المجال A الأصلي (أو كلا المجالين A و C) للوحدة 11 من pvdD أولاً ثم التعبير عنه في trans لضمان إمكانية التكامل الناجح قبل المجال A المتنوع (أو C- المجالات) تم تقديم بدائل. تضمنت مجالات الاستبدال التي تم اختبارها المجالات المتجانسة التي تم الحصول عليها من مكان آخر في نفس مجموعة التخليق الحيوي (الشكل 17 ب) ، أو الجينات غير المتجانسة التي تم الحصول عليها من مجموعات البيوفيردين التخليقية الحيوية الموجودة في الأنواع الزائفة الأخرى (الشكل 17 ج). في المجموع ، تم استكمال تسعة بنيات لكل من بدائل المجال A و C-A في سلالة ΔpvdD ثلاثة تحديد Thr ، ثلاثة تحديد Serial (واحد منها قبل Thr من الوحدة المجاورة على الفور المنبع) ، واحد Lys- تحديد ، واحد Asp- تحديد والآخر Gly- تحديد. تم تقييم كل منها من أجل إنتاج البيوفيردينات ، وتم اكتشافها إما عن طريق مراقبة التغيرات في الأشعة فوق البنفسجية أو طريقة التألق الأكثر حساسية.

الشكل 17 (أ) هيكل البيوفيردين. يتم عرض الأحماض الأمينية المختارة للاستبدال في المربع. (ب) استراتيجية استبدال الوحدة النمطية لاستبدال Thr11 (موضح بالصندوق الأسود). تم استبدال الوحدة 11 بثلاث وحدات من داخل مجموعة Pyoverdine. يتم تمييز الوحدات البديلة (إما C – A أو A فقط) بخطوط منقطة. الوحدات التي تم استكمالها بنجاح موضحة باللون الأخضر ، ولم تنجح باللون الأحمر. (ج) وحدات من مجموعات Pseudomonas المتماثلة التي تم استخدامها لتحل محل PvdD11 يتم تمييزها داخل مجموعاتهم الأصلية. الوحدات التي تم استكمالها بنجاح موضحة باللون الأخضر ، ولم تنجح باللون الأحمر. يتم عرض مستويات الإنتاج النسبية للكيميرا الناجحة. 52 hfOrn = L - N 5-formyl- N 5-hydroxyornithine.

حيث الموطن Thr11 تم استبدال المجال بثلاثة مجالات غير أصلية Thr-Specification A يمكن اكتشاف إنتاج pyoverdine عن طريق الامتصاص في كل حالة ، مع اثنين من مستويات الإنتاج الأصلية والثالث ينتج 29٪ من مستوى التحكم. تم العثور على جميع البدائل الأخرى غير المحددة للمجال A ، لإنتاج مستويات منخفضة جدًا من مركب شبيه بالبيوفيردين لا يمكن اكتشافه إلا باستخدام اكتشاف التألق الأكثر حساسية. أظهر التحليل الطيفي الكتلي أن كل هذه النظائر لا تزال تحتوي على Thr11، مما يشير إلى أن هذه البدائل غير المتجانسة للمجال A قد فشلت في العمل كما هو متوقع في سياقها الجديد.

