معلومة

9.6: الاقتران - علم الأحياء

9.6: الاقتران - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

هناك عمليتان أخريان يمكن أن تؤديا إلى نقل أفقي للجينات في البكتيريا: الاقتران والتنقل. على عكس التحول ، فإن هذه العمليات "تفرض" الحمض النووي على ما قد يكون خلية مترددة. في عملية الاقتران ، يمكننا التمييز بين نوعين من الخلايا البكتيرية (من نفس النوع). يحتوي أحدهما على بلازميد يعرف بعامل الجنس (F) بلازميد. تُعرف هذه الخلايا بخلايا Hfr (إعادة التركيب عالية التردد). يحتوي هذا البلازميد على الجينات اللازمة لنقل نسخة من الحمض النووي الخاص به إلى خلية تفتقر إلى البلازميد F. من حين لآخر ، يمكن للبلازميد F أن يدمج (يدخل) نفسه في كروموسوم الخلية المضيفة وعندما يحدث ذلك ، يمكن للنظام الوسيط F-plasmid نقل جينات الخلية المضيفة (بالإضافة إلى جينات البلازميد) إلى خلية F. للمساعدة في تبسيط الأمور ، سنشير إلى خلية Hfr على أنها متبرع بالحمض النووي والخلايا F على أنها متلقية للحمض النووي.

لبدء الاقتران ، تصنع خلية Hfr جسراً فعلياً للخلية F. يؤدي كسر الحمض النووي المتبرع إلى بدء عملية يتم من خلالها تصنيع الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل ونقله إلى الخلية المتلقية (F-). يتم تحديد كمية الحمض النووي المنقولة إلى حد كبير من خلال المدة التي يظل فيها جسر النقل سليمًا. يستغرق نقل كروموسوم المتبرع بالكامل من Hfr إلى خلية F. بمجرد دخول الخلية F ، يتم دمج الحمض النووي في كروموسوم المستلم ، ليحل محل نسخ المتلقي من الجينات المنقولة (من خلال عملية تعرف باسم إعادة التركيب المتماثل). باستخدام سلالات Hfr مع F- بلازميدات متكاملة تحمل أليلات مختلفة من جينات مختلفة ، ومن خلال التحكم في مدة الاقتران (فصل الخلايا عن طريق وضعها في خلاط المطبخ) ، تمكن المجربون من تحديد ترتيب الجينات على طول الكروموسوم. كانت النتيجة اكتشاف أن الكائنات الحية ذات الصلة لها نفس الجينات مرتبة بالترتيب نفسه. الرسم النموذجي للكروموسوم البكتيري الدائري يشبه ساعة تنتقل من 0 إلى 100 ، مع وضع الجينات في مواقعها ، بناءً على الوقت الذي يستغرقه نقلها (بالدقائق). هذا مثال على التخليق ، أي الحفاظ على ترتيب الجينات على طول الكروموسوم266. سنعود إلى synteny قريبا.

إذا تم نقل تسلسل F البلازميد بأكمله ، تصبح الخلية F الأصلية خلية Hfr. إذا فقدت خلية Hfr تسلسل F البلازميد ، فإنها تعود إلى الحالة F. النتيجة النهائية لعملية الاقتران مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها في التكاثر الجنسي في حقيقيات النوى (انظر أدناه) ، أي أن الخلية F الأصلية لديها الآن جينوم مشتق جزئيًا من نفسها ومن خلية سلالة Hfr "المانحة".


باستخدام قيم Ka في الجدول 9.6 ، احسب الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت الذي يحتوي على التركيزات المعطاة لحمض ضعيف وقاعدته المترافقة. a.0.55 M CH3COOH و 0.55 M NaCH3COO

باستخدام كأ القيم الواردة في الجدول 9.6 ، احسب الرقم الهيدروجيني للعازل الذي يحتوي على تركيزات معينة لحمض ضعيف وقاعدته المترافقة.

a.0.55 M CH3COOH و 0.55 M NaCH3سجع

متعادل حمض ضعيف القاعدة المترافقة كأ
حمض الخليك / أسيتات CH3COOH CH3مدير العمليات - 1.8 × 10 − 5
بيكربونات / كربونات HCO3 كو3 2 − 5.6 × 10 − 11
فوسفات الهيدروجين / فوسفات الهيدروجين ح2ص4 HPO4 2 − 6.2 × 10 − 8
فوسفات الهيدروجين / فوسفات HPO4 2 − ص4 3 − 2.2 × 10 − 13


المواد | الطرق

خلايا B. truncatella تم الحصول عليها من شركة Carolina Biological Supply Company (بيرلينجتون ، نورث كارولاينا ، الولايات المتحدة الأمريكية) وخلايا C. ماجنا تم الحصول عليها من American Type Culture Collection (# 50128). تم إنشاء ونمو مزارع Clonal في مياه Volvic مع حبوب القمح و كليبسيلا ص. B. truncatella وشملت الثقافات أيضا باراميسيوم ص. تم التقاط الخلايا الفردية باستخدام ماصة وغسلها ثلاث مرات في ماء Volvic المعقم ، ثم تركها تجويع لمدة 48 ساعة. تم تضخيم الجينوم الكامل لعشر خلايا جائعة من كل نوع على حدة باستخدام REPLI-g Mini Kit (هيلدن ، ألمانيا) باتباع تعليمات الشركة المصنعة. لكل نوع ، تم دمج المنتجات العشرة المضخمة للجينوم الكامل بتركيزات متساوية من الحمض النووي.

تضخيم الحمض النووي من B. truncatella تم تسلسلها باستخدام كيمياء Illumina MiSeq v2 (13،288،644 2 × 250 bp قراءة) وكيمياء Illumina HiSeq v3 113،546،269 2 × 150 نقطة أساس. تضخيم الحمض النووي من C. ماجنا تم تسلسلها باستخدام كيمياء MiSeq v3 (18،770،554 2 × 300 نقطة أساس) وكيمياء HiSeq v3 (28،298،554 2 × 150 نقطة أساس للقراءة). نظرًا لأن أحجام الجينوم لهذين النوعين غير معروفة ، لم نتمكن من تقدير تغطية التسلسل. تم البحث عن الطول الأمثل لـ k-mer لتجميع الجينوم ضمن نطاق 21–201 باستخدام KmerGenie v1.6976 (Chikhi and Medvedev 2014) ، باستخدام المعلمة "ثنائية الصيغة الصبغية". تم بعد ذلك تجميع الجينوم مع Minia v2.0.7 (Chikhi and Rizk 2012) ، مع ضبط الحد الأدنى من الوفرة في kmer إلى 5. ثم تم تحليل contigs الذي تم الحصول عليه باستخدام AUGUSTUS v2.7 (Stanke et al. 2004) للحصول على شرح هيكلي ، باستخدام ما يلي المعلمات: البحث في الجينوم على كلا السلاسل هو توقع جزئي للجينات بشكل مستقل على كل خيط ، والسماح للجينات المتداخلة على السلاسل المعاكسة بتقرير النصوص مع تعيين أنواع أكواد الإيقاف داخل الإطار على الهدب T. ثيرموفيلا. تم إيداع القراءات في أرشيف قراءة تسلسل GenBank تحت أرقام BioProject PRJNA381863 و PRJNA382551.

تم إنشاء قاعدة بيانات استعلام عن 11 جينًا خاصًا بالانقسام الاختزالي و 40 جينًا مرتبطًا بالانقسام الاختزالي من حقيقيات النوى الهدبية وغير المتحضرة باستخدام الأدبيات والبحث بالكلمات الرئيسية لقاعدة بيانات بروتين NCBI من Chi et al. (2014 أ). بالنسبة لـ REC8 ، استخدمنا تسلسل حقيقيات النوى الكنسي و T. ثيرموفيلاغير قانوني REC8 (Howard-Till et al. 2013). تم البحث في ORFs لكلا النوعين من خلال قاعدة بيانات الاستعلام باستخدام BlastP (Altschul et al. 1990) و HMMER v3.0 (Eddy 2001). يضرب مع هتم الاحتفاظ بالقيم & lt10 −4 للتسلسل الكامل. استخدم التحقق من المتجانسات المرشحة بحث BlastP المتبادل مقابل قاعدة بيانات تسلسل البروتين غير الفائض لـ NCBI (الملفات التكميلية 1 و 2 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت).

