معلومة

هل من الممكن فرز القطرات داخل مرحلة الزيت باستخدام FACS

هل من الممكن فرز القطرات داخل مرحلة الزيت باستخدام FACS


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

باختصار ، هل من الممكن لـ FACS عينة موجودة في الزيت بدلاً من المخزن المؤقت (محلول قائم على الماء)؟ سأكون ممتنا جدا أي مساعدة في هذا. شكرا لك


من المحتمل وجود آلة معدلة متخصصة يمكنها القيام بذلك ، لكن آلات قياس التدفق الخلوي التقليدية لا يمكنها القيام بذلك. تقترح هذه المقالة طريقة واحدة ممكنة:

لسوء الحظ ، لا تتوافق أدوات FACS مع المعلقات غير المائية ، لذلك لفرز مستحلب الماء في الزيت ، من الضروري إجراء استحلاب إضافي لإنتاج مستحلب مزدوج من الماء في الزيت في الماء. العينة الناتجة ، المشتتة الآن في طور مائي ، قابلة لفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية.

- واحد في المليون: فرز التدفق الخلوي لفحوصات أحادية الخلية في قطرات مستحلب مزدوج أحادي الانتشار Picolitre من أجل التطور الموجه

هناك أيضًا آلات ميكروفلويديكس قد تكون قادرة على القيام بذلك ، لكن أعتقد أنه سيتعين عليك بناء حل خاص بك بدلاً من أن تكون قادرًا على شراء حل (والذي سيكون مكلفًا على أي حال ، على ما أعتقد).


هل من الممكن فرز القطرات داخل مرحلة الزيت باستخدام FACS - علم الأحياء

معهد الكيمياء الفيزيائية ، الأكاديمية البولندية للعلوم ، Kasprzaka 44/52 ، 01-224 وارسو ، بولندا
بريد الالكتروني: [email protected]

(ب) معهد البيولوجيا الجزيئية والخلوية ، جامعة تارتو ، ريا 23 ، تارتو ، إستونيا

الملخص

ظهرت قطرات الموائع الدقيقة بسرعة كواحدة من التقنيات الرئيسية التي تفتح إمكانيات تجريبية جديدة في علم الأحياء الدقيقة. القدرة على توليد ومعالجة ومراقبة القطيرات التي تحمل خلايا مفردة أو مجموعات صغيرة من البكتيريا بطريقة متوازية للغاية وعالية الإنتاجية تخلق أساليب جديدة لحل المشكلات في التشخيص وللبحث حول التطور البكتيري. تقدم هذه المراجعة تطبيقات قطرات الموائع الدقيقة في مختلف مجالات علم الأحياء الدقيقة: 1) الكشف عن مسببات الأمراض وتحديدها ، 2) اختبار حساسية المضادات الحيوية ، 3) دراسات علم وظائف الأعضاء الميكروبية و 4) اختيار التكنولوجيا الحيوية وتحسين السلالات. ندرج أيضًا التحديات في مجال التطور الديناميكي والاستخدامات المحتملة الجديدة للقطرات في علم الأحياء الدقيقة.


خلفية

يتكون النسيج من العديد من أنواع الخلايا المتخصصة ، يمكن أن يكون لكل منها حالات بيولوجية مختلفة. بدلاً من دراسة التعبير الجيني العالمي للنسيج ككل ، فقد تم الاعتراف بأن التنميط النسخي بدقة خلية واحدة [1،2،3،4] يوفر وصفًا أكثر اكتمالاً ودقة لوظيفته البيولوجية [5 ، 6]. جعلت التطورات الحديثة في تقنيات الموائع الدقيقة المستندة إلى القطيرات من الممكن التقاط ملفات تعريف النسخ لآلاف الخلايا الفردية وفهرستها وتسلسلها بطريقة متوازية للغاية وفائقة السرعة وبأسعار معقولة [7 ، 8].

في طريقة "Drop-seq" التي وصفها Macosko et al. [7] ، يتم تغليف الخلايا بشكل منفصل في قطرات بحجم النانو مع حبة واحدة في جهاز ميكروفلويديك. توفر حبة واحدة بادئات مشفرة ، يحتوي كل منها على مقبض تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، ورمز شريطي للخلية وعدد كبير من المعرفات الجزيئية الفريدة المختلفة (UMIs) ، متبوعة بتسلسل متعدد. يتم تعليق الحبيبات في محلول تحلل ، مما يؤدي إلى تحلل الخلية عند تكوين القطيرات. يتم إطلاق RNAs الرسول الخلوي (mRNAs) ويمكن تهجينه مع تسلسل polyT من بادئات حبة الباركود. بعد الجمع ، يتم كسر القطرات وعكس الرنا المرسال إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) ، وتضخيمه وتسلسله بكميات كبيرة. يسمح لنا التحليل الحسابي أن نحدد بوضوح أي جزيئات mRNA تنشأ من نفس الخلية عن طريق الرمز الشريطي للخلية. تُستخدم UMIs لتحديد وإزالة تكرارات PCR ولإحصاء جزيئات mRNA المتميزة رقميًا.

على الرغم من الارتفاع السريع في أساليب تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية عالية الإنتاجية (RNA-seq) ، بما في ذلك الإصدارات التجارية من المنصات الآلية مثل Fluidigm C1 أو 10XGenomics أو 1CellBiO ، فقد تم إيلاء القليل من الاهتمام نسبيًا للقيود التي تحتاج إلى يمكن التغلب عليها في إعداد وتداول مواد الإدخال الخلوية [9]. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في الحصول على معلومات ذات مغزى في استخدام تعليق أحادي الخلية عالي الجودة والذي يعكس بشكل مناسب حالة النسخ لكل خلية داخل بيئتها الطبيعية أو المقصودة من الناحية التجريبية. تعتبر الخطوات بين حصاد الخلايا من الثقافة أو بعد تفكك الأنسجة وعزل الخلايا المفردة والتقاط mRNA حاسمة بشكل خاص لأنها عرضة لإدخال تغييرات النسخ وتدهور الحمض النووي الريبي. تمثل المتطلبات مثل الحاجة إلى تجميع خلايا من عدة أنسجة أو ظروف استزراع ، مع إمكانية دمجها مع تجارب الدورة الزمنية ، قيدًا إضافيًا.

من حيث المبدأ ، يمكن معالجة العديد من هذه المشكلات بمساعدة التثبيت الكيميائي. على عكس الألدهيدات ، فإن الميثانول والإيثانول عبارة عن مثبتات تخثر لا تعدل كيميائيًا الأحماض النووية [10 ، 11]. تعمل الكحوليات عن طريق التجفاف: في نسبة تزيد عن 65٪ من الكحول وفي وجود الأملاح ، تظهر الأحماض النووية في حالة انهيار يمكن إعادتها إلى شكلها الأصلي عن طريق معالجة بسيطة للإماهة. لقد أظهرنا سابقًا أن التثبيت بنسبة 80٪ من الميثانول متوافق مع تسلسل الجيل التالي وإعداد المكتبة لكل من mRNAs و RNAs الصغيرة [12]. كان التثبيت مطلوبًا بشكل حاسم من أجل التنميط الناجح للتعبير الجيني على مستوى الجينوم لمرحلة مفرزة من خلية إلى أربع خلايا أنواع معينة انيقة الأجنة ، نسيج معقد يخضع لتغيرات نسخية سريعة وديناميكية [12].

هنا ، قمنا بتكييف بروتوكول التثبيت القائم على الميثانول من Stoeckius et al. [12] للحفاظ على الخلايا من أجل التنميط اللاحق للنسخة أحادية الخلية عن طريق Drop-seq. قمنا أولاً بتحليل كل من الخلائط الحية والثابتة للخلايا البشرية المستزرعة (HEK) والفأر (3T3) لإثبات أن تثبيت الميثانول لا يغير عدد الجينات والنصوص (المُعرَّفة على أنها عدد UMIs) التي تم اكتشافها لكل خلية أو تتداخل مع تعيين لا لبس فيه من يقرأ لنوع واحد أو آخر. ثم طبقنا تثبيت الميثانول على تحليل على نطاق أوسع لـ

9000 خلية أولية من مفككة ذبابة الفاكهة الأجنة أو خلايا الدماغ المؤخر للفأر المصنفة. نوضح أن التنميط المتسلسل المتسلسل للنصوص أحادية الخلية مع الخلايا الثابتة الميثانول يؤدي أداءً جيدًا مع كل من الخلايا المستنبتة والأولية.

بالإضافة إلى ذلك ، نحن نقدم موردًا حسابيًا لتسهيل استكشاف بيانات تسلسل الخلية المفردة المستندة إلى القطيرات. يمكن استخدام "Dropbead" بسهولة لتصور الإحصائيات الأساسية والمعلمات الكمية ، ومقارنة العينات المختلفة وعينات التصفية قبل التحليل اللاحق.


نتائج

يعد 3dPCR أحد أقارب ddPCR الشائع ، باستثناء أنه بدلاً من إجراء فحوصات PCR أحادية الجزيء في قطرات مستحلب واحد من الماء في الزيت ، فإنه يقوم بالتفاعلات في قطرات مستحلب مزدوج. وتتمثل فائدة ذلك في أن المستحلبات المزدوجة ، على عكس المستحلبات المفردة ، يتم تعليقها في طور ناقل مائي ، مما يسمح بقراءتها وفرزها باستخدام أدوات قياس التدفق الخلوي الشائعة 23. باستخدام تفاعلات PCR محددة يتم إجراؤها في كل قطرة ، يتم "قراءة" كل جزيء في العينة في موقع معين لتحديد ما إذا كان جزيءًا مستهدفًا. إذا كان الأمر كذلك ، فإن اختبار PCR ينتج عنه إشارة فلورية تملأ القطرة المغلفة ، مما يسمح باكتشافها واستعادتها عن طريق فرز FACS. باستخدام TaqMan PCR مع مجسات ذات لون مختلف ، يمكن مضاعفة الطريقة ، للتمييز بين الجزيئات التي تشترك في التماثل الجزئي والفرز بناءً على القواعد التوافقية ، مثل جزيء معين يحتوي على تسلسلين محددين.

الهدف من 3dPCR هو تمكين الكشف عن جزيئات DNA المحددة وتقديرها وعزلها في عينة غير متجانسة. لإنجاز ذلك ، يقوم برنامج 3dPCR بتغليف الحمض النووي من عينة في قطرات مستحلب مزدوجة (الشكل 1 أ) ويؤدي تفاعل PCR محددًا في كل قطرة استجواب للتسلسلات المستهدفة (الشكل 1 ب). في حالة وجود التسلسلات ، يحدث تضخيم PCR ، مما يؤدي إلى توليد إشارة الفلورسنت التي يمكن اكتشافها على FACS (الشكل 1 ج) واستخدامها لفرز واستعادة متواليات الهدف (الشكل 1 د). يمكن تجميع القطرات المصنفة وتحليلها كمزيج أو توزيعها منفردة في الآبار. بينما نستخدم تقنيات PCR القياسية لاكتشاف التضخيم ، مع مضان SYBR أو TaqMan كقراءة ، فإن التفاعلات والقراءات الأخرى قابلة للتطبيق ، بما في ذلك التضخيم متساوي الحرارة (MDA ، LAMP ، RPA) والمجسات (المنارات الجزيئية ، مجسات العقرب).

يتم تغليف عينة غير متجانسة من الحمض النووي في قطرات مستحلب مزدوج موائع دقيقة (أ) والتدوير الحراري (ب). تخضع القطرات التي تحتوي على التسلسل المستهدف للتضخيم ، مما ينتج عنه إشارة فلورية يمكن اكتشافها على نظام مراقبة الأصول الميدانية (FACS) (ج) وتستخدم في القياس والفرز (د).

مستحلبات مزدوجة 3dPCR

أصبح نظام 3dPCR ممكنًا بفضل قدرة أجهزة ميكروفلويديك على تكوين قطرات أحادية الانتشار من عينة تحتوي على خليط من جزيئات الحمض النووي. من خلال التحكم في تركيز الجزيئات في العينة ، يمكن ضبط العدد المغلف في كل قطرة على جزيئات مفردة 24. من الأهمية بمكان استخدام المستحلبات المزدوجة للكشف عن PCR للجزيئات المستهدفة هو تثبيت القطرات من خلال تفاعلات التدوير الحراري. في هذا العمل ، نحقق ذلك باستخدام زيوت مفلورة مع خافض للتوتر السطحي الفلوري بسبب الثبات المذهل للمستحلبات التي تشكلها ، بما في ذلك درجات الحرارة المرتفعة لـ PCR. نستخدم اثنين من المواد الخافضة للتوتر السطحي اعتمادًا على اختبار PCR الذي يتم إجراؤه في القطرات: مادة خافض للتوتر السطحي من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) Krytox ، وخافض التوتر السطحي الأيوني Krytox (الشكل 2).

نحن نشكل مستحلبات مزدوجة موائع دقيقة ، والتي يتم تثبيتها إما بواسطة PEG-Krytox غير الأيوني (أ) أو الفاعل بالسطح الأيوني كريتوكس (ب). كلاهما ينتج قطرات ثابتة للغاية تنجو من التدوير الحراري. ومع ذلك ، تنتفخ القطرات أثناء ركوب الدراجات لموازنة الأسمولية للقلب الداخلي للقطرة مع الناقل المائي القابل للامتزاج (ج) (ما قبل = مركز التدوير قبل الحراري = ركوب الدراجات الحرارية اللاحقة Vأ = حجم الطور المائي للمستحلب المزدوج Vا = حجم طور الزيت للمستحلب المزدوج).

تشتمل المادة الخافضة للتوتر السطحي غير الأيونية على مجموعة رأس PEG مرتبطة تساهميًا بذيول من البوليمر المشترك ذي الكتلة المفلورة ، حيث يكون PEG قابلًا للذوبان في الماء ، بينما الذيل المفلور قابل للذوبان في المرحلة الزيتية لمستحلباتنا 25. عندما يمتص هذا الجزيء البرمائي على واجهة زيت الماء لقطرة ، فإن مجموعة رأس PEG تقوم بتغطية السطح الداخلي لقطرة الماء. PEG فعال في منع امتصاص البروتينات للواجهات الكارهة للماء ، وهو أمر مهم للحفاظ على الإنزيمات في الجزء الأكبر من القطرة ، حيث يمكنها تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل. لاكتشاف نواتج التضخيم للتفاعلات ، نضيف صبغة SYBR Green إلى المرحلة الحاملة بعد التضخيم. يصبح SYBR Green الفلوريسنت عندما يقحم في DNA 26 وينقسم بسهولة من خلال غلاف الزيت الرقيق للمستحلبات المزدوجة ، مما يؤدي إلى تلطيخ القطرات الإيجابية وجعلها قابلة للاكتشاف عبر FACS. تكون المستحلبات المزدوجة المتكونة مع هذا الفاعل بالسطح أحادية التشتت وتعيش دورة PCR الحرارية (الشكل 2 أ).

في حين أن الفاعل بالسطح غير الأيوني يوفر ثباتًا جيدًا ويتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل الفعال في المستحلبات المزدوجة ، فإن الأصداف تتسرب إلى جزيئات الصبغ بالفعل ، ونحن نستغل هذا لتلطيخ القطرات الإيجابية مع دورة ما بعد الحرارة SYBR. ومع ذلك ، فإن هذا التسرب يخلق أيضًا تحديًا عند إجراء TaqMan PCR في القطيرات: يستخدم التفاعل مجسات الحمض النووي المسمى بصبغة الفلورسنت والمخمد عند التضخيم ، ويتم شق المسبار لتحرير الصبغة لتتألق. ومع ذلك ، يمكن أن تنقسم الصبغة غير المربوطة بسهولة من خلال غلاف المستحلب المزدوج ، مما يؤدي إلى التسرب من القطرات مما يؤدي إلى فقدان إشارة TaqMan.

لإنقاذ الإشارة ، يجب علينا احتواء الصبغة ، والتي نحققها من خلال إدخال حاجز لتقسيمها عبر الغلاف. ننتقل إلى الفاعل بالسطح الأيوني Krytox والذي ، على عكس خافض التوتر السطحي PEG ، يمتص البروتينات بسهولة إلى واجهة القطرة 25. عادة ما يكون هذا ضارًا بـ PCR ، حيث أنه سيمتص البوليميراز ، لكننا نضيف أيضًا ألبومين مصل البقر (BSA) في القطرة بتركيز عالٍ. غالبًا ما يتم إضافة مساحة سطح الجسم إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل لزيادة كفاءة التفاعل 27 ، ولأنه بروتين ، يتم امتصاصه بسهولة في واجهة القطرات المستقرة الأيونية-كريتوكس 28،29،30. في الواجهة ، يشكل "جلدًا" يمنع المزيد من امتصاص البروتينات ويوفر حاجزًا لتقسيم جزيئات الصبغة المحررة 30. هذا يجعل قطرات TaqMan الإيجابية قابلة للاكتشاف على نظام مراقبة الأصول الميدانية. يشكل هذا الفاعل بالسطح أيضًا قطرات مستحلب مزدوجة أحادية الانتثار مستقرة للدورة الحرارية (الشكل 2 ب).

تتضخم قطرات المستحلب المزدوج ، بغض النظر عن المادة الخافضة للتوتر السطحي المستخدمة ، أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (الشكل 2 ج). نعتقد أن هذا يرجع إلى تقسيم الماء والجزيئات العازلة عبر الأصداف ، لموازنة الأسمولية للمراحل المائية الداخلية والخارجية. لذلك يجب مراعاة نفاذية الغلاف بعناية عند إجراء تفاعلات في قطرات مستحلب مزدوج ، ولكنها توفر أيضًا وسيلة سهلة لتعديل محتويات القطرات عن طريق إضافة مركبات إلى المرحلة الحاملة.