تم الحصول على نتائج مختلفة مع استبدال نطاقات C-A ، مع بدائل واحدة فقط من البدائل المتجانسة التي تحدد Thr (من مجموعة الجينات التخليقية الحيوية P. يبدو أن هذه النتيجة التي تم أخذها بمعزل عن بعضها البعض تشير إلى أن استبدال المجال C-A المشترك كان نهجًا أقل ملاءمة من استبدال المجال A الأبسط ، ومع ذلك ، على عكس استبدال المجال A المعزول ، تم الحصول بنجاح على اثنين من مشتقات pyoverdine الجديدة مع بدائل غير طبيعية في الموضع 11 عند استبداله ببدائل غير ثريونين C – A. واحدة من هذه تحتوي على Lys11، تم الحصول عليه عند 76٪ من مستوى التحكم وتم إنتاجه بعد تبادل المجال مع مجال C-A مأخوذ من pvdJ من نفس المسار في P. aeruginosa PAO1. والثاني يحتوي على Ser11، تم الحصول عليه عند 18٪ من مستوى التحكم وتم إنتاجه بعد الاستبدال بنطاق C – A من P. syringae pv. phaseolicola 1448A (والذي في سياقه الأصلي يقبل Thr من وحدة المنبع المجاورة). تم الإبلاغ أيضًا أنه في غالبية بدائل المجال C-A تم اكتشاف منتج مبتور متعلق بالبيروفيردين ، مما يشير إلى توقف التخليق الحيوي نتيجة للتعديلات. تسلط هذه الدراسة الضوء على أن نهجًا واحدًا لهندسة خصوصية NRPS لا ينطبق دائمًا وأن بدائل المجال لا تعمل دائمًا بطريقة يمكن التنبؤ بها. كما يسلط الضوء على أن مجالات التكثيف (C) قد تؤدي دورًا أكثر تعقيدًا من مجرد تكوين رابطة الببتيد وقد يكون لها دور ما في اختيار الركيزة.

4.3 وحدة الحذف والإدراج

تم استنتاج أن العلاقات بين الوحدات النمطية في المنبع والمصب للنطاقات المدرجة كانت مهمة لإنشاء خطوط تجميع NRPS الهجينة بنجاح. بينما تم الحفاظ على المجال C – A من الوحدة النمطية 5 سليمًا ، حيث تم اعتبار ذلك مهمًا لمنح خصوصية D -Hpg ، تمت محاذاة ترتيب المجالات الأخرى بحيث يتم الحفاظ على مناطق الرابط الأصلي. لذلك ، بينما تم اختيار C – A للوحدة 5 للحفاظ على الاتصال مع المنبع E للوحدة 4 ، بنفس الطريقة التي تم بها اختيار مجال epimerisation (E) من الوحدة 4 لإجراء الاتصال الأكثر كفاءة مع المجال C المتجه للوحدة النمطية 5. 54

4.4 أهمية مناطق رابط الوحدة النمطية

في مثال آخر ، أثناء التشريح والتعبير غير المتغاير عن أنظمة beauvericin و bassianolide الثلاثة للوحدة النمطية ، تبين أن تكوين المنتج يعتمد على صيانة منطقة رابط N-terminal في المجال C من الوحدة النمطية الثانية. 55

نظرت دراسة حديثة أخرى في تأثير استبدال المجال T الأصلي لـ IndC ، من مسار التخليق الحيوي indigoidine من Photorhabdus luminescens ، مع عدد من مجالات T الاصطناعية غير المتجانسة المختارة بعد تحليل حسابي. في المجموع ، تم تقييم سبعة نطاقات T اصطناعية أظهرت إما تناظرًا عاليًا أو تناسقًا أقل أو القليل من التماثل مع النوع الأصلي ووجد أن ثلث الأنظمة التركيبية كانت تعمل. بالإضافة إلى المجال T من BpsA ، تم أيضًا اختبار متماثل IndC من Streptomyces lavendulae. نظرًا لتشابه BpsA ، كان من المتوقع أن ينتج إنزيمًا وظيفيًا ، ومع ذلك فقد ثبت أنه غير وظيفي. كان يُعتقد أن المشكلة ناتجة عن التفاعل الضعيف بين المجالات ، لذلك تم إنتاج وتقييم عدد من التركيبات الجينية ذات مناطق رابط مختلفة من A إلى T و T إلى TE من أصل IndC أو BpsA. تم اكتشاف أن تضمين أطوال أطول لمناطق الوصلة الأصلية الناشئة من BpsA الواردة أثر إيجابيًا على إنتاج indigoidine ، مما يشير مرة أخرى إلى أن مناطق الرابط الأصلية غالبًا ما تكون ضرورية لنشاط NRPS الصحيح. 56