من أجل تحديد قوة تنقية الاختيار الذي يعمل على الجينات الانقسام الاختزالي ، قمنا بقياس ω = dN / dS ، وهو عدد الاستبدالات غير المرادفة لكل موقع غير معروف مقسومًا على عدد البدائل المترادفة لكل موقع مترادف. تم محاذاة التسلسلات التي تم إنشاؤها من هذه الدراسة مع التسلسلات المتماثلة التي تم تحديدها من T. ثيرموفيلا, P. tetraurelia, Ichthyophthirius multifiliis، و Oxytricha trifallax بواسطة Chi et al. (2014 أ). تمت محاذاة التسلسلات في Geneious v4.8.3 (Kearse et al. 2012) باستخدام Translation Align with ClustalW v2 (Larkin et al.2007). تم استبعاد التسلسلات التي لم يكن لها تداخل كافٍ مع الجينات الأخرى ، أو كانت غير قابلة للتحاذي ، أو تم تحديدها على أنها مماثلة للجينات من هذه الأنواع الأخرى من التحليل الإضافي (الجدول التكميلي 1 ، المواد التكميلية عبر الإنترنت). تم الاستدلال على سلاسل الأنساب المحتملة القصوى لكل جين باستخدام MEGA7 (Kumar et al. 2016) ، وتم تقدير معدلات المحطات الفرعية المترادفة وغير المرادفة باستخدام PAML v4.8 (Yang 2007). تم حساب ω لأول مرة بين B. truncatella و C. ماجنا. ثم تم تضمين جميع الأنواع لاختبار ما إذا كان النسب يؤدي إلى C. ماجنا أظهر قيمًا أعلى لـ ، وهو ما كان متوقعًا إذا لم تعد هذه الجينات تعمل وبالتالي تعاني من انتقاء مريح. باستخدام codeml ، قارنا نموذجًا للتطور بقيمة واحدة للشجرة بأكملها (النموذج = 0) بنموذج حيث C. ماجنا كان للنسب قيمة منفصلة لـ ω (النموذج = 2). تم استخدام اختبار نسبة احتمالية السجل لتحديد ما إذا كان النموذج الثاني يوفر ملاءمة أفضل للبيانات.


كوكوليثوفورس مثل إميليانيا هكسليي الموضح هنا هي عوالق نباتية بحرية وحيدة الخلية تنتج موازين كربونات الكالسيوم (coccoliths). تحدث في جميع محيطات العالم وتمثل معًا أكبر مصدر لكربونات الكالسيوم الحيوية على الأرض ، مما يساهم بشكل كبير في دورة الكربون العالمية. يتم إفراز العصعصيات ، التي يتم إنتاجها داخل الخلايا ، على سطح الخلية. يوفر اكتشاف قنوات البروتون في غشاء الخلية coccolithophore نظرة ثاقبة جديدة حول كيفية تعاملهم مع البروتونات الزائدة الناتجة أثناء التكلس وسيوفر دراسات مستقبلية لكيفية استجابة هذه الكائنات المهمة لتحمض المحيطات (انظر Taylor et al.، e1001085).

حقوق الصورة: أليسون آر تايلور (مرفق الفحص المجهري بجامعة نورث كارولينا ويلمنجتون)

الاقتباس: (2011) بلوس علم الأحياء صورة العدد | المجلد. 9 (6) يونيو 2011. PLoS Biol 9 (6): ev09.i06. https://doi.org/10.1371/image.pbio.v09.i06

نشرت: 28 يونيو 2011

حقوق النشر: © 2011 تايلور. هذا مقال مفتوح الوصول يتم توزيعه بموجب شروط ترخيص Creative Commons Attribution License ، والذي يسمح بالاستخدام غير المقيد والتوزيع والاستنساخ بأي وسيلة ، بشرط ذكر المؤلف الأصلي والمصدر.


ثابت التأين الأساسي ، كب

ثابت التأين الأساسي (Kب) - ثابت التوازن لتأين قاعدة يسمى أيضًا ثابت تفكك القاعدة .

المعادلة العامة لتفاعل قاعدة B مع الماء:

ب (عبد القدير) + ح2O (l) ⇌ BH + (aq) + OH - (aq)

تتفاعل قواعد Bronsted-Lowry مع الماء لإنتاج أيونات OH - (aq) وحمض متقارن ، والتي تحدد معًا الخصائص الحمضية القاعدية للمحلول المائي.

قواعد ضعيفة، مثل الأحماض الضعيفة ، تشكل التوازن الديناميكي في المحاليل المائية.

لتفاعل قاعدة عامة مع الماء ، تتم كتابة معادلة قانون التوازن ، K ، على النحو التالي:

نظرًا لأن تركيز (كثافة) الماء ثابت ، يمكن دمجه في قيمة K (تمامًا كما كان في معادلة قانون التوازن لـ Kأ).

ينتج عن هذا ثابت جديد ، Kب، ودعا ثابت التأين الأساسي:

القواعد الضعيفة هي القواعد المترافقة للأحماض الضعيفة.

على سبيل المثال ، أيون ethanoate ، C2ح3ا2 - (aq) ، هو القاعدة المترافقة لحمض الإيثانويك ، HC2ح3ا2 (عبد القدير). وبالمثل ، فإن أيون هيبوكلوريت ، ClO - (aq) ، هو القاعدة المترافقة لحمض هيبوكلوروس ، HClO (aq).


نصائح عملية من ELISA

تجمع مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) بين خصوصية الأجسام المضادة وحساسية فحوصات الإنزيمات البسيطة ، باستخدام الأجسام المضادة أو المستضدات المقترنة بإنزيم سهل الفحص. يمكن أن توفر ELISAs قياسًا مفيدًا لتركيز المستضد أو الجسم المضاد. لكونها واحدة من أكثر المقايسات المناعية حساسية ، تقدم ELISA قيمة تجارية في الأبحاث المختبرية ، وتشخيص المؤشرات الحيوية للأمراض ، ومراقبة الجودة في مختلف الصناعات.

هناك أنواع مختلفة من ELISA وفقًا لطريقة الكشف عن المادة التحليلية. كل واحد منهم لديه بروتوكول خاص به ولكن المبدأ الأساسي مشابه. ELISA هو إجراء من خمس خطوات بشكل عام:
1) طلاء المستضد
2) حجب جميع المواقع غير المقيدة لمنع الامتصاص غير النوعي
3) إضافة مادة التحاليل والحضانة
4) أضف الجسم المضاد المسمى والحضانة
5) أضف الكواشف للتلوين / اللمعان ، وبالتالي إعطاء نتيجة إيجابية.

لقد ناقشنا بالفعل تنسيق ELISA والبروتوكول العام في دليل ELISA ودليل تطوير ELISA. نناقش هنا بشكل أساسي بعض المعارف الأساسية والنصائح العملية أثناء عملية تشغيل ELISA. إذا كنت بحاجة إلى مزيد من المعلومات حول مجموعة ELISA التجارية ، فيرجى زيارة منتج ELISA Kit الخاص بنا.

2. لوحة ELISA (المرحلة الصلبة)

هناك أنواع مختلفة من الطور الصلب يمكن استخدامها مع ELISA ، مثل الغشاء ولوحة البئر والخرز. تم وصف توصيفاتهم في الجدول التالي 1.

الجدول 1. أنواع الأطوار الصلبة المناعية

المادة قدرة الربط نوع التفاعل
غشاء
نيتروسليلوز
PVDF
نايلون

عالي
عالي
عالي

مسعور ، ماء
نافرة من الماء
نافرة من الماء
اللوحات والأنابيب
البوليسترين
بولي فينيل

قليل
قليل

نافرة من الماء
نافرة من الماء
خرز
البوليسترين
البوليسترين المشتق
الجسيمات الدقيقة

معتدل
عالي
عالي

نافرة من الماء
تساهمي ، كاره للماء ، ماء
التساهمية والطارئة للماء

الأكثر شيوعًا ، يتم إجراء ELISA في 96 طبقًا جيدًا (أو 384 جيدًا). معظم الصفائح عبارة عن بوليسترين أو مشتقات من البوليسترين يتم الحصول عليها عن طريق التعديل الكيميائي أو تشعيع السطح. يمكن امتصاص بروتين الالتقاط بشكل سلبي على سطح لوح البوليسترين أو التساهمية المقترنة من خلال التعديلات التي تترك مجموعات أمين أو مجموعات تفاعلية مثل مجموعات مالييميد أو هيدرازين أو N-oxysuccinimide على السطح (الشكل 1). هذا الارتباط وتثبيط الكواشف هو الذي يجعل ELISA سهل التصميم والأداء. إن وجود متفاعلات ELISA مثبتة على سطح الصفيحة الدقيقة يجعل من السهل فصل المواد المرتبطة عن المواد غير المقيدة أثناء الفحص. هذه القدرة على التخلص من المواد غير المرتبطة بشكل خاص تجعل من ELISA أداة قوية لقياس تحليلات معينة داخل تحضير خام.