أحادي اللون ثلاثي الأبعاد مع قراءات SYBR

يمكن استخدام 3dPCR ، مثل ddPCR ، لحساب جزيئات الحمض النووي المستهدفة في خليط غير متجانس. لإثبات ذلك ، نقوم بتحليل عينات من فيروس Lambda بتركيزات مختلفة (الشكل 3). قمنا بتحويل الحمض النووي لـ Lambda إلى مزيج PCR باستخدام البادئات التي تستهدف جزءًا من جينوم Lambda (35،515–35،664 bp). نقوم بعمل استحلاب مزدوج ودورة حرارية للعينة ، ثم نضيف SYBR إلى المرحلة الحاملة لتلطيخ القطرات الإيجابية (الشكل 3 أ). لتحليل

5 ملايين قطرة مستحلب مزدوج ، نستخدم مقياس التدفق الخلوي. المستحلبات المزدوجة أحادية الانتشار وكبيرة مقارنة بالخلايا (

40 ميكرومتر) وبالتالي تظهر كسحابة ضيقة بكثافة عالية في قنوات الانتثار الأمامية والجانبية (الشكل 3 ب ، اليسار). يظهر الحطام في أحداث التشتت المنخفض وقطرات الزيت الناتجة عن تمزق المستحلبات المزدوجة كتوزيع لأحداث التشتت الجانبي المنخفض والعالي إلى الأمام. يتم أحيانًا إنتاج مستحلبات مزدوجة كبيرة ومتعددة النواة بواسطة صانع قطرة موائع جزيئية وتظهر كمجموعة ضيقة نسبيًا وعالية جدًا وتنتشر جانبيًا وأماميًا. استنادًا إلى أعداد الأحداث الخاصة بمجموعات الانتثار الجانبي والأمامي ، نجا حوالي 75٪ من التدوير الحراري واكتشاف نظام مراقبة الأصول الميدانية. لتحليل مجتمع المستحلب المزدوج أحادي النواة ، نقوم ببوابة السحابة المقابلة في قنوات الانتثار (الدائرة الحمراء) ، ورسم مضان هذه المجموعة السكانية الفرعية (الشكل 3 ب ، حق). نلاحظ مجموعتين من السكان في قناة الفلورة ، واحدة خافتة تقابل قطرات سلبية خالية من الهدف ، ومجموعة ساطعة تقابل القطرات التي تحتوي على الهدف. لقياس التركيز المستهدف في العينة ، نحسب نسبة القطرات الخافتة والساطعة ، مع التطبيع بالحجم لتحويلها إلى وحدات تركيز. نجري هذا التحليل على ست عينات متفاوتة في تركيز فيروس Lambda حسب

5 أوامر من حيث الحجم ووجد أنه ، كما هو متوقع ، يتناسب جزء القطرات الساطعة مع تركيز الإدخال (الشكل 3 ج).

يتم خلط الحمض النووي لفيروس لامدا مع مواد أولية تستهدف الفيروس وكواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتشكيلها في مستحلبات مزدوجة ، يتم تدويرها حرارياً ، وملطخة باللون الأخضر SYBR (أ). تتم معالجة القطرات من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية (FACS) ، مع وجود بوابات للتشتت للتخلص من جميع أحداث المستحلب المزدوج غير أحادية النواة ، والتي يتم رسم الباقي لها لقيم التألق (ب). تمت معالجة ست عينات بتركيزات مختلفة من فيروس Lambda وتحديد كميتها ، مما يدل ، كما هو متوقع ، على أن نسبة قطرات الفلورسنت تتناسب مع تركيز إدخال فيروس Lambda ، وفقًا لإحصائيات تغليف Poisson (ج).

مضاعفة 3dPCR مع قراءات TaqMan

يزيد TaqMan PCR من خصوصية PCR التقليدي باستخدام مسبار TaqMan لتوليد قراءات التألق. فقط إذا كانت منتجات التضخيم متطابقة مع تسلسل مسبار TaqMan ، فسيتم إنشاء إشارة الفلورسنت ، مما يقلل الإيجابيات الخاطئة بسبب التضخيم غير المحدد 31. يتيح TaqMan PCR أيضًا مضاعفة التفاعل باستخدام أصباغ ذات ألوان مختلفة لتسمية المجسات ، لاستجواب تسلسل الحمض النووي المتعدد في العينة في وقت واحد. وهذا يسمح لنا ، على سبيل المثال ، بالتمييز بين القطرات التي تحتوي على تسلسل واحد وتلك التي تحتوي على تسلسلات متعددة. لتوضيح ذلك ، قمنا بزيادة جينومات فيروس Lambda في عينة من جينومات فيروس ΦX174 ، مع تغيير تركيز فيروس Lambda على مدار

5 أوامر من حيث الحجم مع الحفاظ على ثبات ΦX174. نقوم بتحليل العينة باستخدام 3dPCR باستخدام مقايسات TaqMan التي تستهدف Lambda (صبغة خضراء) وفيروس ΦX174 (صبغة حمراء) (الشكل 4 أ). يتم تغليف جينومات Lambda و ΦX174 بشكل عشوائي في القطرات ، بحيث نتوقع أربع مجموعات ، قطرات خالية من كلا الهدفين (خافت) ، بهدف واحد (أخضر نقي أو أحمر) ، وكلا الهدفين (أصفر).

يتم خلط الحمض النووي لفيروسات Lambda- و ϕX174 معًا ودمجهما مع البادئات والتحقيقات TaqMan التي تستهدف كلا الفيروسين. تتشكل العينات في مستحلبات مزدوجة وتدوير حراري (أ). تتم معالجة القطرات من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية (FACS) ، مع وجود بوابات للتشتت للتخلص من جميع أحداث المستحلب المزدوج غير أحادية النواة ، والتي يتم رسم الباقي لها لقيم التألق (ب). تمت ملاحظة أربعة مجموعات من الفلورسنت ، تتوافق مع المجموعات الأربعة المحتملة لتغليف فيروس لامدا و ϕX174. تتم معالجة ست عينات بتركيزات مختلفة من فيروس Lambda مع ظروف فيروس ϕX174 ثابتة ، وتحديد كميتها ، مما يدل على أنه ، كما هو متوقع ، لم تتغير نسبة القطرات الموجبة ϕX174 بين العينات ، ولكن تلك الخاصة بمقاييس فيروس Lambda مع تركيز الإدخال ، وفقًا لـ Poisson إحصائيات التغليف (منحنى متقطع) (ج).

نقوم بتحليل القطرات باستخدام FACS ونقوم مرة أخرى ببوابة السكان المبعثر المقابل للمستحلبات المزدوجة (الشكل 4 ب ، اليسار). نرسم التألق الأحمر والأخضر لهذه المجموعة السكانية الفرعية ونلاحظ المجموعات الأربع المتوقعة (الشكل 4 ب ، حق). نظرًا لأن مقايسات TaqMan تنتج إشارات "ثنائية" تتجمع فيها القطرات الإيجابية معًا ولا تتداخل مع القطرات السلبية ، فإن عدد الأحداث المكتشفة في كل مجموعة غير حساس للموضع الدقيق لحدود البوابة. تمامًا كما هو الحال مع تجربة اللون الواحد ، يمكن استخدام نسبة القطرات الإيجابية والسلبية الواقعة ضمن مجموعات سكانية مختلفة لتقدير تركيزات الجينومات الفيروسية المختلفة في العينة المختلطة ، على مدى ديناميكي واسع (الشكل 4 ج). يوضح هذا أن 3dPCR مع قراءة TaqMan يمكن أن تحدد كمية أنواع متعددة من الحمض النووي في عينة في وقت واحد. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بتحديد الحالات المحددة التي يوجد فيها هدفان مختلفان داخل نفس القطرة (القطرات الصفراء ، الشكل 4 أ). هذا غير ممكن مع qPCR التقليدي وهو مفيد لربط التسلسلات المختلفة معًا ، على سبيل المثال ، لتوصيف أطوال جزيئات الحمض النووي استنادًا إلى وجود التسلسلات على مسافات محددة من بعضها البعض 32،33 لتوصيف أحداث إعادة التركيب بناءً على وجود مجموعات متسلسلة مختلفة داخل جزيء واحد 34 ، ولتمييز الارتباطات التوليفية للجزيئات المتميزة داخل نفس الكيان ، مثل الحمض النووي للفيروسات ذات الجينوم المقسم 35 ، 36 أو احتمال إصابة أحد مسببات الأمراض بمضيف معين. عادةً ما تكون مثل هذه الارتباطات قابلة للقياس فقط من خلال تسلسل الحمض النووي ، ولكن يوفر 3dPCR بديلاً سريعًا وغير مكلف

فرز جزيئات الحمض النووي المفردة باستخدام FACS

يسمح برنامج 3dPCR لأداة FACS "بقراءة" تسلسل الحمض النووي المستهدف باستخدام اختبار PCR. ومع ذلك ، فإن نظام مراقبة الأصول الميدانية قادر على أكثر من الاكتشاف ، بل يمكنه أيضًا الفرز بناءً على القياس.يسمح هذا ، في جوهره ، باستجواب مجموعة مختلطة من جزيئات الحمض النووي بشكل فردي ، لاستعادة جميع الجزيئات المطابقة لمعيار اختبار PCR ، كما يوفر طريقة جديدة لإثراء الحمض النووي الذي يوفر مزايا كبيرة على الطرق التقليدية القائمة على PCR المشترك أو التقاط oligo. لإثبات هذه القدرة ، نقوم بفرز عينات الحمض النووي باستخدام 3dPCR. نحن نرفع الحمض النووي لفيروس لامدا إلى خلفية S. cerevisiae الحمض النووي الجيني ، وفرز العينة باستخدام مجسات TaqMan التي تستهدف Lambda (الشكل 5 أ ، اليسار). قطرات المستحلب المزدوجة المصنفة إيجابية TaqMan ، على الرغم من وجود العديد من قطرات الزيت (الشكل 5 أ ، حق). قطرات الزيت هي بقايا مستحلبات مزدوجة تنفجر أثناء اكتشاف نظام مراقبة الأصول الميدانية ، وتمزقها معدلات القص الناتجة عن تباعد تدفق الغلاف والقوى الناتجة عن الفرز. بناءً على أحجام السكان المبعثرة وتصوير القطرات المصنفة ، نقدر

40٪ من المستحلبات المزدوجة تعيش من خلال خطوات PCR و FACS. يمكن التخفيف من تمزق المستحلب المزدوج أثناء نظام مراقبة الأصول الميدانية عن طريق تقليل حجم المستحلب المزدوج ، وزيادة حجم فوهة نظام مراقبة الأصول الميدانية ، ومعالجة القطرات بشكل أبطأ.

تم تطوير Lambda DNA S. cerevisiae الحمض النووي الجيني بتركيز 1: 100 ، ومعالجته من خلال (أ) 3dPCR (يسار) و FACS (يمين). تنبثق بعض المستحلبات المزدوجة أثناء FACS ، تاركة وراءها قطرات زيت صغيرة في المجموعة المصنفة. نحدد كمية التخصيب باستخدام qPCR مع الاشعال التي تستهدف منطقة من S. cerevisiae الجينوم ومنطقة مختلفة من جينوم Lambda تم تضخيمها في تفاعل 3dPCR. بناءً على تحولات المنحنى ، نقدر أن نسبة Lambda-to-S. cerevisiae يزيد الحمض النووي بنسبة 83 ضعفًا عن طريق الفرز (ب). يتم تراكب Brightfield و fluorescence في هذه الصور.

لتأكيد الإثراء الذي تم تحقيقه عن طريق فرز المستحلبات المزدوجة ، نستخدم qPCR ، وتحليل العينات المصنفة وغير المصنفة باستخدام بادئات تستهدف منطقة مختلفة من جينوم Lambda ومنطقة من S. cerevisiae الجينوم (الشكل 5 ب). تتضخم بادئات فيروس Lambda بشكل أسرع قليلاً في الفرز من العينة غير المصنفة (الشكل 5 ب ، أعلى) ، على الرغم من أن الكمية الإجمالية للحمض النووي هي نفسها ، مما يشير إلى أن الفرز يزيد من عدد جينومات فيروس لامدا. على العكس من ذلك ، فإن S. cerevisiae تتضخم الاشعال في وقت لاحق في الفرز مقارنة بالعينة غير المصنفة ، مما يشير إلى ذلك S. cerevisiae تم إلغاء تخصيب الحمض النووي بشدة عن طريق الفرز (الشكل 5 ب ، أسفل). بناءً على تحولات منحنى qPCR ، فإننا نقدر نسبة Lambda إلى-S. cerevisiae لقد تغير الحمض النووي بعامل 83 ، وهذا قريب من التوقعات النظرية القائمة على تغليف بواسون للجزيئات لمعدل تحميلنا بنسبة 1٪ من قطرات لامدا الإيجابية. يمكن تحقيق نسب تخصيب أعلى عن طريق تخفيف العينة بشكل أكبر ، وتقليل كمية S. cerevisiae ومع ذلك ، فإن الحمض النووي المغلف في القطرات الإيجابية يقلل أيضًا من تكرار القطرات الإيجابية ، مما يستلزم مزيدًا من الفرز لاستعادة نفس العدد من الأحداث الإيجابية. يوضح هذا أن 3dPCR هي وسيلة فعالة لفرز الحمض النووي المستهدف من عينة مختلطة باستخدام FACS.

توزيع حجم الحمض النووي المصنف

تتمثل ميزة 3dPCR على طرق تخصيب الحمض النووي الأخرى في أنه يسمح باستعادة الجزيئات وطول gt100 Kbp باستخدام فقط

100 نقطة أساس من تسلسل تحديد TaqMan. لتوضيح ذلك ، نقيس أطوال الجزيئات التي تم اكتشافها واستعادتها عبر 3dPCR بمقايسة متعددة الإرسال. نقوم بتضمين كل قطيرة حمراء (Cy5) وخضراء (FAM) تحقيقات TaqMan التي تستهدف كروموسوم الخميرة الرابع عشر على مسافات محددة من بعضها البعض. إذا كانت القطرة تحتوي على جزيء DNA أقصر من مسافة الفصل بين المجسات ، فستكون القطرات إما حمراء أو خضراء نقية (الشكل 6 أ ، على اليسار). ومع ذلك ، إذا كان الجزء أطول من مسافة الفصل ، فقد تكون القطرة موجبة مزدوجة (صفراء) ، مما يسمح لنا بتقدير جزء الجزيئات في العينة التي تزيد عن طول الفصل عن طريق حساب عدد الأحادي أو المزدوج. الأحداث الإيجابية عبر قياس التدفق الخلوي (الشكل 6 أ ، يمين). من خلال تكرار التجربة لأزواج المسبار الأحمر والأخضر عند زيادة الفصل (الشكل 6 ب) ، يمكننا تقدير توزيع طول الجزيئات في العينة.

S. cervisiae (الخميرة) الحمض النووي الجيني مغلف في مستحلبات مزدوجة مع مجموعات التمهيدي / المسبار Cy5 ومجموعة التمهيدي / المسبار FAM (أ). يتم فصل مجموعات التمهيدي / المسبار بمقدار 10 Kbp إلى 500 Kbp على طول جينوم الخميرة (ب). بعد التدوير الحراري ، يتم تصوير القطرات (ج) وشدة التألق مقاسة بقياس التدفق الخلوي. مع زيادة المسافة بين المجسات ، يتناقص جزء القطرات الموجبة المزدوجة ، مما يشير إلى أن الجزيئات الطويلة أكثر ندرة من الجزيئات القصيرة بسبب تفتت الحمض النووي (د). لتأكيد ذلك ، نقوم بفرز الحمض النووي باستخدام مسبار FAM واحد واستجواب طول الجزيء باستخدام qPCR (ه) مع مجسات ثانوية على مسافات متزايدة من مسبار الفرز (F). بعد ركوب الدراجات الحرارية ، تظهر قطيرات موجبة متفرقة (ز) التي يتم استردادها وتحليلها (ح). يؤكد الفرز باستخدام qPCR النتائج المضاعفة التي توضح أن الجزيئات الطويلة أكثر ندرة من الجزيئات القصيرة ، لكن الجزيئات التي تصل إلى 500 كيلو بايت في العينة موجودة في العينة. يمكن استرداد هذه الجزيئات عن طريق الفرز باستخدام مقايسة TaqMan متعددة الإرسال التي تستهدف طرفي هذه المنطقة.

بعد التدوير الحراري ، تحصل القطرات على مضان يعتمد على عدد التسلسلات المستهدفة التي تحتوي عليها ، كما هو موضح بالصورة التمثيلية في الشكل 6 ج. بتكرار هذا لجميع أزواج المجسات ، نجد أن جزء الإيجابيات المزدوجة يتناسب عكسياً مع مسافة الفصل بين المجسات (الشكل 6 د). يشير هذا إلى وجود جزيئات طويلة ، لكنها أكثر ندرة من الجزيئات القصيرة. بناءً على كسور 3dPCR ، نقدر أن 3 ٪ من الجزيئات يبلغ طولها 100 كيلو بايت.

كتأكيد إضافي لأطوال الجزيئات التي تم الحصول عليها بواسطة 3dPCR ، نقوم بإجراء تجربة نستخدم فيها مسبارًا واحدًا لاكتشاف كروموسوم الخميرة الرابع عشر ، و FACS لاستعادة هذه الجزيئات ، والتي يتم استجوابها بعد ذلك عبر qPCR (الشكل 6 هـ). يتركز مسبار الكشف في الموضع 550 كيلو بايت على كروموسوم الخميرة الرابع عشر ، بحيث تكون معظم الجزيئات المستردة ضمن الموضع 500-600 كيلو بايت. لتأكيد ذلك ، قمنا بإنشاء أربع مجموعات مسبار qPCR في مواضع مختلفة على كروموسوم الخميرة الرابع عشر (الشكل 6f). يتم تغليف الحمض النووي الجيني للخميرة في مستحلبات مزدوجة وتدوير حراري ، مما ينتج عنه حالات من القطرات الإيجابية (الشكل 6 جم). نوجه الأداة لاستعادة هذه القطرات ، واستخراج قوالب الحمض النووي وتحليلها باستخدام qPCR (الشكل 6 ح). وجدنا أن مجموعات المسبار القريبة من مسبار الكشف تتضخم في دورات منخفضة بينما تتضخم المجموعات البعيدة في دورات عالية (الشكل 6 ساعات ، داخلي) ، مما يشير إلى أن الأجزاء القصيرة أكثر انتشارًا من الأجزاء الطويلة في العينة التي تم فرزها. باستخدام بيانات qPCR ، نقدر عدد جزيئات القالب الموجودة في العينة بطول معين بناءً على قيمة عتبة متقاطعة لتتبع PCR ونجد مرة أخرى أن الجزيئات الطويلة أكثر ندرة من الجزيئات القصيرة ولكن هذا جزء مهم من الجزيئات الطويلة موجودة ، حتى 500 كيلو بايت. هذا يؤكد نتائج تجربتنا المتعددة. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح نظام 3dPCR باستعادة الجزيئات التي يزيد طولها عن الهدف عن طريق الفرز باستخدام عدة مجسات TaqMan مفصولة بهذا الطول ، مما يسمح باستعادة القوالب التي يبلغ طولها مئات من الكيلوبات.