تم توضيح أهمية إضافية لمناطق المفصلة الوصلة ، في هذه الحالة بين المجالات A و T ، في الدراسات التي أجريت على EntF ، وهو NRPS يشارك في التخليق الحيوي للإنتيروباكتين. تم إدخال طفرة D857P في منطقة رابط A-T ، واستند هذا إلى العمل السابق على تركيبات acyl-CoA التي أظهرت أن إدخال البرولين في منطقة المفصلة يقيد دوران المجال الفرعي ويحبس الإنزيم في تشكيل تشكيل الأدينيلات. 57،58 كما هو متوقع ، ألغت هذه الطفرة في EntF إنتاج إنتيروباكتين في اختبار إعادة التكوين ، على الرغم من الكشف عن مستويات النوع البري من نشاط الغد في PPأنا مقايسة الصرف. أكد هذا أن شكل منطقة المفصلة ، الذي يتدخل البرولين فيه ، مهم لمحاذاة المجال والتحفيز. ومن المثير للاهتمام ، أن تحليل التسلسل اللاحق لنطاقات A-T المتعددة قد كشف بعد ذلك أن المنطقة التي تتبع نموذج A10 (خصوصية مجال Stachelhaus A تمنح المخلفات) 4،5 أكثر ثراءً بالبرولين من تلك الموجودة في مجالات A المستقلة. أدى تحور واحد (P961) أو مجموعة من بقايا البرولين الأخرى (P959 و P968 و P972) إلى ضعف شديد في إنتاج إنتيروباكتين. تم بعد ذلك تحديد عزر LPxP المحفوظ عند الطرف N لمنطقة رابط المجال A-T وتم إظهاره ، من خلال نمذجة التماثل والتحليل الطفري الإضافي ، للتفاعل مع بقايا رئيسية (Y908) في الطرف C للمجال A والذي مطلوب أيضًا لحركة المجال T بالنسبة إلى المجال A لإكمال الدورة التحفيزية. 59 يشير هذا إلى أن مناطق الرابط تحتاج إلى تشكيل شكل محدد للنشاط الذي يتم التحكم فيه جزئيًا بواسطة مخلفات البرولين هذه. قدمت هذه الدراسة في المختبر نظرة ثاقبة آلية ودليلًا كيميائيًا حيويًا على أهمية مناطق الرابط في التحكم في تشكيل المجال وتضفي وزناً أكبر على الملاحظات السابقة التي تشير إلى ضرورة إجراء دراسة متأنية لهذه المناطق عند محاولة أي دراسات تخليق حيوي اندماجي باستخدام NRPS.

4.5 تبادل المجالات الفرعية

المجال الفرعي الأساسي المحدد لـ HrmO- (β-Me) Phe3 تم استبدال المجال (الشكل 18A و amp C) بثلاثة مجالات فرعية مختلفة مأخوذة من NRPSs الأخرى في مسار التخليق الحيوي للهرموميسين (HrmO- (3-Nep) Ala4، HrmO-Thr2 و HrmP-Val6) بالإضافة إلى مجالين فرعيين من التخليق الحيوي CDA (cdaPS1-Asp5 و cdaPS1-Hpg6). ثم تم التعبير عن المجالات الهجينة وتنقيتها لاستخدامها في فحوصات نشاط الغدة. على الرغم من أن الهجينة المشتقة من المجالات الفرعية لمسار الهرموميسين كانت نشطة وتعرف على الأحماض الأمينية المتشابهة ، فإن تلك المشتقة من مسار التخليق الحيوي CDA كانت غير نشطة. 60