الشكل 1. الكيمياء السطحية للوحة البوليسترين والبروتين المعطّل.

سوف يرتبط البوليسترين بمجموعة متنوعة من البروتينات بكميات متزايدة اعتمادًا على تركيزها في محلول الطلاء. يجب تحديد الكمية المحددة والأمثل لكل بروتين. لا تمتص الكربوهيدرات والبروتينات شديدة الغليكوزيلات بشكل جيد للبوليسترين بالقوى الموضحة أعلاه لأن لديهم قدرة قليلة جدًا على المشاركة في التفاعلات الكارهة للماء. من أجل التمسك بهذه الجزيئات ، يجب على المرء أن يلجأ إلى الروابط التساهمية.

تم إجراء عدد من التعديلات على سطح البوليسترين والتي تسمح بالربط التساهمي للجزيئات بالسطح البلاستيكي (الشكل 1 ج). تتفاعل مجموعات مالييميد مع سلفهيدريل مكونًا رابطًا تساهميًا بين السطح البلاستيكي والبروتين أو الببتيد. يتفاعل الهيدرازين مع الألدهيدات الناتجة عن أكسدة الكربوهيدرات. يتفاعل N-Hydroxysuccinimide (NHS) مع الأمينات الموجودة على الببتيدات أو البروتينات. الببتيدات إما من خلال نهاية COOH باستخدام رابط متقاطع مثل carbodiimide أو من خلال الأمين باستخدام رابط كروس متماثل مثل disuccinimidyl suberate (DSS). يوضح الجدول 2 الطريقة الموصى بها لشل حركة المستضدات المختلفة على لوحة البوليسترين.

الجدول 2. المستضدات المختلفة وطريقة التثبيت الموصى بها.

الامتزاز المباشر الارتباط التساهمي
البروتينات
أطول من 15-20 حمض أميني الببتيدات
حواتم جزيء صغير مرتبطة بالبروتين
البكتيريا والفيروسات
بروتينات غليكوزيلات كثيفة
البروتينات في وجود المنظفات
الكربوهيدرات
الببتيدات القصيرة
الدهون
الحمض النووي

3. طلاء المستضد

الميزة الرئيسية لـ ELISA القائمة على الصفيحة هي أن بروتين الالتقاط (جسم مضاد أو مستضد) يمكن توصيله بالأسطح بسهولة عن طريق الامتزاز السلبي أو الارتباط التساهمي. تسمى هذه العملية عادة بالطلاء. تؤثر العوامل المتعددة على عملية طلاء المستضد. يعتمد معدل ومدى الطلاء في الغالب على العوامل التالية:
؟ معامل الانتشار للجزيء المرتبط
؟ نسبة مساحة السطح المطلية إلى حجم محلول الطلاء
؟ يتم امتصاص تركيز المستضد
؟ درجة حرارة
؟ وقت الامتزاز

ترتبط هذه العوامل. من المهم للغاية تحديد التركيز الأمثل لطلاء المستضد لكل نظام. يعد الوقت ودرجة الحرارة أيضًا عاملين مهمين يتحكمان في كمية البروتين الممتص. نطاق التركيز من 1-10 ميكروغرام / مل من البروتين ، بحجم 50-100 ميكرولتر ، هو دليل جيد لمستوى البروتين اللازم لتشبع المواقع المتاحة على لوح البوليسترين. حلول الطلاء الشائعة الاستخدام هي: 50 ملي كربونات ، ودرجة الحموضة 9.6 20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.5 و 10 ملي مولار ، ودرجة الحموضة 7.2. يحدث الامتصاص الأكثر شمولاً وأدنى اختلاف من البئر إلى البئر بين عشية وضحاها (16-18 ساعة) عند 4 درجات مئوية مع إغلاق الآبار لمنع التبخر. يمكن تسريع وقت الامتزاز عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-8 ساعات أو 37 درجة مئوية لمدة 1-4 ساعات. هناك العديد من الاختلافات ، وفي النهاية ، يجب على كل عالم معايرة مستضد معين للحصول على نظام معياري. بعد عملية الطلاء ، لا تنس إزالة محلول الطلاء وغسل اللوحة عن طريق ملء الآبار بـ 200 ميكرولتر من PBS لمدة 3 مرات. ثم قم بإزالة محاليل الغسيل عن طريق تحريك اللوحة برفق فوق الحوض. قم بإزالة أي قطرات متبقية عن طريق تربيت اللوحة على منشفة ورقية.

في حالة وجود أي مشكلة في طلاء المستضد ، يرجى زيارة خدمة طلاء الصفيحة الدقيقة الخاصة بنا ، أو اطلب استشاريًا مجانيًا من المتخصصين لدينا.

4. عملية الحجب

إن طلاء الآبار بشريك الربط المحدد ، إما مستضد أو جسم مضاد ، يترك مواقع غير مشغولة كارهة للماء على البلاستيك. يجب حظر هذه المواقع من أجل منع الارتباط غير المحدد للمواد المتفاعلة اللاحقة. إذا لم يتم تحقيق ذلك بشكل فعال ، فإن الفحص سيعاني من إشارة خلفية عالية وخصوصية وحساسية منخفضة (الشكل 2). تعمل هذه الحواجز عن طريق تقليل الارتباط غير المحدد لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. لمنع الارتباط غير المحدد ، يتم استخدام مخازن الحظر بعد خطوة طلاء المرحلة الصلبة لمنع أي مواقع ربط مفتوحة متبقية.

يتم اختيار الكواشف المانعة عادة بطريقة تجريبية. قد لا يؤدي الحاجز الأمثل لمقايسة واحدة أداءً جيدًا في المقايسات الأخرى. الفئتان الرئيسيتان من عوامل الحجب التي تم اختبارها هما البروتينات والمنظفات.

الشكل 2. لوحة ELISA مع وبدون عملية عرقلة.

تأتي المنظفات في ثلاث فئات: غير أيوني ، وأيوني ، وزويتيريونيك. لا يُنصح باستخدام كل من الأيونات والزيوتريونية كمانع لأنهما يعطلان التفاعلات الكارهة للماء التي تربط البروتينات المغلفة بسطح البلاستيك. عادةً ما تكون المنظفات المستخدمة ككواشف مانعة غير أيونية مثل Tween 20 و Triton X-100. تعتبر المنظفات حاصرات مؤقتة فهي لا توفر حاجزًا دائمًا أمام ارتباط الجزيء الحيوي بالسطح لأنه يمكن إزالة قدرتها على الحجب عن طريق الغسيل بالماء أو المخزن المائي. على عكس المنظفات غير الأيونية ، تعد البروتينات حاصرات دائمة ولا يلزم إضافتها إلا مرة واحدة بعد طلاء السطح بجزيء الالتقاط. يتم سرد بعض حاصرات البروتين الأكثر استخدامًا في الجدول 3 بالإضافة إلى مزاياها وعيوبها.

الجدول 3. مزايا وعيوب حاصرات البروتين الشائعة الاستخدام.

عوامل الحجب المثالية لها الخصائص التالية:
؟ منع الارتباط غير المحدد بشكل فعال لمتفاعلات الفحص على سطح البئر
؟ لا تخل بربط مكونات الفحص التي تم إدمصاصها في البئر
؟ يعمل كمثبت (يمنع تمسخ) المواد المتفاعلة للمقايسة على المرحلة الصلبة
؟ لا تتفاعل مع متفاعلات الفحص الأخرى
؟ لا تمتلك نشاطًا إنزيميًا قد يساهم في توليد إشارة من الركيزة أو تدهور المواد المتفاعلة
؟ أداء ثابت عبر مجموعات مختلفة

5. تحضير الجسم المضاد

نظرًا لأن الأجسام المضادة هي حجر الزاوية في اختبار ELISA ، فمن الواضح أن اختيار الأجسام المضادة له أهمية قصوى. المشكلة الأكثر شيوعًا هي كيفية اختيار الجسم المضاد ، أحادي النسيلة (MAb) أو البوليكلون (PAb)؟ بشكل عام ، غالبًا ما يتم اختيار MAb كجسم مضاد أولي لتأسيس أعلى مستوى من الخصوصية في الاختبار ، ويتم اختيار PAb كجسم مضاد ثانوي ، لتضخيم الإشارة عبر أحداث ربط متعددة. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي مجموعة. يجب اختبار جميع الأجسام المضادة المرشحة مع نوع العينة المقصود من أجل اختيار أفضل المؤدين.