الجزء الثاني: السلوك السائل متعدد الأطوار للنواة

00: 00: 15.09 مرحبًا.
00: 00: 16.21 اسمي كليف برانجوين من جامعة برينستون و HHMI ،
00: 00: 19.20 ويسعدني أن أخبركم بذلك
00: 00: 22.24 بعض العمل على سلوك السائل متعدد الأطوار
00: 00: 25.18 من النواة.
00: 00: 27.09 لذا ، كنا نناقش هذه الأجسام النووية الخالية من الأغشية
00: 00: 32.04 في المحاضرة الأولى ،
00: 00: 33.21 وأنا مهتم بشكل خاص بهذه الأنواع من الهياكل ،
00: 00: 37.13 هذه المكثفات ضمن سياق نواة الخلايا.
00: 00: 43.13 من المهم أن تضع في اعتبارك ذلك
00: 00: 45.22 نواة. من الخلية.
00: 00: 47.10 هذا هو مقر الجينوم ،
00: 00: 49.11 وجميع المنظمات التي تحدث
00: 00: 51.20 داخل النواة بالكامل في حالة غياب
00: 00: 54.09 من أي منظمة تشبه الحويصلة مرتبطة بالغشاء.
00: 00: 59.17 إذن ، هذه الأجسام النووية الخالية من الأغشية
00: 01: 02.18 هي بالفعل هياكل رئيسية
00: 01: 05.26 لتنظيم محتويات النواة
00: 01: 07.19 وتنظيم الجينوم والتعبير الجيني.
00: 01: 09.18 وهي تشتمل على هياكل مثل النوى التي ستكون محور هذا الحديث
00: 01: 13.07 أشياء أخرى مثل النسخ.
00: 01: 15.29 مصانع النسخ هذه التي تنظم
00: 01: 18.21 التعبير عن الجينات الفردية
00: 01: 21.15 هيئات PML هذه ، والتي تلعب أيضًا أدوارًا
00:01: 23.29 في تدفق المعلومات الجينية
00: 01: 25.18 أو أجسام Cajal و Snurposomes ،
00: 01: 28.11 تشارك في التضفير ، مرة أخرى ، في تنظيم الجينات.
00: 01: 30.27 لذا ، نود أن نحاول أن نفهم
00: 01: 33.26 كيف تتشكل هذه الهياكل وما الدور الذي تلعبه
00: 01: 36.28 في التعبير الجيني وتنظيم الجينوم.
00: 01: 40.26 إذن ، نواة أو نواة.
00: 01: 44.24 وجمعها نواة.
00: 01: 47.12 هذه هياكل رائعة حقًا.
00: 01: 48.26 لقد عُرفوا منذ أكثر من 150 عامًا.
00: 01: 51.26 إنها من أول الأشياء التي رآها علماء الميكروسكوب الأوائل
00: 01: 54.18 عندما نظروا إلى الخلايا ،
00: 01: 56.23 على سبيل المثال الخلايا البشرية مثل خلايا هيلا هذه.
00: 02: 01.24 إذن ، النواة مظلمة.
00: 02: 04.12 انسداد داكن كبير داخل النواة
00: 02: 06.21 من هذه الخلايا الفردية.
00: 02: 09.01 تفكيرهم مثير للاهتمام حقًا
00: 02: 12.29 هذا التدفق للمعلومات الجينية من DNA إلى RNA إلى البروتين
00: 02: 16.21 لأنهم جالسون في المواقع
00: 02: 19.18 حيث يوجد نسخ نشط لجينات RNA الريبوسوم.
00: 02: 23.19 لذا ، فهي مهمة حقًا لنسخ الحمض النووي الريبي الريبوزومي ،
00: 02: 27.15 والريبوسوم هو الآلة التي تصنع البروتين بالفعل ،
00: 02: 30.05 في النهاية ، في السيتوبلازم ،
00: 02: 32.06 لذا فهي مهمة أيضًا لهذه الخطوة من RNA إلى البروتين.
00: 02: 35.17 وهكذا ، الطريقة التي نفكر بها حول النواة
00: 02: 38.08 هل هذا هو هذا المكثف بدون غشاء
00: 02: 40.29 يساعد في التيسير
00: 02: 43.22 التفاعلات العديدة المطلوبة
00: 02: 46.18 لمعالجة نسخ الحمض النووي الريبي الريبوزومية
00: 02: 49.16 لتشكيل هذه الجسيمات المسبقة الناضجة في النهاية
00: 02: 54.23 وفي النهاية الريبوسوم ، آلة نقل البروتين هذه.
00: 02: 59.13 لذا ، بدأنا بالتفكير في النواة ، كما تعلم ،
00: 03: 04.07 مباشرة بعد الدراسات الأولية التي أجريناها على حبيبات P.
00: 03: 06.09 التي أخبرتك عنها في الحديث الأخير.
00: 03: 08.05 النواة.
00: 03: 11.11 كما تعلم ، مثل هذا المكثف الخالي من الغشاء الكبير ،
00: 03: 13.03 كنا نتساءل عما إذا كان الأمر كذلك.
00: 03: 15.26 إذا كان يمكن اعتباره ، كما تعلم ، على أنه تجميع سائل مفصول بالطور
00: 03: 18.25 في الخلايا.
00: 03: 20.23 إذن ، باحث ما بعد الدكتوراة في مختبري ، ستيف ويبر ،
00: 03: 22.21 وهو الآن عضو هيئة تدريس في جامعة ماكجيل ،
00: 03: 25.20 بدأ في معالجة هذا السؤال باستخدام C elegans كنظام نموذجي.
00: 03: 28.21 وهذا الفيلم يعرض دورات التجميع والتفكيك
00: 03: 32.28 للنواة الفردية
00: 03: 36.04 داخل جنين C ايليجانس النامي.
00: 03: 39.07 وما تراه هو البروتينات النووية
00: 03: 42.06 تتكثف خارج النواة
00: 03: 44.21 في العديد من هذه القطرات ،
00: 03: 46.25 ثم حل نهائيًا حول الموقعين في C elegans
00: 03: 50.15 حيث يتم نسخ الحمض النووي الريبي بشكل نشط.
00: 03: 53.28 وهكذا ، اعمل من Steph
00: 03: 56.19 بالإضافة إلى شركائنا ميكو هاتاجا وجويل بيري ،
00: 03: 59.22 أدى إلى رسم الخرائط حيث تمكنا من إظهار ذلك
00: 04: 05.22 ديناميكيات تجميع النواة هي.
00: 04: 08.22 يمكن وصفها جيدًا باستخدام
00: 04: 13.00 النظريات الكلاسيكية لفصل الطور ،
00: 04: 15.09 على وجه الخصوص شكليات Cahn-Hilliard هذه ،
00: 04: 17.16 وهو نوع من أ. طريقة في الوصف ،
00: 04: 20.19 ما هو الانتشار الشاق.
00: 04: 22.26 مطلوب لفصل الطور
00: 04: 25.04 للتغلب نوعًا ما على هذا التأثير الحتمي الذي تحدثنا عنه
00: 04: 28.12 في المحاضرة الأخيرة.
00: 04: 29.24 لذا ، فإن النوى ، كما تعلم ،
00: 04: 32.27 نوع من السائل المتكثف.
00: 04: 38.03 وفي الحقيقة ، الدراسة الأولى التي أجريناها كانت في نظام بويضة الضفدع
00: 04: 39.28 لإلقاء نظرة على هذه النوى
00: 04: 42.04 والبدء في طرح هذه الأنواع من الأسئلة
00: 04: 44.19 حول ماهيتها كأشياء بيوفيزيائية
00: 04: 46.24 وكيفية التفكير في تجميعها وهيكلها وما إلى ذلك.
00: 04: 51.01 Xenopus laevis هو نظام قوي حقًا.
00: 04: 55.01 إنها أ. انه. تشكل بويضة أو بيضة ،
00: 04: 58.28 جاهز للتخصيب. متي.
00: 05: 02.25 إنه كبير جدًا. إذاً ، حجمها يقارب الملليمتر.
00: 05: 06.12 يحتوي على نواة كبيرة واحدة كبيرة أيضًا -
00: 05: 10.15 يبلغ قطرها حوالي 600 ميكرون.
00: 05: 12.22 وداخل هذه النواة الكبيرة ،
00: 05: 15.15 هناك العديد
00: 05: 17.19 - في الواقع مئات أو ما يصل إلى ألف -
00: 05: 19.15 نوى ، والتي يمكنك رؤيتها في هذه القطيرات الفردية.
00: 05: 22.12 هياكل ذات مظهر قطيرات بداخلها.
00: 05: 25.09 وهكذا ، كان هذا نظامًا قويًا بالنسبة لنا
00: 05: 28.03 لأنه يمكننا حقًا البدء في استجواب هذه الخصائص الفيزيائية الحيوية
00: 05: 31.28 داخل هذه النواة الكبيرة التي تحتوي على العديد من النوى.
00: 05: 36.03 وما أظهرناه هو أن هذه النوى.
00: 05: 38.04 عندما نجمعهم معًا ، يندمجون
00: 05: 40.09 إذا بدأنا في تفكيكها ،
00: 05: 42.16 سيخضعون بالفعل لأحداث تمزق الجسر السائل ،
00: 05: 44.14 الذي تراه في هذا الفيلم.
00: 05: 46.07 وهذا سمح لنا بالبدء في القياس
00: 05: 49.03 الخصائص واللزوجة والتوتر السطحي ،
00: 05: 51.24 من هذه الهياكل لتظهر حقًا أنها تشبه السوائل ،
00: 05: 55.11 ولكن هناك تطور مثير للاهتمام في هذا ،
00: 05: 57.14 وهي هذه السيولة وهذه السيولة ،
00: 06: 00.14 يعتمد على العمليات البيولوجية غير المتوازنة
00: 06: 05.19 تحدث في جميع أنحاء الخلية.
00: 06: 08.29 وهذا يوضح أننا إذا كنا.
00: 06: 11.13 إذا استنفدنا خلية ATP ،
00: 06: 14.02 وهو نوع من بطارية الخلية ،
00: 06: 16.01 ثم اللزوجة الظاهرية لهذه الهياكل
00: 06: 18.25 يرتفع بشكل ملحوظ.
00: 06: 20.26 إذن ، يبدو أن هناك سمات ديناميكيات عدم التوازن
00: 06: 23.24 التي تنظم سيولة هذه الهياكل ،
00: 06: 26.06 ونحن. لهذا نشير إليها بالسوائل النشطة ،
00: 06: 28.16 نوع من سائل متكثف نشط.
00: 06: 32.03 انطلاقا من روح طرح أبسط سؤال
00: 06: 35.02 يمكننا التفكير فيه عند بدء بحثنا ،
00: 06: 39.05 هنا طرحنا السؤال ،
00: 06: 41.00 إذا كانت هذه السوائل حقًا.
00: 06: 45.00 إذا كانت هذه عبارة عن مكثفات سائلة داخل نواة هذا الضفدع.
00: 06: 50.08 من بويضة الضفدع هذه ،
00: 06: 53.23 فلماذا لا يندمجون جميعًا في هيكل واحد أكبر؟
00: 06: 57.06 لماذا تبقى كقطيرات مميزة ،
00: 06: 59.23 عندما أظهرت ذلك إذا. كما تعلم ، إذا قمنا بدفعهم معًا ،
00: 07: 02.12 يبدو أنهم يندمجون بسهولة؟
00: 07: 04.00 إذن ، لماذا لا يندمجون جميعًا في قطرة واحدة كبيرة؟
00: 07: 06.08 وهذا هو. هذا. من الواضح أنه سؤال بسيط للغاية ،
00: 07: 10.14 وأعتقد أنه قوي ، وقد قادنا إلى بعض الطرق المثيرة للاهتمام.
00: 07: 14.15 لذا ، في محاولة للإجابة على هذا السؤال ،
00: 07: 18.09 أريد أن أقدم لكم بعض الأفكار الأساسية للغاية
00: 07: 20.24 مهمة في العديد من مجالات بيولوجيا الخلية.
00: 07: 24.08 من المهم التفكير فيها.
00: 07: 27.02 لذلك ، تم وصف الحركة البراونية لأول مرة
00: 07: 30.24 لروبرت براون في هذا الفيلم الكلاسيكي حقًا
00: 07: 33.20 ورق ممتع للغاية وموصى به للغاية
00: 07: 36.09 من 1828.
00: 07: 38.08 إذن ، في هذه الورقة يصف الحركة العشوائية لجزيئات حبوب اللقاح
00: 07: 44.05 وأنواع أخرى من الجسيمات داخل الخلية ،
00: 07: 46.11 والطريقة التي يمرون بها بشكل عشوائي
00: 07: 49.29 عند عرضها بالمجهر.
00: 07: 52.24 الورقة رائعة حقًا لعدد من الأسباب.
00: 07: 55.05 من الواضح أن أحدهم يشعر بخيبة أمل كبيرة
00: 07: 57.13 عندما يكتشف أن الحركة التي يراها هي.
00: 08: 02.07 ليس له أي علاقة بالحياة ،
00: 08: 04.28 بمعنى أنه حتى ، كما تعلم ،
00: 08: 07.13 قطع الكوارتز المطحونة وغيرها من المواد الميتة
00: 08: 10.21 تخضع للحركة البراونية.
00: 08: 12.19 وهكذا ، كان منزعجًا جدًا من ذلك.
00: 08: 14.11 بالطبع ، إنه مضحك الآن ،
00: 08: 17.03 لأننا ندرك الآن أن هذا مفهوم أساسي تمامًا
00: 08: 19.21 هذا مهم ليس فقط للمواد غير الحية
00: 08: 22.02 ولكن أيضًا داخل الخلية.
00: 08: 25.09 وهكذا ، هؤلاء.
00: 08: 28.03 هذا فيلم من الجسيمات التي تمر بهذه الحركة البراونية ،
00: 08: 32.01 هذه التقلبات الحرارية العشوائية
00: 08: 34.16 داخل محلول من الماء.
00: 08: 37.27 وهكذا ، الفكرة هنا هي أن الطاقة العشوائية هي.
00: 08: 43.00 يمكن للمرء أن يفكر في الأمر على أنه.
00: 08: 45.21 كيلوطن من الطاقة ، مقياس الطاقة الحرارية الذي تحدثنا عنه من قبل ،
00: 08: 48.06 يدور حول هذه الجسيمات
00: 08: 51.04 وجعلهم يخضعون بشكل عشوائي. نزهة عشوائية.
00: 08: 53.28 الآن ، هناك بعض الميزات الرياضية المثيرة للاهتمام
00: 08: 56.24 للطريقة التي يعمل بها هذا
00: 08: 59.02 أود أن ألفت انتباهكم.
00: 09: 00.25 أولاً ، تختلف الحركة البراونية عن الحركة الموجهة.
00: 09: 05.01 إذن ، الحركة الموجهة هي. إذا كنت تمشي في خط مستقيم
00: 09: 08.02 أو إذا كنت تقود السيارة ،
00: 09: 10.23 كما تعلم ، على طريق سريع مستقيم
00: 09: 12.29 وأنت تقود سيارتك فقط.
00: 09: 15.01 لذا ، في الحركة الموجهة ، يمكننا التفكير.
00: 09: 18.00 إذا كنا نتحرك بسرعة أو سرعة ثابتة ،
00: 09: 20.24 إذا كنا. إذا ذهبنا لضعف مقدار الوقت ،
00: 09: 25.29 ثم قطعنا ضعف المسافة.
00: 09: 28.15 هذا النوع من المعنى -
00: 09: 31.01 كما تعلم ، تجلس في السيارة ضعف المدة ، وتتحرك بنفس السرعة ،
00: 09: 33.20 لقد ذهبت مرتين.
00: 09: 35.14 وهكذا ، إذا سألتك عن مربع هذه الكمية
00: 09: 38.11 - ما هو مربع الإزاحة؟ -
00: 09: 41.04 ثم سأقول ، حسنًا ، لقد قمت فقط بتربيع جانبي هذه المعادلة ،
00: 09: 45.02 ولدي عامل أولي على شكل v
00: 09: 47.02 وبعد ذلك لدي الوقت ،
00: 09: 49.00 وهذا منطقي تمامًا.
00: 09: 50.25 لذا ، إذا كنت ، كما تعلم ، انتظر مرتين ،
00: 09: 53.04 ثم يجب أن يكون مربع المسافة.
00: 09: 55.06 كما تعلم ، يجب أن يكون أكبر بأربعة أضعاف.
00: 09: 58.23 الآن ، الشيء المثير للاهتمام هو الحركة المنتشرة
00: 10: 01.07 مربع المسافة هو.
00: 10: 03.04 لا يشبه مربع الوقت ،
00: 10: 05.04 لكنها تسير بشكل خطي مع الوقت.
00: 10: 07.23 إذن ، هذا مثير جدًا للاهتمام.
00: 10: 10.03 إذا انتظرت مرتين ، فلن أفعل.
00: 10: 12.01 كما تعلم ، هذه الكمية ، دلتا س تربيع ،
00: 10: 15.00 ليس عاملًا لأربعة أكبر.
00: 10: 17.10 إنها فقط عامل أكبر من اثنين.
00: 10: 19.22 وهكذا ، فإن العامل المبدئي هنا يسمى معامل الانتشار.
00: 10: 22.21 إنها تشبه السرعة ، لكنها مختلفة قليلًا.
00: 10: 27.04 لها وحدات مختلفة.
00: 10: 30.01 بشكل عام ، هذه الفكرة ،
00: 10: 32.08 أن الحركة الموجهة لها الامتداد. الوسائل.
00: 10: 35.16 الإزاحة المتوسطة التربيعية ، دلتا س تربيع تسير مثل مربع الوقت ،
00: 10: 38.28 مقابل الحركة المنتشرة ، حيث تسير مثل الوقت.
00: 10: 42.14 يمكن أن يكون لديك شيء بينهما في بعض الحالات.
00: 10: 44.12 لذلك ، بشكل عام نكتب مربع الإزاحة
00: 10: 48.08 يذهب مثل الوقت لبعض القوة ، ألفا ،
00: 10: 50.22 الذي سنسميه الأس الانتشار.
00: 10: 53.07 إذن ، ما نفعله غالبًا هو تصوير الأفلام
00: 10: 55.23 مثل تلك التي رأيتها هنا مع الخرز
00: 10: 57.21 ثم ارسم مربع الإزاحة -
00: 11: 00.01 يعني إزاحة مربعة ، أو MSD -
00: 11: 02.13 في مخطط السجل هذا. مؤامرة السجل ،
00: 11: 05.19 والميل إذن هو الأس المنتشر.
00: 11: 08.21 لذا يمكنك أن ترى. هذه في الواقع بيانات من فيلم
00: 11: 11.16 تمامًا مثل ذلك هنا ،
00: 11: 13.16 ويمكنك أن ترى أن متوسط ​​الإزاحة التربيعية
00: 11: 15.24 خطي كدالة للوقت على مخطط السجل ،
00: 11: 18.10 وهذا يشير إلى أن الأس الانتشار هو 1 ،
00: 11: 20.27 وهو بالضبط ما نتوقعه لـ.
00: 11: 22.25 كما تعلم ، لوصف بسيط للانتشار البراوني.
00: 11: 26.01 لذا ، من المهم أن تضع هذه الأفكار في الاعتبار
00: 11: 28.04 فيما سأخبرك به بعد ذلك
00: 11: 30.25 لأن ما حاولنا القيام به في هذا النظام
00: 11: 33.21 في معالجة السؤال
00: 11: 37.01 لماذا لا تندمج كل هذه القطرات مع بعضها البعض
00: 11: 40.02 سألنا ، هل يمكننا إدخال جسيمات المسبار
00: 11: 43.16 في نواة هذه الخلية واسأل ،
00: 11: 46.04 هل هم أحرار في التحرك؟
00: 11: 48.00 لذا ، كتحقيقات صغيرة للبيئة ،
00: 11: 50.08 شيء مثل القطرات ،
00: 11: 52.22 وسؤالهم عما إذا كانوا أحرارًا في التنقل.
00: 11: 55.26 هذا نسميه علم الأحياء الدقيقة.
00: 11: 57.14 هذا مصطلح. الريولوجيا هي دراسة سلوك التدفق والتشوه في المواد.
00: 12: 03.21 علم الأحياء الدقيقة هو ذلك ، فقط على نطاق مجهري.
00: 12: 05.25 إذن ، طالب دراسات عليا موهوب حقًا في مختبري ،
00: 12: 07.24 وهو الآن باحث ما بعد الدكتوراة في المعاهد الوطنية للصحة ، مارينا فيريك ،
00: 12: 10.13 حقن جسيمات مسبار صغيرة في النواة.
00: 12: 14.14 حسنًا ، هذه حبات صغيرة خاملة ،
00: 12: 17.15 حبات مجهرية ،
00: 12: 19.14 حقنت في النواة ،
00: 12: 21.28 وسئل ، هل هذه الخرزات حرة في الانتشار أم لا؟
00: 12: 23.24 هل هم مقيدون بطريقة ما؟
00: 12: 25.26 وهكذا ، ما وجدته مارينا هو.
00: 12: 28.07 كما تعلم ، في الدراسات الأولية ، قالت ،
00: 12: 30.23 حسنًا ، في الواقع لا تبدو مقيدة بشكل خاص.
00: 12: 32.19 إذا وضعت جزيئات صغيرة جدًا.
00: 12: 34.11 هذه حبات 0.2 ميكرون / 200 نانومتر
00: 12: 37.11 حقنت في هذه النواة ، هذا GV ، أو الحويصلة الجرثومية ،
00: 12: 40.10 ما وجدته هو أن الخرزات تبدو في الواقع
00: 12: 44.08 الرقص والقيام بما يشبه الحركة البراونية.
00: 12: 47.02 لذا ، يبدو أنهم يتمتعون بحرية كبيرة في التحرك.
00: 12: 48.28 كان ذلك مفاجئًا في البداية.
00: 12: 51.06 قلنا ، حسنًا ، إذا كان هذا يحدث ، فلماذا لا يحدث ذلك.
00: 12: 53.25 كما تعلم ، تنتشر هذه المكثفات السائلة أيضًا؟
00: 12: 57.15 وقلنا ، حسنًا ، لنلقِ نظرة على حبات مختلفة الأحجام