الشكل 18 (A) & amp (B) تمثيل ثنائي الأبعاد للهياكل الثانوية لمجال adenylation مع دوائر تمثل اللوالب والأسهم التي تمثل الأوراق (مقتبس من Kries 2015). 61 يتم تمييز المجالات الفرعية التبادلية في المخلفات الممتدة ذات اللون الأخضر الباهت 204 إلى 323 (أ) 60 أو المخلفات من 221 إلى 352 (ب). 61 أرقام أرجوانية تسلط الضوء على الركيزة الثمانية التي تحدد البقايا والأرقام الزرقاء تسلط الضوء على بقايا Asp و Lys الثابتة. (C) رموز منح الخصوصية لـ HrmO3A و GrsA. (D) هيكل ثلاثي الأبعاد لمجال adenylation تنشيط Phe لـ GrsA 3 مع المجال الذي يشبه الفلافودوكسين بلون أخضر. يتم تمييز المخلفات الثمانية التي تحدد الركيزة باللون الأرجواني ويتم تمييز بقايا Asp و Lys الثابتة باللون الأزرق.

حدد العمل اللاحق من قبل مجموعة مختلفة المزيد من الحدود للاستبدال التي اقتصرت فقط على المجال الفرعي الشبيه بالفلافودوكسين للمجال A الذي يحدد Phe من GrsA (الشكل 18B و D). تم إجراء تسعة بدائل للمجال الفرعي ، وأربعة مأخوذة من وحدات فرعية أخرى من NRPS في مسار التخليق الحيوي للجراميسيدين ، وخمسة من وحدات فرعية NRPS لمجموعة من مسارات التخليق الحيوي الأخرى. ثم تم التعبير عن المجالات الهجينة وتنقيتها لاستخدامها في فحوصات نشاط الغدة. تم عرض نشاط غدي كبير لمجالات فرعية مأخوذة من مسار الجراميسيدين بالإضافة إلى اثنين من الأنواع الأخرى ، مما يدل على أن نجاح زرع المجال الفرعي لا يقتصر على داخل نوع معين. 61 يقترن اختبار آخر بنشاط طفرات المجال الهجين A إلى GrsB1 في محاولة لإنتاج ديكيتوبيبرازين. في هذه الحالة ، تم اختبار واحد من بين الأربعة طفرات التي تم تحديدها سابقًا على أنها ناجحة عبر مقايسة المجال A وتبين أنها تحفز هذا التفاعل. حقيقة أنه حتى واحدًا من طفرات المجال الفرعي التسعة الشبيهة بالفلافودوكسين كان ناجحًا في كلا الاختبارين البيوكيميائيين في المختبر يوضح قدرة هذا النهج على تشكيل مجال وظيفي A والذي ، مع مزيد من الصقل ، يمكن تمديده للاستخدام في مسارات التخليق الحيوي الأخرى ولإنتاج الببتيدات غير الصبغي الهجينة في الجسم الحي.

4.6 المنظور والمستقبل لوحدات NRPS الفرعية / وحدة / مجال التبادلات


خيارات الوصول

احصل على حق الوصول الكامل إلى دفتر اليومية لمدة عام واحد

جميع الأسعار أسعار صافي.
سيتم إضافة ضريبة القيمة المضافة في وقت لاحق عند الخروج.
سيتم الانتهاء من حساب الضريبة أثناء الخروج.

احصل على وصول محدود أو كامل للمقالات على ReadCube.

جميع الأسعار أسعار صافي.


تخليق الببتيد غير الريبوسومي: لماذا لا يستطيع الريبوسوم إنتاج الجلوتاثيون؟ - مادة الاحياء

أ معهد موناش لاكتشاف الطب الحيوي ، قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، جامعة موناش ، كلايتون ، فيكتوريا 3800 ، أستراليا
بريد الالكتروني: [email protected]

ب EMBL أستراليا ، جامعة موناش ، كلايتون ، فيكتوريا 3800 ، أستراليا

ج مركز التميز التابع لمجلس البحوث الأسترالي للابتكارات في علوم الببتيد والبروتين ، جامعة موناش ، كلايتون ، فيكتوريا 3800 ، أستراليا