يجب تخفيف الجسم المضاد الأولي / الثانوي في محلول الحجب للمساعدة في منع الارتباط غير المحدد. عادة ما يكون التركيز من 0.1-1.0 ميكروغرام / مل كافياً.

بحاجة إلى جسم مضاد عالي الجودة ، راجع خدمة وضع العلامات المخصصة للأجسام المضادة.

تحتاج إلى أزواج من الأجسام المضادة لـ Sandwich ELISA ، تعرف على المزيد حول خدمة تطوير أزواج الأجسام المضادة المتطابقة.

الجدول 4. الاختلافات الرئيسية في الأداء بين MAb و PAb

الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MAb) الأجسام المضادة متعددة النسيلة (PAb)
أ. تتعرف هذه الأجسام المضادة ، التي تُنتج بشكل عام في الفئران أو بشكل متجانس ، على حاتمة واحدة.
ب. نظرًا لأن جزيء واحد فقط من الجسم المضاد يمكنه الارتباط بالمستضد ، يكون التفاعل محددًا للغاية ولكنه قد يفتقر إلى الحساسية.
أ. ينتج في الماعز والأغنام والدجاج والأرانب والحيوانات الأخرى.
ب. المصل متعدد الحلقات هو مركب غير متجانس من الأجسام المضادة ذات الخصائص الفريدة وتركيز الجسم المضاد المحدد (PAb) عادة 50-200 مجم / مل.
ج. يمكن لـ PAbs التعرف على حواتم متعددة على أي مستضد واحد مما يجعلها أقل حساسية للتغيرات الطفرية للمستضد.
د. تكون PAbs مفيدة عندما تكون طبيعة المستضد غير معروفة جيدًا. ومع ذلك ، فإن كميتها محدودة بعمر الحيوان.

6. تحضير العينة

تحتوي العينات على التحليلات الرئيسية التي نحتاج إلى الكشف عنها بواسطة ELISA. قد يؤدي التحضير الممتاز لمحلول العينة إلى تحسين جودة اختبار ELISA. يمكن أن يكون نوع العينة متنوعًا مثل مصل الدم ، أو البلازما ، أو البول ، أو محللات الخلية أو الأنسجة ، أو اللعاب ، أو الحليب ، أو مادة طافية للخلية ، إلخ. قد تحتاج كل عينة إلى عملية تحضير محددة. بروتوكول عام لتحضير العينة كالتالي:
أ. تركيز مستخلص البروتين هو على الأقل 1-2 مجم / مل.
ب. يتم تخفيف مستخلصات الخلايا والأنسجة بنسبة 50٪ باستخدام محلول ملزمة.
ج. يتم طرد العينات عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي رواسب قبل الاستخدام.

ولكل تفاصيل عينة ، انظر الجدول 5.

الجدول 5 أنواع عينات ELISA الشائعة الاستخدام وعلاجاتها.

عينات العلاجات
مصل اجمع الدم الكامل في أنبوب بدون إضافات احفظه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. جهاز الطرد المركزي 10 دقائق عند 3000 دورة في الدقيقة. قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. قلل دورات التجميد / الذوبان.
بلازما جمع الدم الكامل في جهاز طرد مركزي EDTA أو السيترات أو أنبوب الهيبارين الصوديوم لمدة 10 دقائق عند 3000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية في قسامة في أنابيب صغيرة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. قلل دورات التجميد / الذوبان.
البول جمع البول بدون إضافة مثبتات. الطرد المركزي العينات الصلبة (على سبيل المثال. 10،000 x g لمدة 1 دقيقة أو 5000 x g لمدة 2 دقيقة). قسامة ، تجميد سريع في الثلج الجاف / حمام الميثانول ، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
اللعاب جمع العينات وأجهزة الطرد المركزي في 10000 × ز لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية. عينات طاف قسامة وتخزينها في -80 درجة مئوية. قلل دورات التجميد / الذوبان.
محللة الخلية ضع لوحات زراعة الأنسجة على الجليد. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا برفق مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل العازلة استخراج لكل لوحة 100 مم. قم بإمالة اللوحة وكشط الخلايا في أنبوب مبرد مسبقًا. دوامة لفترة وجيزة واحتضانها على الجليد لمدة 15-30 دقيقة. الطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية (وهذا يخلق بيليه من المحتوى غير القابل للذوبان). قسامة المادة طافية في أنابيب نظيفة ومبردة (على الجليد) وتخزين العينات في -80 درجة مئوية ، وتجنب دورات التجميد / الذوبان.
محللة الأنسجة تشريح الأنسجة ذات الأهمية بأدوات نظيفة ، ويفضل أن يكون ذلك على الجليد وبأسرع وقت ممكن لمنع التحلل بواسطة البروتياز. ضع الأنسجة في أنابيب ميكروفوج دائرية السفلية واغمر في النيتروجين السائل "للتجميد المفاجئ". تخزين العينات في -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقًا أو الاحتفاظ بها على الجليد من أجل التجانس الفوري. ل

7. حل عازلة

هناك 5 محاليل عازلة بشكل أساسي مستخدمة في اختبار ELISA: عازلة الطلاء ، ومخزن الحجب ، ومخزن الغسيل ، ومخزن الركيزة ، وتوقف المخزن المؤقت.

عازلة طلاء عادة 0.05 M عازلة كربونات مع pH = 9.6.

طلاء العازلة منع المخزن المؤقت غسل العازلة الركيزة العازلة وقف العازلة
0.05M عازلة كربونات ، ودرجة الحموضة = 9.6 انظر الجدول 3 0.01M PBS-Tween 20 ، الرقم الهيدروجيني = 7.4 عازلة حامض الفوسفوريك والستريك ، درجة الحموضة = 5.0 2 م ح2وبالتالي4
نا2كو3 1.59 جرام كلوريد الصوديوم 8 جرام 0.2M نا2HPO4 25.7 مل
ناهكو3 2.93 جرام KH2ص4 0.5 جرام 0.1 م حامض الستريك 24.3 مل
ddH2ا 1000 مل نا2HPO4 2.9 جرام ddH2ا 50 مل
ضبط الأس الهيدروجيني إلى 9.6 توين 20 0.5 مل OPD (الركيزة) 4 ملغ
التخزين في 4 درجات مئوية ddH2أضف إلى 1000 مل 30٪ ح2ا2 0.015 مل

8. خطوات الغسيل

تسمح الحضانات التي يتم إجراؤها في ELISA بتفاعلات محددة عالية التقارب بين المواد المتفاعلة. عن طريق الغسيل عدة مرات بين كل حضانة ، يتم تخفيف المواد المتفاعلة الزائدة إلى مستوى خلفية غير قابل للكشف. من أجل تخفيف المواد المتفاعلة الزائدة بشكل فعال ، من الضروري الغسل 3-5 مرات بعد كل حضانة. إنها لفكرة جيدة أيضًا السماح بنقع 5 إلى 10 دقائق مع المخزن المؤقت للغسيل في كل خطوة غسيل. إذا تم تنفيذ خطوات الغسيل يدويًا ، فاضغط على المخزن المؤقت للغسيل الزائد في كل خطوة عن طريق ضرب اللوحة رأسًا على عقب على مناشف ورقية جافة. لا تترك اللوح يجف لفترات طويلة بين خطوات الغسيل لأن هذا قد يؤدي إلى تقليل النشاط.