00: 13: 00.08 واسأل عما يحدث.
00: 13: 02.23 لذا ، مرة أخرى ، في.
00: 13: 05.12 إذا رسمت متوسط ​​الإزاحة التربيعية لهذه الخرزات الصغيرة جدًا ،
00: 13: 07.10 تمامًا مثل ما عرضته عليك من قبل ،
00: 13: 09.16 ترى أن هناك هذا الاعتماد الخطي على الوقت ،
00: 13: 12.05 لذا فإن الأس المنتشر هنا سأسميه 1.
00: 13: 14.17 ولكن عندما ننتقل إلى أحجام حبة أكبر وأكبر ،
00: 13: 18.11 ما تراه هو أن الأس ينخفض.
00: 13: 20.07 إذن ، منحدر المنحنى ينخفض ​​وينخفض.
00: 13: 24.22 وهكذا ، يبدو أن هناك قيودًا متزايدة
00: 13: 27.16 على حركة الجسيمات
00: 13: 30.04 عندما نصل إلى أحجام جسيمات أكبر وأكبر.
00: 13: 31.26 ويمكنك أن ترى ذلك هنا في موقع آثار الخرز.
00: 13: 35.29 حبات الخرز الصغيرة نوعًا ما تخضع لحركة براونية ،
00: 13: 39.00 الانتشار حولها.
00: 13: 40.14 وتصل إلى الجزيئات الأكبر ،
00: 13: 42.01 نرى هذا التقطع ، حيث يبدو أنهم يقفزون ،
00: 13: 43.24 ربما بين المسام ، إذا أردت ،
00: 13: 45.14 وبعد ذلك بدأت الجسيمات الأكبر في التقيد بشدة
00: 13: 49.19 داخل النواة.
00: 13: 51.16 وهكذا ، إذا قمت برسم ميل تلك المنحنيات ،
00: 13: 54.15 هذا الأس المنتشر ،
00: 13: 56.27 كدالة لحجم الجسيمات ،
00: 13: 58.25 أرى هذا المسار واضحًا جدًا.
00: 14: 03.08 إذن ، ينتقل من الأس المنتشر بالقرب من 1 ،
00: 14: 05.06 قريب من الانتشار البسيط ، للجزيئات الصغيرة ،
00: 14: 08.07 ولكن للجزيئات الأكبر حجمًا ينخفض ​​، لذا.
00: 14: 11.10 مرة أخرى ، بما يتفق مع نوع من القيود المفروضة على حركة الجسيمات
00: 14: 16.23 بمجرد أن تصبح أكبر من حجم معين ،
00: 14: 17.16 والتي ، كما تعلم ، تشبه بضع مئات من النانومترات / 0.2 ميكرون.
00: 14: 23.01 لذا ، بدأنا بالتفكير في هذا.
00: 14: 26.09 لذا ، يبدو أن الجسيمات مقيدة
00: 14: 29.00 بواسطة بعض الشبكات التي لها مقياس حجم
00: 14: 32.15 أي بضع مئات من النانومترات.
00: 14: 34.20 في الواقع ، البيانات التي حصلنا عليها في هذا.
00: 14: 37.05 في هذا النظام يشبه كثيرًا بعض البيانات
00: 14: 39.17 التي رآها أشخاص آخرون عند النظر إلى حركة خرزة مماثلة
00: 14: 43.27 في الشبكات المنقاة
00: 14: 46.24 التي أعيد تكوينها من بروتين أكتين
00: 14: 50.09 والخيوط التي يتكون منها الأكتين.
00: 14: 52.01 لذلك ، يشكل الأكتين هذه الشبكات الخيطية الجميلة.
00: 14: 54.19 وإذا وضعت جسيمات هناك ، فقد رأيت بالفعل نفس النوع من الأشياء ،
00: 14: 58.04 حيث إذا كانت الجسيمات كبيرة مقارنة
00: 15: 02.05 لمتوسط ​​التباعد بين الخيوط ،
00: 15: 05.15 ثم تكون الحركة مقيدة للغاية
00: 15: 07.11 - يمكنكم رؤية ذلك هنا بهذا اللون الأسود.
00: 15: 09.23 هذا المنحنى الأسود في الأسفل -
00: 15: 11.17 وإذا كانت الجسيمات أصغر بكثير
00: 15: 14.03 من متوسط ​​حجم الشبكة للشبكة ،
00: 15: 16.09 إذن لديك شيء يشبه الحركة المنتشرة ،
00: 15: 18.22 كما ترون في هذا المنحنى العلوي.
00: 15: 23.05 نرى أيضًا في هذه البيانات التقطع
00: 15: 25.23 للتنقل بين الدول المختلفة.
00: 15: 27.24 لذا ، بدأنا نتساءل ، حسنًا ،
00: 15: 30.11 ربما توجد شبكة هيكل خلوي مثل الأكتين
00: 15: 34.14 داخل النواة.
00: 15: 36.04 وهذا سيكون مفاجئًا بعض الشيء ، على الرغم من ذلك ،
00: 15: 38.29 لأن الأكتين معروف جيدًا في السيتوبلازم
00: 15: 41.05 ولكن لا يُعتقد عادةً أنها مهمة جدًا من الناحية الهيكلية داخل النواة.
00: 15: 45.21 وهكذا ، بدأنا نتساءل عن ذلك.
00: 15: 47.28 هل من الممكن أن تكون حركة هذه الخرزات
00: 15: 49.19 مقيد بنوع من الشبكة
00: 15: 53.14 - ربما حتى شبكة أكتين نووية -
00: 15: 56.08 ضمن هذا. داخل هذه النواة؟
00: 15: 58.15 وهكذا ، فإن الصورة ،
00: 16: 01.02 يعني أن الخرزات الصغيرة قادرة على الحركة نوعًا ما
00: 16: 04.02 في الفجوات ، لكن الخرزات الكبيرة نوعًا ما محصورة داخل هذه الشبكة.
00: 16: 07.05 لذا ، حاولنا اختبار هذه الفكرة.
00: 16: 09.24 وكانت التجربة الرئيسية حينها ،
00: 16: 12.18 حسنًا ، دعونا نحاول إفساد شبكة الأكتين
00: 16: 15.12 وانظر ماذا يحدث لحركة هذه الخرزات.
00: 16: 17.26 وهكذا ، قمنا بهذه التجربة ،
00: 16: 20.08 وإذا كان هذا جمهورًا مباشرًا ، فقد أسأل الجمهور ،
00: 16: 23.14 كما تعلم ، ماذا تتوقع.
00: 16: 25.28 إذن ، ماذا تتوقع؟ يمكنك التفكير للحظة.
00: 16: 29.04 إذا كنت تستمع إلى الشرائح القليلة الماضية ،
00: 16: 31.01 إذًا ستقول ، حسنًا ، الأس المنتشر
00: 16: 33.16 يجب أن تكون 1 إذا كان الانتشار بسيطًا.
00: 16: 35.22 إذاً ، إذا كانت شبكة أكتين
00: 16: 37.27 وكنت سأفكك شبكة الأكتين ،
00: 16: 40.07 إذن يجب أن يرتفع هذا المنحنى إلى 1.
00: 16: 43.02 يجب أن تكون كل هذه النقاط حول الأس المنتشر 1.
00: 16: 46.06 إذن ، لقد أجرينا هذه التجربة.
00: 16: 49.09 اتضح أن هناك عددًا من الطرق التي يمكننا تعطيلها
00: 16: 52.20 شبكة أكتين ، وقد جربناها جميعًا.
00: 16: 55.23 وما رأيناه دائمًا كان في جميع الحالات
00: 17: 00.03 أظهرت حركة الخرزة الآن أسًا منتشرًا
00: 17: 03.16 يتوافق مع الانتشار البسيط
00: 17: 06.03 في حالة عدم وجود أي قيد مرن.
00: 17: 09.18 حسنًا ، كل الخرزات الآن ،
00: 17: 10.21 كانوا قادرين على الانتشار بحرية داخل هذه النواة.
00: 17: 14.22 حسنًا ، يبدو حقًا أن هناك شبكة أكتين نووية
00: 17: 19.07 التي تشكل دعامة داخل هذه النواة.
00: 17: 22.27 الآن ، كان هذا كله لدراسة الميكانيكا والهيكل
00: 17: 27.19 باستخدام جسيمات المسبار هذه.
00: 17: 29.15 السؤال الرئيسي الحقيقي في هذه المرحلة هو ،
00: 17: 31.08 ماذا عن قطيرات بروتين الرنا؟
00: 17: 34.09 ماذا عن هذه المكثفات النووية
00: 17: 39.16 التي تجلس داخل شبكة الأكتين هذه؟
00: 17: 41.15 وبالمناسبة ، هذه صورة تمنحك رؤية رائعة للشبكة.
00: 17: 43.21 قد تقول ، حسنًا ، لماذا لم ننظر فقط إلى تلك الصورة
00: 17: 45.29 في المقام الأول؟
00: 17: 47.19 والسبب في ذلك هو وجود بعض الجدل
00: 17: 49.23 حول كيفية تصور المرء لهذا ،
00: 17: 52.03 وهل هذا يمثل حقًا الشبكة.
00: 17: 55.29 لكن هذا صحيح. هذا ما تبدو عليه الشبكة ،
00: 17: 58.11 وهذا يتوافق مع جميع البيانات التي عرضتها عليكم للتو.
00: 18: 00.21 إذن ، لدينا هذه القطرات ، هذه النوى ،
00: 18: 03.01 القطرات الحمراء الموجودة داخل هذه الشبكة ،
00:18: 07.06 و. أنت تعرف.
00:18: 10.29 ومن الواضح أنها مقيدة داخل الشبكة.
00: 18: 13.21 إذن ، السؤال الذي كان لدينا حينها كان ،
00: 18: 16.07 حسنًا ، ماذا يحدث لهذه الهياكل
00: 18: 18.23 عندما نعطل الأكتين؟
00: 18: 20.27 إذن ، ماذا يحدث للنواة؟
00: 18: 22.28 وهكذا ، قمنا بتجربة حيث تعطلنا
00: 18: 27.05 شبكة الأكتين هذه ثم نظرت ، وليس إلى الخرز ،
00: 18: 29.27 ولكن الآن في النوى ، والتي تم تمييزها باللون الأخضر هنا.
00: 18: 32.03 وأعتقد أن شيئًا رائعًا حدث ،
00: 18: 34.17 أننا. الذي كنا مفتونين به حقًا.
00: 18: 36.12 لذلك ، غالبًا ما كنا ننظر إلى هذه العينات
00: 18: 38.26 في المجهر ،
00: 18: 40.26 حيث ننظر إلى الأسفل ونعرض أفلامًا ننظر إلى الأسفل.
00: 18: 44.20 تُسقط الكاميرا عبر مستوى مثل هذا.
00: 18: 48.05 لكن ما قررنا فعله هو النظر من الجانب ،
00: 18: 50.06 لذلك تمكنا من إنشاء أكوام من هذه الصور
00: 18: 53.04 وانظر من الجانب.
00: 18: 55.10 وهذا فيلم ، إذا نظرنا إليه.
00: 18: 57.02 من الجانب عند حدوث ما يحدث
00: 18: 59.07 عندما نعطل شبكة الأكتين هذه.
00: 19: 01.04 وسأريكم أنها رائعة جدًا.
00: 19: 03.15 ما يحدث هو النواة داخل هذه النواة
00: 19: 08.03 كلها تنهار إلى قاع النواة ،
00: 19: 10.13 يبدو أنه يترسب تحت قوى الجاذبية.
00: 19: 15.02 حسنًا ، هذا مثير للدهشة حقًا ، إذن ، ومثير للاهتمام ،
00: 19: 17.29 لأننا عادة ما نفكر في الجاذبية على أنها لا تذكر
00: 19: 20.18 داخل الخلايا الحية.
00: 19: 22.23 لكن في هذه الحالة ، من الواضح أن هذا ليس صحيحًا.
00: 19: 25.05 لذلك ، يبدو أن شبكة الأكتين تثبت هذه النوى في مكانها ،
00: 19: 30.03 وعندما نتخلص منها جميعًا ينهارون إلى الأسفل.
00: 19: 32.19 لذلك ، كان ذلك مفاجئًا لنا حقًا.
00: 19: 34.22 وهكذا ، فهي أيضًا. إنه مثير للاهتمام أيضًا.
00: 19: 39.11 إذا كنت. إذا تركت النظام لفترة طويلة بما فيه الكفاية ،
00: 19: 42.12 هذه النوى ، عندما تنهار إلى الأسفل ،
00: 19: 44.27 يتحدون جميعًا في ما أنا.
00: 19: 48.00 ما قد يكون أكبر نواة في العالم.
00: 19: 50.21 هذا الهيكل الآن ، كما تعلمون ،
00: 19: 54.11 قطرها 100+ ميكرون.
00: 19: 57.12 إنها أكبر من العديد من الخلايا الفردية.
00: 20: 00.03 وهكذا ، فإن كل القطرات النووية قد اندمجت في الأسفل
00: 20: 03.14 عندما عطلنا شبكة الأكتين.
00: 20: 05.27 إذن ، ما سبب أهمية الجاذبية؟
00: 20: 09.03 كما تعلم ، لماذا نتجاهل عادة الجاذبية في الخلايا ،
00: 20: 11.21 لكن في هذه الحالة يبدو أنه مهم؟
00: 20: 14.22 إذن ، اتضح أن فيزياء هذا
00: 20: 18.09 مثير للاهتمام حقًا.
00: 20: 20.01 إذن ، هناك شيء يسمى مقياس طول الجاذبية.
00: 20: 22.05 إنها تأتي بأسماء مختلفة
00: 20: 25.00 يشير بعض الناس إلى رقم الجاذبية.
00: 20: 27.21 يعكس التنافس بين الجاذبية والتقلبات الحرارية العشوائية
00: 20: 30.20 تريد ذلك. تريد ترتيب مواقع هذه الجسيمات بشكل عشوائي.
00: 20: 35.27 هذا تأثير إنتروبيا ،
00: 20: 38.14 التي ستتذكرها من المحاضرة الأولى ،
00: 20: 40.08 حيث الانتروبيا.
00: 20: 42.13 كما تعلمون ، مقياس الطاقة الحرارية هذا ، kT ،
00: 20: 46.08 يركل كل شيء بشكل أساسي ويريده ممزوجًا جيدًا.
00: 20: 48.15 لذلك ، هذا قد يحتوي على جزيئات من شأنها أن تنفجر
00: 20: 50.15 ووزع بالتساوي.
00: 20: 52.23 لكن الجاذبية ، إذا كان لكل من هذه الجسيمات كتلة ،
00: 20: 54.28 يريد سحب الجسيمات إلى السطح.
00: 20: 57.15 إذن ، هناك منافسة بين هذين التأثيرين ،
00: 21: 01.02 وهذا يؤدي إلى هذا.
00: 21: 03.15 ما أسميه l-sub-gravity ،
00: 21: 06.10 مقياس طول الجاذبية.
00: 21: 08.02 إذن ، kT هو مقياس طاقة
00: 21: 10.12 يحتوي على وحدات طاقة.
00: 21: 12.21 و mg ، الكتلة مضروبة في تسارع الجاذبية ،
00: 21: 15.08 هذه قوة.
00: 21: 16.25 إذن ، الطاقة مقسومة على قوة هي مقياس طول.
00: 21: 20.07 إذن ، مقياس الطول هذا هو في الأساس مقياس الطول
00:21: 22.19 حيث يتحلل ملف التركيز
00: 21: 26.25 كلما ارتفعت إلى أعلى وأعلى.
00: 21: 29.06 الآن ، فيزياء هذا التي أصفها
00: 21: 33.09 هو بالضبط سبب الغلاف الجوي
00: 21: 36.14 رقيق على علو شاهق.
00: 21: 38.01 لذا ، كما تعلمون ، إذا كان أحدهم يعمل
00: 21: 41.27 الطابق الثالث أو الرابع أو الخامس والعشرون من المبنى ،
00: 21: 45.00 عادة لا تلاحظ أن الغلاف الجوي أرق.
00: 21: 47.12 إذن ، لماذا هذا؟
00: 21: 49.20 حسنًا ، هذا بسبب. كما تعلم ، إذا فكرت في الأمر ،
00: 21: 52.03 إذا كنت في الطابق الثاني لمنزل أو ، كما تعلم ، حتى في مبنى شاهق ،
00: 21: 55.10 حجم ذلك. ارتفاع هذا المبنى
00: 21: 57.29 أصغر من مقياس طول الجاذبية هذا
00: 22: 00.01 لشيء مثل الأكسجين.
00: 22: 02.06 لذا ، يمكنني وضع كتلة الأكسجين
00: 22: 04.06 وهذه الأشياء الأخرى. تعلمون ، درجة حرارة الغرفة وما إلى ذلك.
00: 22: 07.29 وسأحصل على مقياس طول ثقالي يشبه الميل زائد.
00: 22: 11.05 لذا ، أنا لا ألاحظ الجو العام
00: 22: 14.10 التخفيف على علو شاهق.
00: 22: 16.06 لكني سألاحظ إذا تسلقت جبلًا مرتفعًا
00: 22: 18.25 أو ، كما تعلم ، سافر إلى لاباز ، بوليفيا على سبيل المثال.
00: 22: 22.01 سألاحظ أن الغلاف الجوي أرق كثيرًا ،
00: 22: 25.21 وهذا لأننا بدأنا الآن
00:22: 28.19 للاقتراب ، أو حتى تجاوز ، احتمالية ،
00: 22: 30.25 مقياس الطول هذا.
00: 22: 32.17 لذا ، نفس الفيزياء ، بشكل ملحوظ ،
00: 22: 34.29 يلعب دورًا مهمًا ومناسبًا داخل هذه الخلايا.
00: 22: 39.13 لذلك ، نعتقد أننا عادة نتجاهل الجاذبية داخل الخلايا
00: 22: 42.17 لأن الفكرة هي أن الخلايا ،
00: 22: 45.01 بشكل عام ، أصغر من مقياس طول الجاذبية هذا
00: 22: 47.01 لأي ​​من الهياكل التي سننظر فيها.
00: 22: 49.21 التغيير الوحيد الذي نجريه على هذه المعادلة
00: 22: 51.19 بدلاً من الكتلة سنضع طفوًا ..
00: 22: 53.26 كتلة طافية ، لذا فإن بعض الحجم يضاعف فرق الكثافة.
00: 22: 56.25 في. هذه البويضات الضفادع الكبيرة جدًا ،
00: 23: 01.26 ما يبدو أنه يحدث هو أن الخلية أصبحت كبيرة جدًا
00: 23: 05.11 أنه يتجاوز الآن مقياس طول الجاذبية هذا
00: 23: 08.26 لهذه الهياكل ،
00: 23: 10.18 والآن أصبحت الجاذبية مهمة حقًا.
00: 23: 12.07 يمكننا تحديد ذلك كميًا
00: 23: 15.22 ومع كل القياسات التي أجريناها ،
00: 23: 17.12 يمكننا تحديد مقاييس طول الجاذبية
00: 23: 21.01 واكتشف كل هذا ، وقم بعمل ما سأسميه مخطط الحالة لهذا.
00: 23: 24.07 وما يظهره هذا هو ذلك للخلايا الكبيرة
00: 23: 27.22 - هنا ، نحن نخطط لها كوظيفة للمقصورة ذات الصلة ،
00: 23: 31.21 وهي النواة ، لكن يمكننا أيضًا وضعها كدالة للخلايا -
00: 23: 35.17 تصبح الجاذبية مهمة
00: 23: 38.16 كلما كبرت وأكبر.
00: 23: 40.19 وهكذا ، أعتقد أن هذا نظام مثير للاهتمام حقًا ،
00: 23: 43.21 وهو مكان توجد فيه بعض الفيزياء الممتعة ،
00: 23: 47.14 والذي كان نوعًا ما غير متوقع
00: 23: 50.17 حتى بدأنا في عمل هذه الملاحظات
00: 23: 53.17 وهذا الاكتشاف.
00: 23: 56.09 الآن ، دعني أنقل التروس قليلاً
00: 23: 59.04 وأخبرك ببعض الملاحظات الأخرى المثيرة للاهتمام حقًا
00: 24: 02.02 الذي صنعناه في هذا النظام.
00: 24: 06.01 الآن ، طالبة الدراسات العليا ، مارينا فيريك ،
00: 24: 09.02 التي ذكرتها سابقًا.
00: 24: 10.17 في سياق هذه التجارب حيث كانت تعطل شبكة الأكتين
00: 24: 13.01 والنظر في كيفية اندماج جميع النوى مع بعضها البعض ،
00: 24: 17.06 كما تعلم ، تشكل هذا النوع من النواة ذات الحجم القياسي العالمي ،
00: 24: 21.12 ما لاحظته هو أن النواة تلتحم بطريقة مثيرة جدًا للاهتمام.
00: 24: 27.09 إذا بدأنا التسمية. التسمية الفلورية
00: 24: 30.22 الأجزاء الفرعية المختلفة للنواة.
00: 24: 34.02 حسنًا ، هذا فيلم سأريكم إياه
00: 24: 37.06 حيث قمنا بتسمية مجموعة واحدة من البروتينات باللون الأخضر
00: 24: 39.03 - هذا هو بروتين الفيبريلارين ،
00: 24: 41.07 وهو بروتين مرتبط بالنواة الداخلية -
00: 24: 43.29 ومجموعة أخرى من البروتينات.
00: 24: 47.03 أضع علامة هنا nucleophosmin ،
00: 24: 49.23 وهي مرتبطة بهذه الطبقة الخارجية من البروتينات النووية.
00: 24: 53.29 وما لاحظته مارينا هو أنها عندما عطلت شبكة الأكتين
00: 24: 58.17 ويتيح لكل هذه النوى أن تتحد مع بعضها البعض ،
00: 25: 00.17 هم بالفعل يشكلون قطرات تكبر وتكبر ،
00: 25: 03.10 لكن النوى أيضًا ،
00: 25: 08.23 هذا اللب الغني بالفيبريلارين داخل النواة ،
00: 25: 10.22 تتحد أيضًا مع بعضها البعض.
00: 25: 13.27 إذن ، يبدو الأمر كما لو كان لدينا سائل داخل سائل.
00: 25: 16.09 ويمكنك رؤية ذلك بشكل أفضل في هذه الصور.
00: 25: 19.03 هذه صور ذات دقة أعلى داخل.
00: 25: 22.14 داخل الخلية بعد أن تركناهم جميعًا يتحدون.
00: 25: 25.29 حقًا لديك شعور بأن البروتينات الغنية بالفيبريلارين