د مرفق Monash Proteomics and Metabolomics ، جامعة موناش ، كلايتون ، فيكتوريا 3800 ، أستراليا

الملخص

يعد تخليق الببتيد غير الريبوسومي مسارًا حيويًا مهمًا في عملية التمثيل الغذائي الثانوي. في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في إستراتيجيات إعادة تصميم الوحدات النمطية للمضاد الحيوي glycopeptide teicoplanin. باستخدام إعادة تحديد موقع أو تبادل المجالات داخل وحدات NRPS ، حددنا كيفية بدء التخليق الحيوي للببتيد واستكشفنا متطلبات إعادة الهندسة الوظيفية لكل من مجال التكثيف / الأدينيل وواجهات مجال التكدس / التكثيف. لقد أظهرنا أيضًا استراتيجيات تضمن التواصل بين وحدات NRPS المعزولة ، مما يؤدي إلى مسارات تجميع جديدة للببتيد. يوفر هذا رؤى مهمة في إعادة هندسة NRPS للتخليق الحيوي لمضادات الجليكوببتيد وله آثار واسعة لإعادة تصميم أنظمة NRPS الأخرى.


تخليق الببتيد غير الريبوسومي: لماذا لا يستطيع الريبوسوم إنتاج الجلوتاثيون؟ - مادة الاحياء

معهد هيلمهولتز للأبحاث الصيدلانية ، سارلاند (HIPS) ، مركز هيلمهولتز لأبحاث العدوى (HZI) ، حرم جامعة سارلاند ، 66123 Saarbr & # 252cken ، ألمانيا

ب جامعة سارلاند ، الكيمياء العضوية ، الحرم الجامعي Geb. C4.2 ، 66123 Saarbr & # 252cken ، ألمانيا

ج قسم الأحياء الدقيقة الجزيئية ، مركز جون إينيس ، نورويتش ، المملكة المتحدة

د مدرسة الكيمياء ، جامعة جلاسكو ، غلاسكو ، المملكة المتحدة
بريد الالكتروني: [email protected]

الملخص

تغطي: الخمسينيات حتى نهاية عام 2020

بوترومايسين هي فئة من المنتجات الطبيعية الببتيد macrocyclic التي تنتجها عدة ستربتوميسيس الأنواع وتمتلك نشاطًا واعدًا مضادًا للجراثيم ضد مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة ذات الصلة سريريًا. إنها تنتمي إلى عائلة الببتيد المركب بالريبوسومات والمعدلة بعد الترجمة (RiPP) من المنتجات الطبيعية. يحتوي الهيكل على حلقة كبيرة فريدة مكونة من أربعة أحماض أمينية عبر ارتباط ميددين نادر ، مثيلة C و a د-حمض أميني. تغطي هذه المراجعة جميع جوانب أبحاث البوترومايسين مع التركيز على السنوات الأخيرة (2009-2020) ، حيث تم تحقيق تقدم كبير في التوليف الكلي وفهم التخليق الحيوي للبيروميسين.


الانتماءات

قسم علوم النبات ، كلية الزراعة وعلوم الحياة ، جامعة سيول الوطنية ، جواناكرو 200 ، جواناك جو ، سيول ، 151-921 ، كوريا

كيو هو لي ، داي هوان كوون وأمبير هاك سو سيو

كلية العلوم البيولوجية التطبيقية ، جامعة كيونغ بوك الوطنية ، دايجو ، 41566 ، كوريا

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

يمكنك أيضًا البحث عن هذا المؤلف في PubMed Google Scholar

مساهمات

صمم HSS المخطوطة. كتب KHL و DHK و HSS المخطوطة. قامت KHL و DHK و JTS و HSS بتقييم المخطوطة.


شاهد الفيديو: Termination of Transcription انهاء عملية الانتساخ (كانون الثاني 2023).