9. تحليل البيانات

ينتج عن اختبار ELISA ثلاثة أنواع مختلفة من إخراج البيانات:

? الكمية: يمكن تفسير بيانات ELISA بالمقارنة مع منحنى قياسي (تخفيف متسلسل لمستضد معروف ومنقى) من أجل حساب تركيزات المستضد بدقة في عينات مختلفة.
? النوعية: يمكن أيضًا استخدام ELISAs لتحقيق إجابة بنعم أو لا تشير إلى ما إذا كان مستضد معين موجودًا في عينة ، مقارنة ببئر فارغ لا يحتوي على مستضد أو مستضد تحكم غير ذي صلة.
? شبه كمي: يمكن استخدام ELISAs لمقارنة المستويات النسبية للمستضد في عينات الفحص ، حيث ستختلف شدة الإشارة بشكل مباشر مع تركيز المستضد.

عادةً ما يتم رسم بيانات ELISA بالكثافة الضوئية مقابل تركيز السجل لإنتاج منحنى سيني. تُستخدم التركيزات المعروفة للمستضد لإنتاج منحنى قياسي ثم تُستخدم هذه البيانات لقياس تركيز العينات غير المعروفة بالمقارنة مع الجزء الخطي من المنحنى القياسي (الشكل 3).


أساليب

المستضدات

الألبومين من مصل الأبقار (BSA) عبارة عن بروتين منقى طبيعي تم الحصول عليه من فلوكا ، الولايات المتحدة الأمريكية. سم الكوبرا الخام (نجا كاوثية) وأفعى الحفرة الخضراء (Trimeresurus albolabris) تم شراؤها من جمعية الصليب الأحمر التايلاندية ، تايلاند. تم تحضير الأفلاتوكسين B1-BSA المترافق والقابل للذوبان Aflatoxin B1 (سيغما ، ألمانيا) من أسبرجيلوس، فلافوس. تم تحضير إنزيم الأميليز من النوع XII-A (سيغما ، ألمانيا) من Bacillus licheniformis. خلية جنين الفرخ المنقى (PCEC) لقاح داء الكلب LEP (تشيرون بهرنغ ، الهند) كانت فيروسات داء الكلب المعطلة التي تم تربيتها في خلية الأرومة الليفية الأولية للدجاج. سرطان القنوات الصفراوية ، خط الخلية (KKU-100) ، ثبتت فعاليته في البيضة أوبيثورشيس- سرطان القنوات الصفراوية المصاحب المشتق من الخلايا الكبدية البورتا [68] ، كان هدية من الدكتور بانشوب سريبا.

بناء ناقل phagemid pMod1

تم استخدام ناقل Phage 3.2 (Maxim Biotech Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية) كأساس لبناء ناقل pMod1 phagemid. يحتوي المتجه الجديد على SFIانا و لاأقوم بتقييد المواقع وتتضمن علامة hexahistidine وعلامة Myc. اثنين من النكليوتيدات ، Mod1up (5 'TCG ACC CAT GGC TCG AGG CGG CCG CAC ATC ATC ATC ACC ATC ACG GGG CCG CAG GGC C 3') و Mod1dn (5 'CT GCG GCC CCG TGA TGG TGA TGA TGA TGT GCG GCC TCG AGC تم تلدين CAT GGG 3 ') وربطها في ناقل فج 3.2 (الشكل 1) لتوليد pMod1. تم الإدراج في اباأنا/سالأنا المواقع التي تستخدم T4 DNA ligase (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تضخيم ناقل pMod1 النهائي عن طريق التحويل بكتريا قولونية تم تحضير DH5αF '، والحمض النووي phagemid بواسطة مجموعة استخراج miniprep (Qiagen ، ألمانيا). تم تأكيد سلامة البلازميد من خلال تحليل تسلسل الحمض النووي الآلي (Macrogen ، كوريا).

بناء مكتبة الملتهمة البشرية scFv

جيل ذخيرة من الجينات scFv

تم جمع تبرعات الدم المحيطية من مائة وأربعين متبرعًا سليمًا غير محصن في أربعة مجمعات ، وفقًا لمجموعات الدم المختلفة. تم اختبار عينات الدم هذه سلبية وتم إخراجها من وحدة التبرع بالدم التابعة لجمعية الصليب الأحمر التايلاندي في مقاطعة ناخون راتشاسيما. تم تحضير إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا الليمفاوية البائية وتجميعها معًا. تم جمع ما يقرب من 2 مل من عينات الدم من كل متبرع في أربع برك ، وفقًا لفصائل الدم المختلفة (فصيلة الدم A و B و O و AB). وهكذا ، تم استخدام ما يقرب من 280 مل من عينة الدم. تم عزل الخلايا الليمفاوية B من الدم المحيطي باستخدام كاشف Ficoll plaque (Amersham ، الولايات المتحدة الأمريكية). باختصار ، تم وضع عينة الدم المخففة (1: 1 من الدم لكل برنامج تلفزيوني) بعناية فوق كاشف لوحة Ficoll ، ثم تم طرد المحلول ثنائي الطور عند 400 × ز لمدة 30 دقيقة. تم جمع الخلايا الليمفاوية B من الواجهة بين المرحلتين. تمت إزالة تلوث الواجهة مثل الصفائح الدموية وبروتينات البلازما عن طريق الغسيل باستخدام برنامج تلفزيوني. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا الليمفاوية B بواسطة كاشف TRIzol (Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تعليق الخلايا الليمفاوية B في 1 مل من TRIzol وحضنت عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع انعكاس عرضي للأنبوب. بعد إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم ، تم تدوير الأنبوب لمدة 15 ثانية ثم طرده عند 12000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 ميكرولتر من RnaseOut (40 وحدة / ميكرولتر ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، وتمت إضافة 0.5 مل من الأيزوبروبانول لترسيب الحمض النووي الريبي. تم تحضين الأنبوب عند درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تم تكوير الحمض النووي الريبي المترسب بالطرد المركزي عند 12000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم غسل الحبيبات باستخدام 0.5 مل من 75٪ إيثانول ثم طردها بالطرد المركزي عند 12000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد إزالة المادة الطافية ، تم تجفيف الحبيبات بالهواء لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة الغرفة وتم إذابتها في ماء معقم منزوع الأيونات. ثم تمت إضافة 1 ميكرولتر من RnaseOut (40 وحدة / ميكرولتر ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) إلى إجمالي RNA وتخزينها عند -70 درجة مئوية. تم إنشاء أول حبلا (كدنا) من 10 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي ، باستخدام النسخ العكسي لـ MMuLV (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية) مع مزيج من 20 ميكرومتر من oligo-dT18 و 8 نانوغرام من عشوائي سداسي البرايمر. الجينات الخاصة بالمناطق المتغيرة للسلسلة الثقيلة ، السلسلة الخفيفة ، و السلسلة الخفيفة (V.ح، الخامسκ، و V.λ) تم تضخيمها بشكل منفصل وإعادة تجميعها من خلال ثلاثة تفاعلات تفاعلية لاحقة من تفاعل البوليميراز المتسلسل. تتكون المجموعة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من 75 تفاعلاً مستقلاً لتوليد مجالات متغيرة من السلاسل الثقيلة والخفيفة. تم تصميم البادئات الثقيلة السلسلة 5 'لتشمل أ SFIموقع I ، وتشمل بادئات السلسلة الخفيفة 3 أ لاأنا موقع. تم تصميم بادئات خفيفة السلسلة 5 'لتشمل جزءًا من منطقة الرابط (Gly4Ser)3 ومتوافق مع البادئات الثقيلة السلسلة 3 (الجدول 1). تم تضخيم كل جين منطقة متغيرة بشكل منفصل باستخدام بدء PCR الساخن في تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 5 ميكرولتر (كدنا) و 1 ميكرومتر من كل 5 'و 3' تمهيدي. تم إجراء هذا التفاعل باستخدام طق بوليميراز (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تسخين العينات عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، تليها 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 55-65 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين. تم إجراء التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تم تجميع كمية متساوية من منتجات PCR في مجموعات من V.ح، الخامسκ، و V.λ ذخيرة الجينات ، وتنقيتها من درجة حرارة انصهار منخفضة هلام الاغاروز وفقا للبروتوكول القياسي [69]. في PCR الثاني ، تم تجميع السلاسل الثقيلة والخفيفة وتضخيمها باستخدام pfu بوليميريز DNA (بروماجا ، الولايات المتحدة الأمريكية). احتوى تفاعل PCR التجميعي على خليط مولاري متساوٍ من الثقيل المجمعة (V.حالحمض النووي والضوء المجمّع (V.κ، أو V.λ) ذخيرة الجينات. تم تدوير تفاعل التجميع 5 مرات (94 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 50 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية) بدون بادئات. أنشأ التفاعل الثالث ذخيرة جينية كاملة الطول scFv من PCR الثاني بواسطة تضخيم PCR في وجود بادئات السحب. قام PCR بتمديد جين scFv من SFIانا و لاI المواقع المرافقة لجينات scFv ، باستخدام الاشعال التالية: PTfw (5'-CCT TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3 ') و PTrv (5'-CAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG-3'). تم إجراء التفاعل باستخدام طق البوليميراز و 1 ميكرولتر من المنتجات المجمعة من PCR الثاني. تم تدوير PCR القابل للسحب هذا 30 مرة (94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين) ، وامتداد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم تمت تنقية العينات بواسطة QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN ، ألمانيا) للخطوة التالية.