00: 25: 30.09 تشكل قلبًا ، سائلًا داخل السائل الخارجي الغني بالنيوكليوفوسمين.
00: 25: 36.10 ولذا ، فهذه فكرة مثيرة للاهتمام حقًا ،
00: 25: 39.23 وبدأنا نفكر فيما يعنيه
00: 25: 41.25 وكيف نفهمه
00:25: 45.13 من منظور الفيزياء الحيوية الجزيئية.
00: 25: 46.29 الآن ، بعض الأعمال الأخرى التي كنا نقوم بها.
00: 25: 51.24 تمكنا من إظهار أنه عندما نتناول الفيبريلارين ،
00: 25: 55.09 هذا البروتين المرتبط بالنواة ، وتنقيته ،
00: 25: 57.27 تنفصل المرحلة إلى هذه القطرات السائلة الجميلة.
00: 26: 00.21 وقد لا يكون ذلك مفاجئًا
00: 26: 03.00 بناءً على ما قلته لك في المحاضرة الأخيرة ،
00: 26: 04.25 لأن الفيبريلارين يمتد بشكل كبير.
00: 26: 11.03 وهو تكوين غير متجانس. هذه المناطق المضطربة جوهريا ،
00: 26: 15.01 الذي نعتقد أنه يقود بالفعل فصل الطور.
00: 26: 17.09 وهكذا ، فقد أظهرنا أنه يشكل هذه القطرات السائلة اللطيفة.
00: 26: 19.07 ماذا عن البروتينات الأخرى؟
00: 26: 21.15 لذلك ، تعاونا من أجل هذا العمل
00: 26: 23.23 مع ريتشارد كريواكي وديانا ميتريا في سانت جود ،
00: 26: 26.23 الذين كانوا يعملون مع نوكليوفوسمين في المختبر ،
00: 26: 30.09 بنظام منقى.
00: 26: 32.04 وقد أظهروا أن طور النوكليوفوسمين ينفصل
00: 26: 34.14 في هذه القطرات السائلة اللطيفة في المختبر.
00: 26: 36.06 وهكذا ، قلنا ، هيا لنفعل ذلك
00: 26: 39.02 ما هي تجربة بسيطة وواضحة ،
00: 26: 41.09 وخذ هاتين العينتين واخلطهما
00: 26: 44.10 واسأل عما يحدث.
00: 26: 46.11 وعندما فعلنا ذلك ، أعتقد أنه من اللافت للنظر ،
00: 26: 48.23 ما وجدناه هو أن القطيرات الغنية بالفيبريلارين
00: 26: 50.26 والقطرات الغنية بالنيوكليوفوسمين
00: 26: 53.04 غير قابلة للامتزاج نسبيًا مع بعضها البعض -
00: 26: 54.28 لا يختلطون مع بعضهم البعض.
00: 26: 56.23 وبدلاً من ذلك نحصل على هذا.
00: 26: 58.25 ما يمكن أن أسميه نظام ثلاثي الطور.
00: 27: 00.13 يوجد أ. المنطقة المظلمة هنا
00: 27: 02.22 ستكون مرحلة تركيز منخفض من.
00: 27: 04.15 يحتوي على بعض النيوكليوفوسمين وبعض الفيبريلارين.
00: 27: 06.00 النقاط الخضراء بالداخل هنا
00: 27: 08.14 مرحلة سائلة غنية بالفيبريلارين ،
00: 27: 11.08 والطور الخارجي أحمر أو برتقالي اللون
00: 27: 14.02 مرحلة غنية بالنيوكليوفوسمين.
00: 27: 17.05 لذلك ، هذا حقًا ، كما أعتقد ، رائع جدًا ،
00: 27: 19.27 وهو أمر رائع لعدة أسباب.
00: 27: 21.14 أحدها هو أن هذا النظام البروتيني المنقى
00: 27: 25.03 تلخص بشكل أساسي
00: 27: 28.02 التنظيم في الجسم الحي لهذه الهياكل.
00: 27: 32.22 لذا ، في الجسم الحي ، تذكر أن لدينا قطرات شبيهة بالسائل غني بالفيبريلارين
00: 27: 37.18 داخل طبقة خارجية غنية بالنيوكليوفوسمين ،
00: 27: 41.07 وهذا هو بالضبط نظام التنقية في المختبر
00: 27: 43.20 يبدو.
00: 27: 45.11 لذا ، اعتقدنا أن هذا كان. كان ذلك لا يصدق.
00: 27: 47.09 بنظام بسيط جدًا يحتوي على كمية قليلة من البروتين
00: 27: 51.10 ومكونات RNA ،
00: 27: 53.20 تمكنا من تلخيص بنية الهيكل الأساسية هذه
00: 27: 56.07 للنواة.
00: 27: 59.29 الآن ، فكرة عدم امتزاج السائل
00: 28: 03.21 - وجود عدة أطوار سائلة غير قابلة للامتزاج
00: 28: 06.15 أو الأطوار السائلة غير القابلة للخلط -
00: 28: 08.18 هو بحد ذاته شيء معروف جيدًا في الهندسة الكيميائية
00: 28: 12.05 والكيمياء الفيزيائية ومجتمعات المواد اللينة.
00: 28: 15.15 هذا مجرد مثال لبعض السوائل غير القابلة للامتزاج
00: 28: 19.00 يمكن للمرء أن يتشكل. يمكن أن تتشكل من ، كما تعلمون ،
00: 28: 22.03 مذيبات عضوية غير حية وماء وزيوت ،
00: 28: 24.18 حيث يمكنك الحصول على هذه الأشياء
00: 28: 28.05 لا تختلط مع بعضها البعض.
00: 28: 31.04 إذن ، يمكننا فصل الطور ، إذن ،
00: 28: 33.11 ليس فقط لتكوين مرحلتين ، ولكن في الواقع لتشكيل عدة مراحل ،
00: 28: 39.15 والطريقة التي تتفاعل بها تلك المراحل مثيرة للاهتمام للغاية
00: 28: 41.14 ومجموعة غنية من الفيزياء
00: 28: 43.26 لم يتم فهمها بالكامل بعد.
00: 28: 46.23 أحد الأسئلة التي طرحناها أثناء إجراء هذه التجارب هو ،
00: 28: 49.12 لماذا تكون قطرات الفيبريلارين في الداخل؟
00: 28: 51.19 إذن ، بعبارة أخرى ،
00: 28: 53.23 لماذا اللون الأخضر داخل الأحمر؟
00: 28: 55.16 لماذا لا يوجد اللون الأحمر داخل الأخضر ، على سبيل المثال؟
00: 28: 58.12 سيكون ذلك. يبدو أن هذا صحيح تمامًا.
00: 29: 03.11 سيكون لديك عدم امتزاج
00: 29: 05.19 أنهم لا يختلطون مع بعضهم البعض.
00: 29: 07.29 من منظور علم الأحياء ،
00: 29: 10.14 من المحتمل أن تكون مشكلة ،
00: 29: 13.19 لأن العمليات المرتبطة بالفيبريلارين
00: 29: 16.25 والكثافة الليفية. الحالة المكثفة تحدث أولاً ،
00: 29: 21.26 والفكرة هي أن تلك النسخ من الحمض النووي الريبي
00: 29: 24.17 تتم معالجتها بطريقة تسلسلية من الداخل إلى الخارج.
00: 29: 27.16 لذا ، إذا لم يكن الأمر صحيحًا ، فمن المحتمل أن يكون هذا سببًا
00: 29: 31.27 مشاكل في علم الأحياء.
00: 29: 34.11 إذن ، لماذا يعرف الفيبريلارين
00: 29: 37.06 أنه من المفترض أن يكون من الداخل ،
00: 29: 39.03 و nucleophosmin وتلك المكونات التي
00: 29: 41.17 تعرف أنه من المفترض أن يكونوا في الخارج؟
00: 29: 43.25 حسنًا ، اتضح أن هذا مفتاح للإجابة على هذا السؤال
00: 29: 45.28 يأتي من التوتر السطحي.
00: 29: 47.28 لذا ، كما يوحي الاسم ،
00: 29: 50.23 التوتر السطحي هو نوع من التوتر المرتبط بالأسطح
00: 29: 54.26 أو واجهات بين نوعين مختلفين من المراحل.
00: 29: 56.29 على وجه الخصوص ، إنه حقًا.
00: 29: 59.10 هي تكلفة طاقة مرتبطة بوجود واجهة ،
00: 30: 02.05 وهي تحتوي فعليًا على وحدات طاقة لكل وحدة مساحة.
00: 30: 07.02 يمكنك التفكير في هذا بطريقة بسيطة.
00: 30: 09.14 التخطيطي البسيط لأنه يعكس حقيقة ذلك
00: 30: 14.23 جزيئات داخل مرحلة سائبة نوعًا ما تعاني
00: 30: 17.06 بيئة متجانسة تحيط بها.
00: 30: 20.20 بواسطة مجموعة معينة من الجزيئات ،
00: 30: 25.21 ولكن في الواجهة يوجد هذا النوع من ملفات.
00: 30: 27.18 كما تعلمون ، من ناحية ، يرون المرحلة المتجانسة
00: 30: 29.27 على الجانب الآخر ، يرون هذه البيئة الخارجية.
00: 30: 32.14 وهذا يحدد تكلفة الطاقة.
00: 30: 35.10 مظهر من مظاهر التوتر السطحي
00: 30: 38.22 شيء نعرفه جميعًا
00: 30: 41.03 من خلال النظر إلى أشياء مثل حشرات المشي في الماء
00: 30: 43.28 أو حقيقة أنه يمكننا ، في بعض الحالات ،
00: 30: 46.06 احصل على مشابك ورقية تطفو بالفعل على الماء
00: 30: 49.04 بسبب تأثيرات التوتر السطحي ،
00: 30: 51.15 أو إذا كنت ستغسل سيارتك وتضع بعض الشمع على السيارة ،
00: 30: 55.11 على سبيل المثال ، ثم شاهد ،
00: 30: 58.19 سوف تتشكل قطرات الماء على هذا السطح.
00: 31: 01.01 هذه كلها تأثيرات التوتر السطحي -
00: 31: 03.06 طاقة السطوح البينية بين الأطوار المختلفة.
00: 31: 06.05 واتضح أن التوتر السطحي
00: 31: 08.17 معروف حقًا أنه عنصر أساسي في الهيكلة
00: 31: 13.13 سوائل متعددة المراحل.
00: 31: 15.00 لذلك ، على وجه الخصوص ، للأنظمة متعددة المراحل
00: 31: 18.11 من مادة غير حية ،
00: 31: 20.03 نحن نعلم أنه يجب أن يكون لديك هذا النوع من مؤسسة shell الأساسية
00: 31: 25.17 لنظام ثلاثي الطور ،
00: 31: 27.22 التوتر السطحي بين المرحلة 3 ،
00: 31: 29.27 هذه المرحلة الخضراء ،
00: 31: 32.05 والمرحلة 1 ، المرحلة السوداء ،
00: 31: 34.21 يجب أن يكون كبيرًا. لذا ، إذا كان هذا التوتر السطحي ،
00: 31: 36.15 الطاقة المرتبطة بهذه الواجهة كبيرة جدًا ،
00: 31: 39.21 ثم يمكن للنظام تقليل الطاقة
00: 31: 43.15 بجعل تلك الواجهة تختفي -
00: 31: 45.15 بعبارة أخرى ، من خلال وجود المرحلة الخضراء ضمن الطور الأحمر.
00: 31: 49.17 وبعد ذلك لم يعد هناك أي واجهة بين ، كما تعلم ، 1 و 3.
00: 31: 53.08 يمكنك القيام بتجربة بسيطة للغاية.
00: 31: 56.24 لذا ، قامت مارينا بالفعل بهذا النوع البسيط من التجربة
00: 31: 58.25 يمكنك القيام به في مطبخك
00: 32: 01.06 بأخذ الماء وزيت Crisco وزيت السيليكون
00: 32: 03.25 ويظهر ذلك بسبب واجهة زيت السيليكون والماء.
00: 32: 06.28 التوتر. التوتر السطحي كبير ،
00: 32: 09.24 أكبر من ذلك الموجود بين الماء وزيت Crisco ،
00: 32: 12.18 الاشياء الحمراء ،
00: 32: 14.25 ثم يتم دمج زيت السيليكون في زيت Crisco.
00: 32: 18.05 لذلك ، كان لدينا توقع بأن بنية الغلاف الأساسية ،
00: 32: 21.27 التنظيم الصدفي الأساسي الذي نراه داخل النواة ،
00: 32: 24.26 كان يعكس هذه التوترات السطحية التفاضلية.
00: 32: 27.24 لمحاولة اختبار هذه الفكرة ،
00: 32: 31.07 أخذنا البروتينات النقية التي تشكل هذه السوائل
00: 32: 33.10 وسأل ، كيف يتفاعلون مع الأسطح
00: 32: 36.06 من اختلاف مسعور ؟،
00: 32: 38.00 نظام التشغيل يمكننا محاولة فهم القوة النسبية
00: 32: 41.02 من تفاعلاتهم ،
00: 32: 45.22 أفضلية التفاعلات مع الماء مقابل الزيت.
00: 32: 49.04 وهكذا ، أخذنا سطحًا كارهًا للماء نسبيًا -
00: 32: 51.21 هذا ليس سطحًا كارهًا للماء بشدة ، ولكنه كاره للماء نسبيًا
00: 32: 52.19 - نظرنا من الجانب ،
00: 32: 56.00 مرة أخرى نوع من التصور من الجانب ،
00: 32: 58.00 في كيفية تفاعل هذه القطرات مع السطح.
00: 33: 00.10 ما وجدناه هو أن قطرات نوكليوفوسمين
00: 33: 03.20 تميل إلى التصرف مثل الماء ،
00: 33: 08.10 من حيث أنها تميل إلى الارتفاع فوق هذه الأسطح الكارهة للماء نسبيًا ،
00: 33: 10.27 حيث تميل القطرات الغنية بالفيبريلارين إلى البلل بشكل أفضل
00: 33: 14.14 هذه الأسطح الكارهة للماء ،
00: 33: 16.26 وهذا كله يتفق مع الفكرة
00: 33: 18.26 أن التوتر السطحي بين الفيبريلارين ،
00: 33: 21.02 الأشياء الخضراء ،
00: 33: 23.12 والمياه أكبر من تلك الموجودة بين نوكليوفوسمين ،
00: 33: 26.05 المادة الحمراء والماء.
00: 33: 29.01 وهذا هو سبب وجود القطرات الخضراء داخل المنطقة الحمراء ،
00: 33: 34.00 تمامًا كما ترى في هذا التخطيطي هنا.
00: 33: 36.02 وهكذا ، فإن فكرة التوتر السطحي وهيكل التوتر السطحي
00: 33: 39.08 من السوائل متعددة المراحل لها آثار
00: 33: 42.23 أفكر كثيرًا فيما وراء النواة ،
00: 33: 44.26 وهو النظام ، كما تعلم ،
00: 33: 46.22 كنا ندرس لتوضيح هذه الأفكار.
00: 33: 48.25 على وجه الخصوص ، إذا كانت الواجهة
00: 33: 52.00 والتوتر السطحي بين مرحلتين مختلفتين ..
00: 33: 55.01. دعنا نقول بين المرحلة 3 والمرحلة 2 ،
00: 33: 57.23 الأحمر والأخضر.
00: 34: 00.03 إذا كان هذا مكلفًا للغاية -
00: 34: 02.24 بمعنى آخر ، في أي وقت يكون اللون الأحمر بجوار الأخضر ، هناك تكلفة ضخمة للطاقة -
00: 34: 05.05 ثم ما يحدث هو هذين النوعين من السوائل
00: 34: 08.05 فقط لن تتفاعل أبدًا.
00: 34: 11.06 لن يلمسوا بعضهم البعض على الإطلاق.
00: 34: 12.28 ولذا ، من المحتمل أن هذا هو سبب وجود العديد من المكثفات في الخلايا
00: 34: 16.11 في الواقع لا تتفاعل على الإطلاق.
00: 34: 17.16 إنهم نوعًا ما لا يلتصقون ببعضهم البعض ، ولا يبللون بعضهم البعض ،
00: 34: 19.28 لا يبتلع أحدهم الآخر وهكذا دواليك.
00: 34: 21.23 في حالات أخرى ، يمكن أن يكون هناك ترطيب جزئي ،
00: 34: 25.06 حيث تكون التوترات السطحية من نفس الحجم تقريبًا ،
00: 34: 30.01 وبعد ذلك يمكن أن يكون لديك قطرات
00: 34: 32.08 التي لا تبتلع بعضها البعض بشكل كامل ،
00: 34: 34.08 لكنهم يتفاعلون ،
00: 34: 36.25 ويمكن أن يكون لديك أشكال تبدو بهذا الشكل.
00: 34: 38.14 نعتقد أن هذا مهم لأن
00: 34: 41.02 يوجد العديد من الهياكل في الخلية
00: 34: 43.13 حيث يوجد تفاعل جزئي بين هذه المكثفات ،
00: 34: 46.07 على سبيل المثال في هذه الصورة المجهرية الجميلة من جو غال
00: 34: 49.08 تظهر أجسام Cajal و Snurposomes ونوع الترطيب الجزئي
00: 34: 51.29 - هذا النوع من زوايا الاتصال المحددة جيدًا وما إلى ذلك -
00: 34: 56.00 يمكن للمرء البدء في استخدامه لقياس التوترات السطحية بين هذه القطرات ،
00: 35: 01.17 وبين القطرات والنيوكليوبلازم المحيط بها ، في هذه الحالة.
00: 35: 06.22 لذا ، في هذا الحديث ، حاولت أن أنقل لكم بعض الإثارة
00: 35: 10.14 حول النواة ، وبشكل أعم
00: 35: 13.11 فكرة أن هذه الحالات المكثفة للمادة الجزيئية الحيوية
00: 35: 17.20 مهمة داخل النواة.
00: 35: 20.28 النواة هي نوع واحد فقط من هذه الهياكل.
00: 35: 24.15 ركزنا عليه قليلاً
00: 35: 27.13 لأنها أكبر الأجسام النووية ،
00: 35: 30.00 ولكن يوجد بالفعل عشرات الأنواع المختلفة من هذه الأشياء داخل النواة.
00: 35: 36.25 وفي الحقيقة ، نعتقد أن النواة على الأرجح
00: 35: 38.28 مثال متضخم لنوع فصل الطور
00: 35: 45.01 والطريقة التي تؤثر بها المكثفات التي تتشكل على الجينوم ،
00: 35: 47.10 وربما يلعب دورًا مهمًا حقًا
00: 35: 49.27 في تدفق المعلومات الجينية.
00: 35: 52.07 يمكننا التفكير في هذه المكثفات كشيء
00: 35: 55.21 مثل تكثيف الماء على هذا.
00: 35: 58.22 على شبكة العنكبوت هذه ، والتي يمكن أن تشوه شبكة العنكبوت و.
00: 36: 04.14 وأعد هيكلتها بطريقة ما.
00: 36: 06.11 وهكذا ، هذه هي أنواع الأسئلة التي بدأنا في معالجتها ،
00: 36: 09.00 وهناك الكثير من الإثارة في هذا المجال
00: 36: 12.00 في التفكير في المضي قدمًا في هذه الأفكار.
00: 36: 14.22 إذن ، كيف تؤثر المكثفات السائلة على بنية الجينوم ونشاطه؟
00: 36: 19.00 إذن ، كيف يمكن أن يلعبوا دورًا رئيسيًا
00: 36: 21.18 في تنظيم التعبير الجيني
00: 36: 23.15 التي تؤدي إلى ظهور سمات كائن حي؟
00: 36: 26.16 كما تعلمون ، لون الشعر ولون العينين ، الطول ، الوزن ،
00: 36: 30.27 عدد الذراعين والساقين وأصابع القدم ،
00: 36: 33.21 وكل تلك الأشياء التي تصنع علم الأحياء حقًا
00: 36: 38.28 مثير جدًا للاهتمام ، بحيث يمكننا الانتقال من الجينات إلى السمات.
00: 36: 42.12 كيف. قم بهذه التحولات.
00: 36: 44.26 لذا فإن ملف. كما تعلم ، لقد تحدثت كثيرًا عن.
00: 36: 46.29 في الحديث الأخير أيضًا. حول التحولات بين الحالات السائلة
00: 36: 50.05 والحالات الصلبة ،
00: 36: 52.01 هذه السوائل والمواد الهلامية والأميلويد.
00: 36: 53.26 قم بإجراء انتقالات بين تلك الحالات المختلفة للمادة الجزيئية الحيوية
00: 36: 56.27 تلعب دورًا في تنظيم الجينات؟
00: 36: 59.18 إنه سؤال رائع حقًا.
00: 37: 01.17 لدينا القليل جدًا من المعرفة حول ذلك ،
00: 37: 03.05 وأعتقد أن هذا سيكون أحد الأسئلة الرئيسية
00: 37: 05.11 للمضي قدمًا في هذه المنطقة ،
00: 37: 09.26 في واجهة فيزياء المواد اللينة ، ج
00: 37: 12.22 علم الأحياء ، علم الوراثة ،
00: 37: 16.14 وربما عدد من المجالات الأخرى.
00: 37: 20.14 حسنًا ، هناك الكثير من الإثارة الآن ،
00: 37: 22.22 وسنكون سعداء لرؤية هذا يتحرك إلى الأمام.
00: 37: 25.29 أود أن أشكرك على اهتمامك.
00: 37: 28.07 لقد كان من دواعي سروري حقًا العمل مع بعض الأشخاص.
00: 37: 33.04 ذكرت مارينا فيريك ، طالبة تخرج سابقة.
00: 37: 35.11 لدينا مجموعة رائعة حقًا من الأشخاص في المختبر ،
00: 37: 37.01 وكنت محظوظًا للتفاعل مع w
00: 37: 39.27 مع الكثير من المتعاونين الرائعين حقًا.
00: 37: 42.14 أنا ممتن جدًا لذلك ولتمويل
00: 37: 45.09 ساعد في جعل بعض العمل الذي نقوم به في مختبرنا ممكنًا.
00: 37: 48.10 شكرًا جزيلاً على اهتمامك.