استنساخ scFv إلى ناقل pMod1

تم هضم الحمض النووي scFv المتضخم وناقل pMod1 phagemid بالتتابع باستخدام لاانا و SFIالأول ، عن طريق الحضانة في ظروف مناسبة لمدة 10 ساعات. تم بعد ذلك إزالة الفسفرة من ناقل القطع باستخدام الفوسفاتاز المعوي في ربلة الساق (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية) وتنقيته بالهلام باستخدام Wizard ® DNA Clean-Up System (Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية) قبل الربط. تم ربط ما مجموعه 2.8 ميكروغرام من DNA scFv المهضوم في 5.5 ميكروغرام من ناقل pMod1 phagemid ، في ناقل: أدخل نسبة المولي 1: 3 ، لإنشاء مكتبة الانصهار scFv-gene III. تم إجراء الربط باستخدام T4 DNA ligase (NEB ، الولايات المتحدة الأمريكية) طوال الليل عند 16 درجة مئوية. تم electroporated سكان الحمض النووي المربوطة إلى الإشريكية القولونية (بكتريا قولونية) TG1 (Maxim Biotech Inc ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام جهاز كهربائي Eppendrof 2510 (Eppendrof ، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضين الخلايا المحولة بعد ذلك لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية قبل الانتشار على لوحة TYE التي تحتوي على الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) والجلوكوز (1٪ وزن / حجم) ، وتم تحضين اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. Complexity of the library was determined at this step by serially diluting the transformed cells and counting the number of colonies. Ligation efficiency was also determined by counting the number of colonies from no-insert ligation. Colonies were then collected, mixed with glycerol, and stored at -80°C. The library stock was grown to log phase and rescued with M13KO7 helper phage (Maxim Biotech Inc, USA). Recombinant phage preparations were purified and concentrated by polyethylene glycol (PEG) precipitation before keeping at -80°C.

Determination of library size

A total of 8.3 μg of DNA was electroporated in to بكتريا قولونية TG1 to generate the scFv phage library. After electroporation the cuvette was flushed with 6 ml of SOC medium and transformed cells were incubated for 1 hour at 37°C before spreading on TYE plate containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v), then the plate was incubated overnight at 37°C. Complexity of the library was determined by serially diluting the transformed cells and counting the number of colonies. A volume of 100 μl from transformation reactions was taken and a four step 10-fold serial dilution was made. The 100 μl of each dilution was plated out. The appearance of 250 individual colonies from 10 4 dilution titer indicated a library diversity of 1.5 × 10 8 .

Selection of phage antibody library

Selection of phage particles displaying specific scFv fragments were performed on Immuno 96 MicroWell™ Plates (Nunc, Denmark). The different protein antigens (50–600 μg/ml) in phosphate-buffered saline (PBS) (or 0.1 mM NaHCO3, in case of amylase) were coated on the plates overnight at 4°C (in case of Rabies, the preparation was first incubated at 37°C for 2 hrs). For cholangiocarcinoma cell surface, approximately 5 × 10 5 cells growing in a 5-ml flask was used. Following blocking with 2% (w/v) skimmed milk powder in PBS (2% MPBS), a library containing between 10 11 and 10 12 phage particles were added and the plate was incubated for 2 hours at room temperature (RT 25–28°C). Non-bound phages were eliminated by washing 10–20 times with PBS containing 0.1% Tween 20 (PBS-T), followed by 10–20 times washing with PBS. The bound phages were eluted by incubation with 50 μl of 1 μg/μl trypsin for 10 min, followed by 50 μl of 50 mM glycine- HCl pH 2.0 (immediately neutralized with 50 μl of 200 mM NaHPO4, pH7.5 after 10 min). Eluted phages were used to infect exponentially growing بكتريا قولونية TG1 cells by incubating for 30 min at 37°C. Infected cells were spread on TYE plate containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v), then the plate was incubated overnight at 37°C. Individual phage-infected colonies were picked and grown for production of phagemid particles in 96-well plate. The culture was rescued using either M13KO7 or KM13 helper phage (MRC HGMP Resource Centre, Cambridge, UK) as describe elsewhere [55]. Rescued phage particles were used to test their antigen recognition properties by ELISA or to initiate subsequent rounds of selection using the similar conditions. Between one and two rounds of selection were performed for each antigen.

ELISA screening of selected clones

In order to detect antigen recognition, Immuno 96 MicroWell™ Plates were coated with approximately 5–200 μg/ml of each antigen. For cholangiocarcinoma, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde in 96-well tissue culture plate. After overnight incubation at 4°C, plates were blocked with 2% MPBS for 1 hour at RT followed by three washes with PBS. The selected phage preparation was diluted 1:2 in 4% MPBS before adding into each well, and incubated for 1 hour at RT. The plates were washed three times with PBS-T, followed by three times with PBS, and incubated with a 1:5,000 dilution of a mouse anti-M13 phage-horseradish peroxidase (HRP) conjugate (Amersham-Pharmacia Biotech, Sweden) in 2% MPBS. The plates were washed again as described earlier. The ABTS (2,2-azino-di-3-ethyl-benzthiazoine-6-sulfonate) peroxidase substrate (Fluka, USA) was added, and the absorbance was read at 405 nm, using a Sunrise absorbance reader (TECAN, Austria).

Inhibition ELISA

The inhibition ELISA was performed as described in the normal ELISA method, except that the phage particles were pre-incubated in the presence of increasing amount of soluble Aflatoxin B1 from 0.039–5.0 μg/ml.

DNA fingerprint analysis and DNA sequencing

The diversity of the selected scFv clones was analyzed by comparing restriction enzyme digestion patterns, a procedure called DNA fingerprinting. The scFv sequence of individual clones was amplified by PCR using the following primers: PTfw (5'-CCT TTC TAT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3') and PTrv (5'-CAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG-3'). The amplified product was digested with a frequent cutting enzyme, BstNI (NEB, USA) and analyzed on 2% agarose gels. For DNA sequencing, plasmid DNA from different clones was purified using MiniPreps kit (QIAGEN, Germany) and the inserts were sequenced using the dideoxynucleotide chain-termination method with -96gIII primer (5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'), corresponding to the vector sequence downstream of the scFv gene. After the amino acid sequences were translated, they were analyzed by using IgBLAST [36] and V BASE [34] software.

Soluble scFv antibodies production

بكتريا قولونية HB2151 (Maxim Biotech Inc, USA) cells carrying the phagemid encoding the scFv antibody were grown in 10 ml of 2 × TY medium containing ampicillin (100 μg/mL) and glucose (1% w/v). After reaching an OD600 of 0.9, cells were harvested and grown at 30°C in glucose free 2 × TY medium containing 100 μg/mL ampicillin and 0.1 mM isopropyl-μ-d-thiogalactopyranoside (IPTG). The cell culture supernatant containing scFv were collected after induction for 20 hours. In some case, the cell lysate containing scFv were extracted after induction for 6 hours.


Absolute Quantification of Drug Vector Delivery to the Cytosol

Macromolecular drugs inefficiently cross membranes to reach their cytosolic targets. They require drug delivery vectors to facilitate their translocation across the plasma membrane or escape from endosomes. Optimization of these vectors has however been hindered by the difficulty to accurately measure cytosolic arrival. We have developed an exceptionally sensitive and robust assay for the relative or absolute quantification of this step. The assay is based on benzylguanine and biotin modifications on a drug delivery vector of interest, which allow, respectively, for selective covalent capture in the cytosol with a SNAP-tag fusion protein and for quantification at picomolar sensitivity. The assay was validated by determining the absolute numbers of cytosolic molecules for two drug delivery vectors: the B-subunit of Shiga toxin and the cell-penetrating peptide TAT. We expect this assay to favor delivery vector optimization and the understanding of the enigmatic translocation process.