4 علم جينوم الخلية الواحدة

يوفر تسلسل الحمض النووي للخلايا الفردية فرصًا فريدة للتحقيق في التجميع الجديد لجينوم الميكروبات النادرة أو غير القابلة للزراعة ، 40 ، 41 عدم تجانس الخلايا في الورم (طفرات الحمض النووي) 42 أو اكتساب المقاومة أثناء العلاج. 43 ، 44 أدت المقارنة الشاملة للتغاير الجينومي بين الورم الأساسي ومواقع الورم النقيلي إلى فهم أعمق لتكوين النقائل ، 43 وفهم التغيرات الجينية في بيئة الورم التي تؤدي إلى مقاومة الأدوية. 44 تقنيات التحليل الجيني أحادي الخلية التي لا تستخدم موائع جزيئية قطيرة ، ولكن الآبار: تسلسل التقاط أحادي الخلية retrotransposon (scRC-seq) ، 45 تسلسل exome نواة مفردة (nuc-seq / SNES) 46 أو الصمامات: مراحل حتمية مباشرة ( DDP) ، لن تتم مراجعة 47 هنا.

تتمثل الخطوة الحاسمة في تحليل الجينوم أحادي الخلية في تضخيم كميات بيكو أو نانوجرام من الحمض النووي إلى كميات ميكروغرام. يمكن تمييز استراتيجيتين لتضخيم المواد الجينومية المشتقة من خلية واحدة: 1) تضخيم الجينوم المستهدف (يتم تضخيم الأجزاء المستهدفة فقط) ، أو 2) تضخيم الجينوم الكامل (WGA).

يستخدم تضخيم الجينوم المستهدف تفاعل PCR القياسي. ترتبط البادئات المصممة فقط بالتسلسل المحدد الذي يحيط بتسلسل الاهتمام في الجينوم الذي يتم تضخيمه في الخطوة التالية. في المقابل ، ترتبط المواد الأولية المستخدمة في WGA بالعديد من الأماكن في الجينوم لبدء التكرار ، وبالتالي يتم تضخيم خيط الحمض النووي بالكامل. في هذا القسم ، يتم تقديم تقنيات موائع جزيئية قطيرة لتحليل الجينوم أحادي الخلية ومقارنتها.

4.1 تحليل الجينوم المستهدف

تسمح ثلاث تقنيات موائع جزيئية بالقطيرات بتحليل الجينوم المستهدف لخلية واحدة: التضخيم الوراثي للنسخة الواحدة (SCGA) ، PCR القائم على الاغاروز ، والفرز الخلوي المنشط بواسطة PCR (PACS).

4.1.1 SCGA

يعتمد التضخيم الجيني للنسخة الواحدة (SCGA) 48 على توليد قطرات نانوليتر موحدة لأداء PCR حبة. شكل يوضح الشكل 4 أ سير العمل العام لـ SCGA. باختصار ، يتم تغليف الخلايا المفردة بشكل مشترك في قطرات الماء في الزيت مع: حبة agarose موسومة تساهميًا مع بادئات عكسية ، ومزيج PCR يحتوي على مواد أولية وإنزيمات موصوفة بصبغة. بعد ذلك ، يتم جمع القطرات خارج الرقاقة ، ويتم تفكيك الخلايا ، ويخضع المستحلب لسلسلة من الدورات الحرارية لـ PCR التي تولد منتجًا مزدوج الشريطة يحمل علامة الصبغة على سطح الخرزة. بعد قطيرة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم إحداث إزالة الاستحلاب ويتم استعادة الخرزات المطلية بأمبليكون الفلورسنت. يتم إجراء الكشف عن الحمض النووي الهدف عن طريق قياس شدة مضان حبة واحدة عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم الحصول على شظايا الحمض النووي حتى 1139 نقطة أساس باستخدام SCGA بكفاءة 40 ٪ من PCR ، مما يعني أن المنتجات المرفقة بالخرز يمكن أن تكون بمثابة قالب للتسلسل بالجملة. بالإضافة إلى ذلك ، يشكل SCGA طريقة كشف سريعة ورخيصة ، مع ثلاث خطوات فقط ، عالية الإنتاجية: الاستحلاب ، PCR ، واكتشاف شدة التألق للخرز باستخدام قياس التدفق الخلوي. من عيوب SCGA التردد المنخفض لتوليد القطيرات (أقل من 6 هرتز). لمعالجة هذه المشكلة ، Zeng et al. إنشاء جهاز مصفوفة مولدات مستحلب دقيقة التصنيع (MEGA) لتوليد قطرات عالية الإنتاجية. 49 يصل جهاز MEGA ذو 96 قناة إلى معدل توليد قطرات يبلغ 940 هرتز. العيب الثاني لـ SCGA هو أن القطيرات PCR (dPCR) لها كفاءة أقل مقارنةً بـ PCR السائبة: 40 ٪ لـ dPCR مقارنةً بـ PCR السائبة ولكن مع قالب مكافئ وتركيزات حبة. أخيرًا ، تغلف SCGA كلاً من الخرزات والخلايا في قطرات من محاليل مخففة جدًا تتبع إحصائيات بواسون ، مما يؤدي إلى كفاءة منخفضة في التغليف المشترك: 1 في 100 قطرة تحتوي على خلية واحدة وحبة واحدة.

4.1.2 قطيرة الاغاروز ePCR ميكروفلويديك

طورت مجموعة يانغ مستحلب PCR القائم على الاغاروز (ePCR). 50 يوضح الشكل 4 ب سير العمل العام. يتم استحلاب محلول الاغاروز عند 540 هرتز مع الخلايا (2 ، 1 ، أو 0.5 خلية لكل قطرة) ومزيج PCR. على غرار SCGA ، يحتوي مزيج PCR على مواد أولية وإنزيمات متألقة. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، يتم ربط الاشعال العكسي تساهميًا بالأغاروز بدلاً من ربطها بالخرز. بعد الاستحلاب ، يتم جمع القطرات لمزيد من تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الحمض النووي المستهدف. بعد ذلك ، يتم تحويل قطرات agarose إلى حبات صلبة مع أمبليكون PCR المسمى fluorescently المرفقة تساهميًا بمصفوفة agarose. أخيرًا ، تُغسل الحبيبات لإزالة الفائض من البادئات الأمامية ذات العلامات الفلورية والتي لم يتم استخدامها أثناء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ثم يتم تحليلها باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو قياس التدفق الخلوي.

يوفر Agarose droplet microfluidic ePCR مزايا متعددة مقارنة بـ SCGA. أولاً ، يُظهر ترتيبًا واحدًا من حيث الحجم في كفاءة الخلايا والتغليف المشترك للبادئات لأن البادئات جزء من المرحلة السائلة agarose ، وبالتالي فهي موجودة في جميع القطرات ، بينما في SCGA يتم حمل البادئات على خرز صلبة (في 10 ٪ من القطرات المتكونة). تتيح زيادة كفاءة التغليف المشترك توصيف مجموعات الخلايا الكاملة ، وتقليل مدة التجربة وتكاليفها. يرتبط مزيد من التبسيط باستخدام قطرات الاغاروز التي تغلب على الحاجة إلى استخدام حبات المسمى مع الاشعال.