Biological macromolecules such as peptides, proteins or oligonucleotides hold great therapeutic potential. They enable indeed to target “undruggable” proteins which lack cavities for small molecule binding, or to stimulate the immune system by antigen cross-presentation. However, macromolecules do not readily cross membranes. Most remain trapped at the plasma membrane or in intracellular compartments and do not reach their targets in the cytosol. Cytosolic arrival, via direct translocation across the plasma membrane or endocytosis followed by endosomal escape, is currently one of the main bottlenecks for the development of new macromolecular therapeutics. 1-3

For the optimization of cytosolic delivery, the process must be quantified. 4 Existing assays for this have a number of limitations, including the failure to distinguish between cytosolic versus intraluminal localizations and a lack of sensitivity and robustness (Table S1). Of note, two recently developed assays, the Chloroalkane Penetration Assay 5 and the NanoClick assay 6 rely on the HaloTag protein, 7 which covalently reacts to chloroalkanes. The cytosolic localization of the HaloTag reporter protein ensures the cytosolic specificity of the assay. Both assays measure the non-reacted reporter protein fraction, which is inversely proportional to the extent of translocated molecules. This limits the assay sensitivity. Furthermore, these assays do not provide absolute quantification of translocated molecules. Therefore, the quantification of small amounts of molecules reaching the cytosol remains challenging.

The example of siRNAs for the downregulation of disease-related proteins might be chosen to illustrate this point. For an efficient therapeutical effect, it is estimated that 2000–4000 siRNA molecules need to reach the cytosol per cell. 8, 9 The sensitivity of a cytosolic arrival assay is thus essential to detect such low numbers of molecules per cell and to optimize existing or develop new delivery tools.

To address this challenge, we have designed the Cyto-SNAP assay. This assay is based on a cytosolic capture protein assembled from SNAP-tag and mNeonGreen. The SNAP-tag reacts covalently with the small molecule benzylguanine (BG). 10 A vector of interest (e.g., protein- or peptide-based drug delivery tools) modified with BG will react with the SNAP-tag only if the vector reaches the cytosol (Figure 1 a).

A robust, sensitive, and quantitative cytosolic arrival assay. a) Schematic representation of the Cyto-SNAP assay. Upon membrane translocation, the BG-modified vector encounters the cytosolic mNeonGreen-SNAP-tag protein with which it reacts covalently. mNeonGreen is exploited for immunoprecipitation on beads coated with anti-mNeonGreen nanobodies, and the biotin moiety for ELISA. b) Parental, polyclonal mNeonGreen expressing (NG) or monoclonal mNeonGreen-SNAP-tag expressing (NG-SNAP) HeLa cell lines were treated with fluorescent SNAP-tag ligand BG-647-SiR. SiR fluorescence was only observed on NG-SNAP cells, in which it was homogeneously distributed in the cytosolic space. c) Demonstration of the high efficiency of the SNAP-tag reaction. Lysate from NG-SNAP cells was incubated with excess benzylguanine–biotin (BG–biotin) ligand, followed by streptavidin pull-down. Western blotting analysis showed that the cell lysate was depleted of mNeonGreen-SNAP-tag protein, which was indeed recovered on beads. d) Demonstration that the mNeonGreen immunoprecipitation (IP) is complete. The mNeonGreen-SNAP-tag protein was totally recovered on mNeonGreen-Trap beads, which confirmed the efficacy of the immunoprecipitation. e) Sensitivity and linearity of the assay. Known amounts of STxB-BG-biotin conjugate C were added into NG-SNAP cell lysate, followed by incubation at 37 °C, mNeonGreen-SNAP-tag immunoprecipitation and ELISA development. The obtained standard curve was linear over a wide range of concentrations. Even low picomolar STxB-BG-biotin concentrations were robustly detected. f) Demonstration that non-reacted SNAP-tag protein is efficiently quenched before cell lysis. Intact NG-SNAP and NG cells were incubated for 30 min at 4 °C or 37 °C in presence or absence (Ø) of SNAP-Cell® Block reagent. The cells were then washed, lysed, and lysates were incubated at 4 °C with or without STxB-BG-biotin conjugate A. Both 37 °C and 4 °C block conditions gave ELISA signals comparable to background signal without STxB-BG-biotin incubation.

mNeonGreen, 11 the second part of the cytosolic capture protein, is used for high affinity immunoprecipitation on beads coated with anti-mNeonGreen nanobodies (low كد of 2 n m ). In this way, BG-tagged vector that reacts with the SNAP-tag of the cytosolic capture protein can be isolated. Finally, a biotin conjugated to the vector serves for quantification by ELISA (Figure S1).

We chose to validate the assay using two different vectors: i) Residues 47–57 from the HIV TAT protein, 12 which is one of the best-studied cell-penetrating peptides, and ii) the B-subunit of Shiga toxin (STxB), a vector for cancer cell targeting and immunotherapy. 13 After binding to its receptor, the glycosphingolipid Gb3, STxB is internalized and follows the retrograde transport route to the endoplasmic reticulum. STxB was shown to be able to translocate to the cytosol 14 and to efficiently deliver antigens for antigen cross-presentation, 13 making it an interesting model for a cytosolic arrival assay.

A monoclonal HeLa cell line, termed NG-SNAP, stably expressing the cytosolic mNeonGreen-SNAP-tag capture protein was generated for the assay. Diffuse mNeonGreen fluorescence and BG-fluorophore labeling were observed, which documented the expression of properly folded protein in the cytosol (Figure 1 b). To test whether the cytosolically localized mNeonGreen-SNAP-tag was fully functional, immunoprecipitation and pull-down experiments were performed against each of its two subunits: i) Lysates from NG-SNAP cells were incubated with an excess of BG–biotin, followed by streptavidin pull-down. This led to the complete depletion of mNeonGreen-SNAP-tag from the lysates, thereby proving that the SNAP-tag subunit was fully functional (Figure 1 c). ii) The same approach using anti-mNeonGreen nanobody beads also led to the depletion of mNeonGreen-SNAP-tag from the lysates, which further validated the functionality of the fusion protein (Figure 1 d). The combination of highly efficient SNAP-tag reaction and complete mNeonGreen immunoprecipitation laid the foundation for a fully quantitative assay.

Linearity and sensitivity are key parameters of a quantitative assay. To this end, low picomolar concentrations of BG- and biotin-tagged STxB were added to mNeonGreen-SNAP-tag-containing cell lysate, and incubated at 37 °C to allow for BG-SNAP-tag reaction. Subsequent mNeonGreen immunoprecipitation and ELISA development resulted in a linear standard curve, which documented the exquisite sensitivity of the assay (Figure 1 e).

Importantly, on cells, using a membrane-permeable BG-derivative, it was possible to quench non-reacted SNAP-tag prior to lysis (Figure 1 f). In the real assay format, this step is required to avoid post-lysis reaction between non-cytosolic BG-tagged vector and non-conjugated SNAP-tag in the lysate. Finally, STxB showed normal intracellular trafficking in NG-SNAP cells and in cells stably expressing mNeonGreen in the absence of SNAP-tag (termed NG cells), which were used as controls (Figure S2). All these findings qualified the engineered NG-SNAP and NG cell lines for the Cyto-SNAP assay.

The Cyto-SNAP assay (Figure S3) was first used to provide relative quantifications of cytosolic arrival between different conditions (incubation times, vector concentrations or inhibitor treatments). STxB (Figure 2 a,b) and TAT (Figure 2 g,h) translocation to the cytosol increased in a time- and concentration-dependent manner. For STxB, the translocation signal started to plateau at concentrations above 100 n m (Figure 2 b and S4a), while TAT translocation continued to increase exponentially beyond at least 20 μ m (Figure 2 h and S4b), suggesting that the process was receptor-independent for TAT, and receptor-dependent for STxB. Depletion of the STxB receptor, glycosphingolipid Gb3, by incubation of NG-SNAP cells with a glucosylceramide synthase inhibitor indeed reduced the cytosolic arrival of STxB to background level (Figure 2 c). Background was defined throughout all experiments as ELISA signal observed from NG cells. STxB translocation to the cytosol was also greatly impacted when incubations were performed at low temperatures, i.e., 4 °C or 19.5 °C (Figure 2 d). This observation was likely caused by changes in membrane organization leading to the disappearance of domain boundaries at which membranes are more permeable. 15, 16 In ATP depleted cells, STxB arrival in the cytosol was also strongly decreased (Figure 2 e). As for the 4 °C condition, endocytosis of STxB is inhibited in ATP-depleted cells. 17 Thus, it can be concluded that cellular entry is required for efficient translocation to the cytosol. The arrival of STxB in the cytosol was also found to be partially reduced when endosomal acidification was inhibited (Figure 2 f). Finally, TAT was compared to TAT-PEG6-GFWFG, previously reported to have an enhanced capacity to translocate to the cytosol. 18 We found no difference in cytosolic arrival at concentrations below 10 μ m (Figure 2 i). In contrast, TAT-PEG6-GFWFG translocated much more efficiently than TAT at concentrations above 15 μ m (Figure 2 i). TAT undergoes endocytosis at low concentrations, whereas at concentrations above 10 μ m direct translocation across the plasma membrane becomes the dominant mechanism (ref. 19 for a review, see ref. 20 ). It therefore appears likely that the strongly enhanced cytosolic arrival of TAT-PEG6-GFWFG at concentrations above 15 μ m resulted from direct translocation across the plasma membrane. These results qualified the Cyto-SNAP assay for membrane translocation measurements with different types of vectors.

Relative quantifications of STxB and TAT translocation to the cytosol, using the Cyto-SNAP assay on NG-SNAP cells. In all experiments, NG cells served as background controls. The cytosolic signal is expressed as percentage of the maximum signal obtained in each individual replicate experiment. a) Time dependency. Cells were incubated with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A for 0, 4, or 24 h (continuous incubation). The cytosolic signal increased with time. b) Concentration dependency. Cells were incubated for 4 h with STxB-BG-biotin conjugate A at the indicated concentrations. The cytosolic signal increased with concentration. c) Glycosphingolipid dependency. Cells were pre-treated or not for 5 days with the glycosylceramide synthase inhibitor Genz-123346, and then incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A. The translocation process to the cytosol was glycosphingolipid dependent. d) Temperature dependency. Cells were incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A at the indicated temperatures. Translocation to the cytosol was blocked at 4 °C and 19.5 °C. e) ATP dependency. Cells were incubated for 90 min with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A under ATP depletion conditions. Translocation to the cytosol was ATP dependent. f) Acidification dependency. Cells were incubated for 4 h with 40 n m STxB-BG-biotin conjugate A in the presence or absence of 100 n m of the V-ATPase inhibitor bafilomycin A1. Translocation to the cytosol was partly inhibited by bafilomycin A1 treatment. g) Time dependency of TAT translocation to the cytosol. Cells were incubated with 200 n m BG-biotin-TAT conjugate C for 0, 4, or 24 h (continuous incubation). The cytosolic signal increased with time. h) Concentration dependency of TAT translocation to the cytosol. Cells were incubated for 4 h with BG-biotin-TAT conjugate C at the indicated concentrations. The cytosolic signal increased with concentration. i) Comparison of TAT versus TAT-PEG6-GFWFG. NG-SNAP cells were incubated for 4 h at 37 °C with different concentrations of TAT or TAT-PEG6-GFWFG. Cytosolic signal is normalized to signal from 25 μ m TAT. TAT-PEG6-GFWFG has an increased cytosolic translocation capacity compared to TAT at concentrations above 15 μ m . Statistical analysis: two-tailed paired t-test * ص<0.05 ** ص<0.01 and *** ص<0.001.

For absolute quantification of cytosolic arrival, the conjugation of BG and biotin reporter moieties was optimized in order to achieve 1:1 molar ratios of both BG and biotin per vector (or per monomer in the case of homopentameric STxB). We synthesized several scaffolds, comprising each BG, biotin, and maleimide for conjugation to the vectors (Scheme 1 and Figure S5–7). All STxB-based conjugates showed intracellular retrograde trafficking to the Golgi, as for non-modified STxB (Figure S8). With increasing PEG linker sizes, STxB conjugates C and D showed higher ELISA signal intensity when added directly in cell lysate (Figure 3 a). This was likely due to reduced steric hindrance for streptavidin binding to biotin on STxB pentamer whose BG had already reacted with the SNAP-tag. The same effect was not observed on the monomeric TAT (Figure 3 b). In contrast, cytosolic arrival was reduced for both STxB and TAT with the increased PEG linker size of scaffold D (Figure 3 c,d). An effect of long PEG linkers on cytosolic arrival was previously reported for the cell-penetrating peptide TAT-PEG-GWWG: PEG12 or PEG18 diminished the translocation efficiency when compared to PEG6. 18 In order to balance sensitivity and translocation efficiency, we chose to work with the maleimide-BG-biotin scaffold C. The resulting STxB conjugate C had a membrane translocation capacity similar to conjugate A, for which BG and biotin were separately coupled to STxB.

Evaluation of the different STxB and TAT conjugates for the Cyto-SNAP assay. a,b) Comparison of the ELISA signal obtained with the different STxB and TAT conjugates directly added into cell lysate. 40 p m of each STxB conjugate or 100 p m of each TAT conjugate were added to NG-SNAP cell lysate and incubated for 1 h at 37 °C for the SNAP reaction to occur before mNeonGreen immunoprecipitation and ELISA development on beads. c,d) Comparison of cytosolic arrival signal from the different STxB conjugates (40 n m ) or TAT conjugates (200 n m ) after 4 h incubation at 37 °C with NG or NG-SNAP HeLa cells.

Different strategies used for biotin and BG conjugation to vectors a) Biconjugation method: Use of commercial NHS ester—BG for conjugation to amines of the vector, and maleimide-biotin for conjugation to thiol. b–d) Monoconjugation method: Synthesized maleimide-benzylguanine-biotin molecules for conjugation to thiol of the vector. Different PEG linker sizes were tested in order to avoid steric hindrance between vector, the BG reaction with the SNAP-tag, and streptavidin binding to the biotin moiety.

The choice of lysis conditions was also critical for quantification to ensure that vectors are extracted from membranes with which they may remain associated even after translocation to the cytosolic compartment (see ref. 14 for STxB). We used high salt concentrations and sonication as recommended for TAT extraction, 21 and optimized the choice of detergent to achieve complete STxB extraction (Figure S9a). These conditions remained fully compatible with the requirement for SNAP-tag reaction and immunoprecipitation (Figure S9b,c).

For absolute quantification, a standard curve is essential. For this, we have devised a simple approach (Figure S10): Known amounts of BG and biotin-tagged vector were mixed into NG-SNAP cell lysate, leading to complete reaction with the SNAP-tag protein of the lysate. As shown in Figure 1 e, low picomolar sensitivity was reached with this approach. Using the standard curve, the amount of vector translocated to the cytosol and the total amount of vector associated with NG-SNAP cells were then determined (Figure S10). For the total cell-associated amount, the SNAP-tag quenching step was omitted, such that BG and biotin-tagged vector molecules fully reacted with unquenched SNAP-tag in the cell lysate. Of note, immunoprecipitation and subsequent ELISA steps were performed for all samples in parallel under identical conditions such that absorbance readings could be compared directly.


Bacterial Conjugation Steps

In order to transfer the F-plasmid, a donor cell and a recipient cell must first establish contact. At this point, when the cells establish contact, the F-plasmid in the donor cell is a double-stranded DNA molecule that forms a circular structure. The following steps allow the transfer of the F-plasmid from one bacterial cell to another:

الخطوة 1

The F + (donor) cell produces the pilus, which is a structure that projects out of the cell and begins contact with an F – (recipient) cell.

الخطوة 2

The pilus enables direct contact between the donor and the recipient cells.

الخطوه 3

Because the F-plasmid consists of a double-stranded DNA molecule forming a circular structure, i.e., it is attached on both ends, an enzyme (relaxase, or relaxosome when it forms a complex with other proteins) nicks one of the two DNA strands of the F-plasmid and this strand (also called T-strand) is transferred to the recipient cell.

الخطوة 4


شاهد الفيديو: احياء مجهرية عملي 2 (شهر نوفمبر 2022).