4.1.3 PACS

يسمح الفرز الخلوي المنشط بواسطة PCR (PACS) بفرز البكتيريا بناءً على استجواب مناطق الجينوم الصغيرة (مئات القواعد). 51 يظهر سير العمل العام لنظام PACS في شكل 5 أ. يتم تغليف البكتيريا وكواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل في كبسولات مشتركة. يتم تحلل الخلايا وإذا كان الحمض النووي الخاص بها يحتوي على تسلسل الاهتمام ، فإن مسبار TaqMan (الذي يحتوي على صبغة مراسلة ومخمد على مقربة) يصلبها. يسمح التحلل المائي للمسبار بواسطة نشاط نوكلياز خارجي لبوليميراز Taq بإطلاق صبغة المراسل من المسبار وبالتالي يتم زيادة التألق بسبب القضاء على تأثير التبريد. عند تضخيم PCR ، تزداد شدة إشارة التألق في القطرة في كل دورة. بعد ذلك ، يتم فرز قطرات الفلورسنت لتحليل الجينوم الكامل المصب.

4.1.4 التطورات التجارية

قامت Mission Bio بتطوير منصة لتحليل الجينوم المستهدف للخلية الواحدة وتسويقها كتقنية Tapestri. 52 الشكل 5 ب يعرض سير العمل. أولاً ، يتم تغليف الخلايا المفردة في قطرات تحتوي على البروتياز. بعد تحلل الخلايا في القطرات ، تزداد درجة الحرارة لتعطيل البروتياز. بعد ذلك ، تقترن القطرات التي تحتوي على جينوم الخلايا المفردة بواسطة مقياس كهربائي مع قطيرة ثانية تحتوي على كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وحبات هيدروجيل الترميز (بنسبة 1: 1). يتم تمييز حبات هيدروجيل الترميز الشريطي بأوليغنوكليوتيدات تحتوي على رمز شريطي خاص بالخلية وتسلسل تمهيدي خاص بالجينات. بعد التغليف المشترك لحبات الهيدروجيل بالقطرات المحتوية على الجينوم ، يتم إطلاق الصور الأولية التي تحمل علامة حبة الهيدروجيل بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية ويتم تشفير تسلسل الحمض النووي المستهدف بواسطة تضخيم PCR. أخيرًا ، يتم تكسير المستحلب ويتم تحضير المكتبات بكميات كبيرة ، متبوعًا بالتسلسل. بيليجرينو وآخرون أظهر 52 تجربة إثبات المفهوم باستخدام 62 هدفًا من الحمض النووي لتحليل التباين الجيني لخلايا سرطان الدم النخاعي الحاد الفردية.

4.2 تحليل الجينوم الكامل

يعد تحليل الجينوم الكامل على مستوى الخلية المفردة أمرًا صعبًا بسبب: 1) الصعوبات المحيطة بعزل الحمض النووي من الخلايا الفردية ، 2) كفاءة وموثوقية تضخيم الجينوم الكامل (WGA) ، 3) التحقق من التسلسلات التي يمكن استخدامها لتحديد المتغيرات ، و 4) تحليل البيانات وتفسيرها. 53

في هذا القسم ، نقدم أولاً تقنيات مختلفة لتضخيم الجينوم الكامل والتي كانت أحد التحديات التقنية الرئيسية في تحليل الجينوم الكامل في العقود الماضية. ثم نصف خطي أنابيب كاملين لتحليل الجينوم الكامل للخلية الواحدة باستخدام جزيئات الموائع الدقيقة: SiC-seq و CNV (10X Genomics).

4.2.1 تقنيات تضخيم الجينوم الكامل

DOP-PCR

تم تقديم مفهوم تفاعل البلمرة المتسلسل المنحل بأوليغنوكليوتيد أو التضخيم القائم على PCR (DOP-PCR) في عام 1992 بواسطة Telenius et al. 54 يعتمد DOP-PCR على استخدام جهاز تمهيدي واحد يحتوي على تسلسل عشوائي (تسلسل متدهور). يبدأ DOP-PCR ببضع دورات من التضخيم المسبق عند درجة حرارة تلدين أولية منخفضة للسماح للبادئات العشوائية بالتصلب. بعد ذلك ، يتم تضخيم أمبليكون الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.

يتمتع DOP-PCR بميزتين رئيسيتين: فهو يضخم الحمض النووي في مواقع متعددة وهو مستقل عن الأنواع. ومع ذلك ، يوفر DOP-PCR تغطية منخفضة للجينوم ، لذا فإن أي اختلافات في التضخيم تتضخم بشكل كبير ، مما ينتج عنه مناطق مفرطة في الحجم ومضخمة على طول الجينوم.

يعتمد تضخيم الإزاحة المتعددة (MDA) ، الذي طوره دين وزملاؤه في عام 2001 ، 55 على التضخيم متساوي الحرارة. يتم تهجين الاشعال السداسي العشوائي للقالب ، متبوعًا بتخليق الحمض النووي بإزاحة حبلا بواسطة بوليميراز ϕ29 عالي الدقة. يؤدي تضخيم الحمض النووي باستخدام MDA إلى تغطية جينوم أعلى بكثير مقارنة بـ DOP-PCR. 56 ومع ذلك ، فإن MDA ، على غرار DOP-PCR ، يعتمد على تضخيم أسي يؤدي إلى تضخيم مفرط يعتمد على التسلسل أو تضخيم ناقص على طول الجينوم بأكمله الذي لا يمكن استنساخه من خلية إلى أخرى. تم تطوير أشكال مختلفة من MDA للتغلب على تحيز التضخيم وتحسين الإنتاجية ، أي MIDAS ، 57 IMS-MIDAS ، 58 SNES ، 46 ddMDA. تم تنفيذ 59 MDA بنجاح في قطرات الموائع الدقيقة لزيادة كفاءتها. 60-62 تضخيم الإزاحة المتعددة في القطرات (sd-MDA) تم توضيحه أيضًا على الجينومات المشتقة من الخلايا المفردة. 63

الطرق الهجينة

تهدف الطرق الهجينة إلى التغلب على بعض أوجه القصور في الطريقتين المذكورتين أعلاه من خلال الجمع بين بعض نقاط قوتها. تعد دورات التضخيم المعتمد على التلدين والتكرار الحلقي (MALBAC) والإزاحة DOP-PCR (PicoPLEX) أمثلة على الطرق الهجينة التي تجمع بين التضخيم متساوي الحرارة متبوعًا بتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للأمبليكونات المتولدة. يعتمد MALBAC على تضخيم شبه خطي يقلل من التحيز المعتمد على التسلسل ، ولا يتمثل التحسين الرئيسي في إنشاء نسخ من النسخ ولكن على العكس من ذلك ، تضخيم تسلسل الجينوم الأصلي فقط من خلال حماية المنتجات المضخمة بالفعل. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام البادئات العشوائية التي تمتلك تسلسلًا (مرساة) لتعزيز حلقات الأمبليكون ومنع المزيد من التضخيم قبل PCR الثاني. في المقابل ، يستخدم PicoPLEX بادئات متدهورة في التفاعل الأول لإضافة تسلسل مرساة ، متبوعًا بتهيئة التسلسل الإضافي لتضخيم PCR النهائي. يو وآخرون. أظهر جهاز موائع جزيئي متكامل للغرفة مصمم لتفاعلات MALBAC أحادية الخلية لتحديد الاختلافات في عدد النسخ. 64 تمت مراجعة المقارنة بين طرق التضخيم المختلفة في مكان آخر ولن يتم تناولها بمزيد من التفصيل في هذه المراجعة. 65 ، 66

4.2.2 SiC-Seq

تسلسل الجينوم أحادي الخلية بإنتاجية فائقة (SiC-seq) تم تطويره بواسطة Lan et al. كان 67 هو أول منصة لتحليل الجينوم أحادي الخلية حيث يتم إجراء معظم التفاعلات في قطرات. يقوم SiC-seq بتسمية جميع مواد الحمض النووي من خلية فردية برمز شريطي فريد لهذه الخلية. يتألف سير العمل من الخطوات التالية (شكل 6 أ): 1) توليد قطيرات الباركود ، 2) تغليف الخلايا في قطرات الاغاروز ، التحلل ، تنقية الحمض النووي الجيني ، وهلام حبات الخلية ، 3) إعادة تغليف حبات الخلية المنقاة بكواشف الترميز ، 4) دمج قطيرات تحمل الجينوم الموسوم بقطرة تحتوي على كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وقطرات باركود ، 5) التسلسل وتحليل البيانات.

في الخطوة الأولى ، يتطلب SiC-seq إعداد مكتبة قطيرات تشفير شريطي. يتم تغليف أوليغنوكليوتيدات عشوائية مكونة من 15 قاعدة محاطة بتسلسلات ثابتة مع: كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والبادئات (مكملة للمناطق الثابتة من الباركود وتحتوي على محول خلية تدفق Illumina P7). بعد ذلك ، يتم تضخيم محتوى القطرات مع جميع الكواشف عبر PCR الرقمي للقطيرات (يتم إنشاء ≈10 ملايين قطرة تشفير شريطي في غضون ساعات قليلة). بعد إعداد مكتبة الترميز الشريطي ، يجب عزل الخلايا المفردة. يتم دمج المعلق الخلوي مع تيار الاغاروز المنصهر باستخدام صانع قطرات التدفق المشترك. تتجمد قطرات الاغاروز بالتبريد وتنقل من الزيت إلى الناقل المائي. حبات الاغاروز قابلة للاختراق للإنزيمات والمنظفات والجزيئات الصغيرة ، لكنها تحبس الهياكل الأكبر حجمًا مثل الحمض النووي الجيني ، مما يجعلها الركيزة المثالية للسماح بتنفيذ خطوات الغسيل على الخلايا المغلفة. بعد ذلك ، يتم هضم جدار الخلية ، ويتم إجراء سلسلة من العلاجات الأنزيمية والمنظفات (إذابة الدهون وهضم البروتينات). يتم إعادة تغليف الميكروبيدات المنقاة مع الحمض النووي الجيني في قطرات تحتوي على كواشف توصيف من أجل تفتيت الجينوم وإرفاق تسلسلات عالمية لتعمل كمقابض تفاعل البوليميراز المتسلسل. بعد وضع العلامات ، يتم دمج هذه القطرات بالتسلسل مع قطرتين أخريين: قطيرة واحدة تحتوي على كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل وقطيرة تشفير شريطية واحدة. يتم تدوير القطرات التي تم الحصول عليها حراريًا للسماح بتضخيم المنتج وربط المحول P5 و P7 المطلوب لتسلسل Illumina. بعد إعداد المكتبة ، يتم تجميع القطرات معًا للتسلسل. يتم تصفية بيانات التسلسل من أجل الجودة وتجميعها حسب الرمز الشريطي ، مما يوفر تسلسلًا جينيًا لجميع الخلايا.

تتمتع SiC-seq بالعديد من المزايا مقارنة بأدوات تحليل الخلية المفردة للجينوم المستهدفة الموضحة أعلاه. أولاً ، يسمح SiC-seq بتحليل غير متحيز لجينوم الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تنفيذ جميع الخطوات باستخدام الموائع الدقيقة ، والحد من خطوات المناولة اليدوية وزيادة قابلية التكاثر. ومع ذلك ، فإن معالجة الموائع الدقيقة أكثر تعقيدًا وتستغرق وقتًا طويلاً مقارنة بأساليب تحليل الجينوم المستهدف.

4.2.3 التطورات التجارية

تم تقديم تباين رقم نسخة الخلية الواحدة (CNV) إلى السوق بواسطة 10X Genomics لدراسة التغاير الجينومي للخلية الواحدة وتطور النسيلة بطريقة إنتاجية عالية (مئات إلى آلاف الخلايا) ، 68 يظهر سير عمل CNV في الشكل 6 ب. أولاً ، يتم تغليف الخلايا المفردة عند الحد من التخفيف في مصفوفة هلامية مع جزيئات مغناطيسية داخل شريحة ميكروفلويديك أحادية الاستخدام. بمجرد أن تتبلور القطرات ، تحبس الخلايا داخل الحبيبات وتتعرض للتحلل يليها إزالة جميع البروتينات النووية ، بينما يظل الحمض النووي الجيني محاصرًا في مصفوفة الهلام. بعد ذلك ، يتم تغليف الحمض النووي الجيني المنقى داخل حبات الخلية بشكل مشترك في جهاز ميكروفلويديك ثاني مع خرز باركود (حبات جل مشفرة 10x) وأنزيمات. الأهم من ذلك ، أن كل من حبات الخلية وحبات الترميز الشريطية معبأة عن كثب ، مما يسمح بتغليف مشترك عالي الكفاءة لخرزة خلية واحدة وحبة باركود واحدة في كل قطرة (80 ٪ من القطرات تحتوي على حبة خلية واحدة وحبة شريطية واحدة). يتم تضخيم الحمض النووي داخل القطيرة لإنشاء مكتبات باركود أحادية الخلية جاهزة للتسلسل والتحليل. الأهم من ذلك ، أن كل الحمض النووي الذي تم إنشاؤه من الخلايا الفردية يشترك في رمز شريطي مشترك 10x.

من الجدير بالذكر أنه بسبب الخسارة الأخيرة لدعوى براءة اختراع رفعتها شركة Bio-Rad بشأن استخدام قنوات غير مفلورة ، كان على 10X Genomics تغيير تصميم أجهزتها. يبدو أن "شريحة GEM التالية" الجديدة تستخدم الاستحلاب التدريجي بدلاً من التركيز على التدفق لتوليد القطيرات ، على الرغم من أننا لا نستطيع التحقق من ذلك في الوقت الحالي.


2 قطرات وحويصلات

القطرات عبارة عن كيانات سائلة تتطلب درجة من عدم الامتزاج بين مرحلتين على الأقل (غاز - سائل أو سائل - سائل) ، ويمكن أن تؤدي التفاعلات الجذابة والمثيرة للاشمئزاز بين الجزيئات في الواجهة إلى توتر سطحي ، والذي يحدد من بين أمور أخرى الأشياء على شكل قطرة. تشمل الأمثلة القياسية قطرات الماء في الهواء [95] وقطرات الماء في الزيت [5] وقطرات الزيت في الماء [24]. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تنقسم الجزيئات بشكل تفضيلي إلى الماء أو المرحلة الزيتية ، اعتمادًا على خصائصها المحبة للماء أو الكارهة للماء. على سبيل المثال ، تستخدم الأصباغ القابلة للذوبان في الزيت (على سبيل المثال ، Oil Red O ، و Sudan Black) لتصور أفضل لمراحل الزيت ، بينما تذوب الأملاح غير العضوية (على سبيل المثال ، NaCl) بشكل تفضيلي في المراحل المائية. ومع ذلك ، فإن المواد الخافضة للتوتر السطحي ، وهي جزيئات برمائية تحتوي على كل من المجموعات المحبة للماء والطارئة للماء ، تتجمع ذاتيًا على حدود المرحلة (الشكل 1).المواد الخافضة للتوتر السطحي هي مركبات نشطة السطح يمكنها تقليل التوتر السطحي بين المرحلتين. يمكن بالطبع أن تتشكل القطرات أيضًا في غياب المواد الخافضة للتوتر السطحي ، ولكن الجزيئات النشطة السطحية التي تتجمع ذاتيًا عند حدود القطرات مفيدة في تعديل التوتر البيني للواجهة وبالتالي خصائص وسلوك القطرات. الغرض الآخر من المواد الخافضة للتوتر السطحي هو تثبيت القطرات عن طريق خفض التوتر السطحي بشكل عام وقمع اندماج القطيرات.

(أ) تمثيل لجزيء خافض للتوتر السطحي برمائي يتكون من رأس محب للماء يقسم بشكل تفضيلي في الطور المائي وذيل كاره للماء الذي ينقسم بشكل تفضيلي في الطور الزيتي. البنى المختلفة للمواد الخافضة للتوتر السطحي في أنظمة متعددة الأطوار مرتبة بشكل مختلف: (ب) قطيرة الزيت في الطور المائي ، (ج) القطرة المائية في الطور الزيتي ، (د) الحويصلة المكونة من طبقة ثنائية الفوسفوليبيد.

(أ) تمثيل لجزيء خافض للتوتر السطحي برمائي يتكون من رأس محب للماء يقسم بشكل تفضيلي في الطور المائي وذيل كاره للماء الذي ينقسم بشكل تفضيلي في الطور الزيتي. البنى المختلفة للمواد الخافضة للتوتر السطحي في أنظمة متعددة الأطوار مرتبة بشكل مختلف: (ب) قطيرة الزيت في الطور المائي ، (ج) القطرة المائية في الطور الزيتي ، (د) الحويصلة المكونة من طبقة ثنائية الفوسفوليبيد.

عندما يتم تغطية القطرة المائية بطبقة دهنية ثنائية مستمرة في مرحلة مائية سائبة ، فإنها تسمى حويصلة [11]. تحدد جزيئات البرمائيات المجمعة ذاتيًا على سطح الحويصلة الحويصلة. من حيث المبدأ ، الحويصلة عبارة عن قطرة ماء في زيت في ماء ذات قلب مائي يمكن أن يحتوي على جزيئات قابلة للذوبان في الماء وغشاء ثنائي الطبقة حيث يمكن دمج الجزيئات القابلة للذوبان في الزيت. تنتشر الحويصلات في طور الماء المستمر ويتراوح حجمها من عشرات النانومتر إلى مئات الميكرومترات. بالنسبة للحويصلات المصطنعة التي تستخدم الفسفوليبيدات أو الدهون المشتقة من الأغشية الحيوية ، فإن المصطلح الجسيمات الشحمية غالبًا ما تستخدم ، وتتراوح تطبيقات الجسيمات الشحمية من الخلايا الاصطناعية [60] إلى توصيل الأدوية إلى الحاويات الدقيقة [98].

يمكن إنتاج القطرات بطرق مختلفة. لإنتاج قطرة واحدة أو بضع قطرات ، يمكن أن يكون مجرد إسقاط السائل من الماصة الدقيقة أو المحقنة كافيًا. يمكن إنتاج كميات كبيرة من القطرات من خلال مجموعة واسعة من التقنيات بما في ذلك ، على سبيل المثال ، البخاخات ، وأجهزة البخاخات ، والمجانسات من تصميمات مختلفة. ستنتج هذه التقنيات آلافًا إلى ملايين القطيرات المنتشرة في المرحلة المستمرة كمستحلبات. تشتمل الأبنية النموذجية على الزيت في الماء (الشكل 1 ب) أو الماء في الزيت (الشكل 1 ج) ، ولكن توجد أيضًا منظمات أكثر تعقيدًا مثل المستحلبات المزدوجة [36]. تم إثبات استخدام المنصات الروبوتية والموائع الدقيقة لتوليد القطيرات وتحليلها [43 ، 47 ، 49 ، 59 ، 74]. بشكل عام ، يمكن إنتاج القطرات بسهولة. ومع ذلك ، يتم تحقيق الاستقرار على المدى الطويل عادة من خلال وجود المواد الخافضة للتوتر السطحي ، والتي تزيد من الاستقرار الحركي للنظام.


تنشيط الفلورة الفرز الخلوي للخلايا الحية

وصف لفرز الخلايا النشطة الفلورية لمجموعات الخلايا الحية.

يعمل فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) للخلايا الحية على فصل مجموعة من الخلايا إلى مجموعات فرعية بناءً على وضع العلامات الفلورية. يتضمن الفرز آليات أكثر تعقيدًا في مقياس التدفق الخلوي مقارنة بالتحليل غير الفرز. يمكن فصل الخلايا الملطخة باستخدام الأجسام المضادة المرتبطة بالفلوروفور عن بعضها البعض اعتمادًا على حامض الفلور الذي تم تلطيخه به. على سبيل المثال ، يمكن اكتشاف خلية تعبر عن علامة خلية واحدة باستخدام جسم مضاد مترافق مع FITC يتعرف على العلامة ، ويمكن اكتشاف نوع خلية آخر يعبر عن علامة مختلفة باستخدام جسم مضاد مترافق مع PE خاص بتلك العلامة. هذه هي المهمة الأساسية لقياس التدفق الخلوي.

يذهب فرز الخلايا الحية إلى أبعد من ذلك:

  1. يتم "استجواب" الخلايا الفردية بواسطة الليزر كما هو الحال في مقياس التدفق الخلوي الطبيعي.
  2. تم إعداد الجهاز بحيث تدخل كل خلية فردية بعد ذلك قطرة واحدة حيث تغادر طرف الفوهة. يتم إعطاء هذا القطرة شحنة إلكترونية ، اعتمادًا على تألق الخلية داخل القطرة.
  3. تجذب لوحات الانحراف الخلايا أو تطردها وفقًا لذلك في أنابيب التجميع.

خلية واحدة ملطخة FITC في قطيرة واحدة ستعطى شحنة موجبة وتنجذب إلى اليمين. تجمع أنابيب التجميع الموجودة على اليمين جميع قطرات الخلايا الملطخة FITC المشحونة إيجابياً.

تحتاج الخلايا إلى البقاء على قيد الحياة ودون تلوث للثقافة اللاحقة. انظر النصائح أدناه.


علم قذرة أم فكرة رائدة؟ تقسم نظرية كيفية تنظيم الخلايا للمحتويات علماء الأحياء

لمدة 7 سنوات كرئيس لمعهد هوارد هيوز الطبي ، ساعد روبرت تجيان في توجيه مئات الملايين من الدولارات للعلماء الذين يبحثون عن أفكار استفزازية قد تغير علم الأحياء والطب الحيوي. لذلك كان عالم الكيمياء الحيوية مفتونًا منذ عامين عندما كشف طالب الدراسات العليا ديفيد مكسويجن عن بيانات من المحتمل أن تغذي الإثارة حول عملية تسمى فصل الطور ، وهي بالفعل واحدة من أهم المفاهيم في بيولوجيا الخلية.

يعتقد دعاة فصل الطور أن البروتينات والجزيئات الأخرى تنتظم ذاتيًا في هياكل أكثر كثافة داخل الخلايا ، مثل قطرات الزيت التي تتشكل في الماء. يؤكد المؤيدون أن هذا الفرز التلقائي يعمل كآلية غير معترف بها سابقًا لترتيب محتويات الخلية وحشد الجزيئات اللازمة لتحريك الأحداث الخلوية الرئيسية. وجد McSwiggen تلميحات إلى أن الفصل الطوري يساعد فيروسات الهربس على التكاثر داخل الخلايا المصابة ، مما يضيف إلى الادعاءات بأن العملية تلعب دورًا في وظائف متنوعة مثل تشغيل الجينات ، وترسيخ الهيكل الخلوي ، وإصلاح الحمض النووي التالف. يقول عالم الفيزياء الحيوية كليفورد برانجوين من جامعة برينستون: "من الواضح جدًا أن هذه العملية تلعب دورًا في جميع أنحاء الخلية".

صناعة الأدوية متحمسة مثل بعض الباحثين الأكاديميين ، بالنظر إلى الدراسات التي تربط الفصل المرحلي بالسرطان والتصلب الجانبي الضموري (ALS) والسكري وأمراض أخرى. وقعت شركة Dewpoint Therapeutics ، وهي شركة ناشئة تسعى لعلاجات طبية تستهدف القطرات الخلوية ، مؤخرًا صفقات تطوير بقيمة تزيد عن 400 مليون دولار مع شركتي الأدوية العملاقين Merck و Bayer. وفتحت ثلاث شركات أخرى تسعى لاستغلال العملية أبوابها أواخر العام الماضي. يعكس هذا الحماس ، علم اختارت فصل المرحلة كوصيف في إصدار 2018 Breakthrough of the Year.

يقول Tjian إنه كان محايدًا في البداية بشأن أهمية العملية. ولكن بعد أن ألهمته نتائج McSwiggen وزملائه للنظر عن كثب في مجموعة الادعاءات ، بدأ الباحثون في الشكوك. يجادل Tjian ومعسكر من علماء الأحياء المتشككين بالمثل الآن بأن الدليل على أن المكثفات الشبيهة بالسائل تنشأ بشكل طبيعي في الخلايا هي إلى حد كبير نوعي ويتم الحصول عليها بتقنيات تسفر عن نتائج ملتبسة - باختصار ، يعتقدون أن الكثير من البحث رديء.

علاوة على ذلك ، فإن الحجة القائلة بأن هذه القطيرات داخل الخلايا تؤدي أدوارًا مهمة "انتقلت من عقيدة افتراضية إلى عقيدة راسخة بدون بيانات" ، كما يقول تجيان ، الذي استقال من منصب رئيس هوارد هيوز في عام 2016 ويشارك الآن في إدارة مختبر في جامعة كاليفورنيا ( جامعة كاليفورنيا في بيركلي. "هذا بالنسبة لي هو أمر منحرف ومدمّر لعملية الاكتشاف العلمي."

على الرغم من أن مؤيدي فصل الطور يلجأون إلى بعض هذه الانتقادات ، يتفق العديد من العلماء على أن البحث يتطلب هزة من الصرامة. تقول عالمة الفيزياء الحيوية ستيفاني ويبر من جامعة ماكجيل: "لا أعتقد أن المجال بأكمله فارغ". "لكننا بحاجة إلى أن نكون أكثر حرصًا" في تحديد حالات فصل الطور في الخلايا وإسناد الوظائف إليها.

قد تكون هذه العملية أقل أهمية مما يؤكده العديد من العلماء الآن ، كما تضيف عالمة أحياء الخلية الكمية آمي جلادفيلتر من جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل. وتقول إن بعض الباحثين حاولوا جعلها "الإجابة على كل شيء".

يمكن أن يجيب فصل الطور عن سؤال أساسي أزعج علماء الأحياء لأكثر من 100 عام: كيف ترتب الخلايا محتوياتها بحيث تكون الجزيئات اللازمة للقيام بوظيفة معينة في المكان المناسب في الوقت المناسب؟ تتمثل إحدى الطرق الواضحة في الأغشية الداخلية ، مثل تلك التي تحاصر أجسام جولجي والميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن العديد من الهياكل الخلوية الأخرى المعروفة ، بما في ذلك النواة - وهي عضية داخل النواة - وأجسام كاجال التي تعالج الحمض النووي الريبي تفتقر إلى الأغشية.

فصل الطور هو إجابة جذابة. تحتوي العديد من البروتينات على بقع لزجة تجذب بروتينات أخرى من نفس النوع أو من نوع مختلف. أظهرت دراسات أنبوب الاختبار أنه في ظل ظروف معينة ، مثل عندما يرتفع تركيز البروتين فوق مستوى معين ، قد تبدأ الجزيئات في التجمع مكونة مكثفات تشبه القطرات. يفهم الباحثون الآليات بشكل أفضل بالنسبة للبروتينات ، لكن الأحماض النووية مثل RNA يمكن أيضًا أن تتجمع مع البروتينات. إذا حدثت العملية في الخلية ، يمكن أن تولد العضيات وتحافظ عليها وتسمح بوظائف فريدة. يقول عالم الفيزياء الحيوية مصطفى مير من جامعة بنسلفانيا ، والذي عمل سابقًا مع Tjian بصفته باحثًا ما بعد الدكتوراة: "إنه مبدأ يمكن أن يفسر عدد الأشياء المنظمة في الخلية والنواة".

على الرغم من أن علماء الأحياء ناقشوا دورًا للقطرات داخل الخلايا منذ فترة ترجع إلى تسعينيات القرن التاسع عشر ، إلا أن الأدلة على أنها حيوية بدأت في الاندماج منذ ما يزيد قليلاً عن 10 سنوات. كان برانجوين ، الذي كان حينها باحثًا في مرحلة ما بعد الدكتوراة مع عالم الأحياء الخلوية أنتوني هايمان في معهد ماكس بلانك لبيولوجيا الخلايا الجزيئية وعلم الوراثة ، يتتبع حبيبات P ، وبقع من البروتين والحمض النووي الريبي ، والتي في أجنة النيماتودا ، تحدد الخلايا التي تستمر في إنتاج الحيوانات المنوية والبيض. لمراقبة حركات الحبيبات ، قام Brangwynne بعصر مناسل الديدان التي تؤوي الهياكل بين انزلاقي غطاء المجهر. تحت الضغط ، استجابت حبيبات P ليس مثل المواد الصلبة ولكن مثل السوائل ، تتدفق على طول سطح النواة وتقطر ، كما أفاد Brangwynne و Hyman وزملاؤهم في علم في عام 2009. كان السلوك المائي للحبيبات "مذهلاً. كان الأمر مختلفًا تمامًا عن أي شيء آخر في الزنزانات "، كما يقول ويبر ، وهو باحث سابق لما بعد الدكتوراة في جامعة برانجوين.

أصبحت حبيبات P (الخضراء) ، وجيوب البروتين والحمض النووي الريبي في أجنة الدودة المبكرة التي تحدد مكان ظهور الحيوانات المنوية أو خلايا البويضات ، المثال الكلاسيكي للمناطق المنفصلة الطور في السيتوبلازم.

في عام 2012 ، رأى برانجوين وزملاؤه سمات سائلة مماثلة في النواة ، وهي مزيج كثيف من البروتينات ، والحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الذي يصنع الريبوسومات ، وهي مصانع بروتين الخلية. في نفس العام ، أظهر الفيزيائي الحيوي مايكل روزن من مركز ساوثويسترن الطبي بجامعة تكساس وزملاؤه أن ثلاثة بروتينات تتعاون لتنظيم جزء من الهيكل الخلوي تشكل قطرات سائلة في محلول أنبوب اختبار. ووجدوا أن هذه العملية تسرع من عملية تجميع نوع واحد من الألياف الهيكلية في المختبر ، ويمكن أن تفعل الشيء نفسه في الخلية. أبلغ العلماء منذ ذلك الحين عن عشرات الأمثلة من الهياكل الخلوية المستديرة ، والمعرضة للانصهار ، والتي تميل إلى الانسياب على الأسطح أو التدفق عبرها - وهي السمات المميزة للقطرات التي تشكلت بفصل الطور.

لتأكيد أن التجمع الجزيئي في الخلية هو سائل وليس شيئًا أكثر صلابة ، غالبًا ما ينشر العلماء تقنية تسمى الاسترداد الفلوري بعد التبييض الضوئي (FRAP). باستخدام خلية تحتوي على بروتينات فلورية ، يقوم الباحثون بصعق المنطقة المعنية باستخدام الليزر لتغميق الجزيئات ثم تتبع المدة التي يستغرقها التألق للانتشار مرة أخرى من أجزاء أخرى من الخلية. يجب أن يضيء السائل ، الذي تخترقه البروتينات الفلورية بسهولة ، بسرعة أكبر من المادة الصلبة. يتضمن اختبار آخر تطبيق 1،6-hexanediol ، وهو مركب يكسر بعض التفاعلات الجزيئية التي تربط القطرات معًا لتحديد ما إذا كانت البنية تذوب.

يشير روزن إلى أن ثلاث أوراق بحثية نُشرت العام الماضي في زنزانة تقدم بعضًا من أقوى الأدلة على الفصل الطوري في الخلايا. أظهر أحدهما ، من مختبر Brangwynne ، أن بروتينًا معينًا يجب أن يصل إلى تركيز عتبة في الخلايا للسماح بتكوين حبيبات الإجهاد - العضيات التي تظهر خلال الأوقات الصعبة والتي تُعزى إلى فصل الطور. كما حددت الدراستان الأخريان شروط العتبة لفصل الطور. نظرًا لأن العتبة هي سمة من سمات العملية ، فإن الدراسات توفر "بيانات جيدة ولكنها ليست كاملة تفيد بأن هذه الهياكل تمر بفصل الطور" ، كما يقول روزين.


المكثفات: مبدأ تنظيم جديد في الخلايا؟

لقد كتبت قبل عامين عن فكرة & # 8220condensates & # 8221 داخل الخلايا & # 8211 قطرات شبيهة بالسائل من البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى التي ترتبط ببعضها البعض بتركيز عالٍ. هذه & # 8217 فكرة غريبة بالنسبة لمعظمنا جميعًا ، لأننا اعتدنا على التفكير في أن مقصورات الخلايا محاطة بالغشاء وأن التشريح الخلوي أكثر قليلاً. . .معرف. من ناحية أخرى ، فإن المكثفات هي عكس ذلك تمامًا: لا يوجد كيس حولها ، ويمكن أن تتشكل وتندمج وتفكك نفسها بشكل أو بآخر من تلقاء نفسها. شوهدت هذه الأنواع من الأشياء داخل الخلايا لسنوات عديدة ، وتم تسميتها بأسماء مختلفة (بقع نووية ، أجسام كاجال ، أجسام U و P ، نظارة ، وما إلى ذلك) ، دون أن يكون هناك الكثير من مفهوم موحد عنها.

لقد بدأ هذا المجال بالفعل مؤخرًا & # 8211 هنا & # 8217s مراجعة من العام الماضي & # 8211 و # 8217s يبدو أكثر فأكثر مثل هذا يمكن أن يكون عملية أساسية في بيولوجيا الخلية التي (حتى وقت قريب) نحن & # 8217ve تمامًا مفتقد. يمكن أن يكون مهمًا جدًا بالفعل في النسخ ، على سبيل المثال. كما ذكرنا في ذلك المنشور السابق ، يبدو أن البروتينات المضطربة جوهريًا من المرجح بشكل خاص أن تشكل هذه المكثفات ، وبروتينات عامل النسخ تشتهر بهذه الخاصية.

تحديث: هنا & # 8217s نظرة عامة على الأخبار السارة في المجال الذي ظهر مؤخرًا في Nature.

إن التفكير بهذه المصطلحات يفتح حقًا الكثير من الاحتمالات. كان من الصعب دائمًا التوصل إلى صورة ذهنية واقعية لما يحدث بالفعل في الخلية الحية ، تلك الكتلة الشبيهة بالهلام والتي تتكون من آلاف وآلاف من البروتينات التي تطفو في حساء من الأيونات والجزيئات الصغيرة والأيضات و ماذا لديك. قد يكون ، في الواقع ، أن بعض هذه الأنواع الأخرى متورطة في سلوك قطيرات المكثفات المنفصلة طورًا. هناك & # 8217s اقتراح بأن ATP ليس فقط العملة النشطة الرئيسية للخلية الحية ، ولكن له وظيفة أخرى كـ & # 8220 hydrotrope & # 8221 ، وهو جزيء & # 8217s ينظم في الواقع قابلية ذوبان البروتينات الكارهة للماء وسلوك تكثيفها . قد يفسر ذلك سبب وجوده & # 8217s بتركيزات أعلى مما تعتقد & # 8217d أن الخلايا ستحتاج إلى أسباب حيوية بحتة.

جانب آخر مثير للاهتمام هو النطاق الزمني المتضمن. نحن نعرف الكثير عن مجاميع البروتين غير القابلة للانعكاس ، والتي تتطور في الخلايا على مدى سنوات (أميلويد ، وهنتنغتين ، وغيرها الكثير). على الرغم من ذلك ، فإن المكثفات قابلة للانعكاس ويمكن أن تتشكل وتعديل وتشتت على مقياس زمني من الثواني إلى الدقائق ، مما يضعها في النطاق المناسب لكثير من بيولوجيا الخلية. هذا النوع من الأشياء له أيضًا آثار واضحة على نظريات أصل الحياة ، إذا كان بإمكانك البدء في الحصول على تمايز بين الوظائف دون الحاجة إلى وجود أغشية (على الرغم من أن هناك & # 8217s لا يزال دورًا واضحًا لامتلاك كيس حول كل شيء في الخلية- مستوى الغشاء). هل كان هناك ضغط تطوري لهذا النوع من السلوك في تسلسل البروتين؟

هناك الكثير من الأسئلة المفتوحة. بصفتي كيميائيًا طبيًا ، أجد نفسي أتساءل عن قابلية ذوبان جزيئات الدواء في هذه البيئات. كنت بصدد قول & # 8220 مقابل المرحلة الأكبر & # 8221 ، لكن عليك حقًا أن تتساءل عما إذا كان هناك يكون مرحلة مجمعة داخل الخلية. نقول بلا مبالاة & # 8220cytoplasm & # 8221 لوصف ذلك الجزء الداخلي ، ولكن قد تكون هذه حالة تشريع & # 8211 صنع شيء لا يوجد فيه شيء محدد يجب صنعه. يبدو الأمر أكثر فأكثر أن الوضع الحقيقي غير متجانس أكثر مما كنا نعتقد ، وأن الفيزيائيين وكيميائيين البوليمرات قد يخبروننا بما يحدث كما يفعل علماء الأحياء الخلوية. بالتأكيد منطقة يجب مراقبتها.


شاهد الفيديو: كشف غش تجار زيوت السيارات (شهر نوفمبر 2022).