معلومة

هل يمكن أن تتشكل حلقات الحمض النووي ، أي البلازميدات ، على شكل شرائح موبيوس؟

هل يمكن أن تتشكل حلقات الحمض النووي ، أي البلازميدات ، على شكل شرائح موبيوس؟


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أعلم أن البلازميدات يمكن أن تكون موجودة في شكل ملفوف ، مما يحافظ على خيوط الحمض النووي معًا عندما تتحلل ، عن طريق تكوين catenases.

ومع ذلك ، كنت أتساءل عما إذا كان قد تم توثيق حدوثه بشكل طبيعي أو ما إذا كان أي شخص قد نجح في إنشاء بلازميد شريط موبيوس. من الناحية الفنية ، يمكن لمثل هذا الهيكل أن يتشكل بسهولة من خيط دائري واحد من الحمض النووي ، لكن الأدبيات ، بقدر ما بحثت ، ظلت صامتة.


العقد والأسطح غير القابلة للتوجيه في الديدان اللولبية

تُثري العقد والحقول المعقدة ظواهر فيزيائية تتراوح من الحمض النووي والكيمياء الجزيئية إلى دوامات تدفقات السوائل وتركيب الوسائط المنظمة. توفر البلورات السائلة بيئة مثالية لاستكشاف مثل هذه الظواهر الطوبولوجية من خلال التحكم في عيوبها المميزة. تم إثبات استخدام الغرويات في توليد العيوب والتكوينات المعقدة في البلورات السائلة للجزيئات الكروية والحلقية وتبشر بالخير لتطوير أجهزة فوتونية جديدة. لتوسيع هذا العمل الحالي ، نصف الآثار الطوبولوجية الكاملة للغرويات التي تمثل الأسطح غير القابلة للتوجيه ونستخدمها لبناء عقدة حلقية وروابط من النوع (ص، 2) حول مضاعفة شرائح موبيوس الملتوية.

يعد التحكم في التركيبات المعقدة ثلاثية الأبعاد وتصميمها في الوسائط المرتبة أمرًا أساسيًا لتطوير المواد المتقدمة والبلورات الضوئية والأجهزة أو المستشعرات القابلة للضبط والمواد الخارقة (1 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –10) ، بالإضافة إلى تعزيز فهمنا الأساسي الميزوفاس (11 –13). أصبحت المفاهيم الطوبولوجية ، على وجه الخصوص ، تلعب دورًا متزايد الأهمية في توصيف المواد عبر مجموعة متنوعة من الموضوعات من الحلزونية في تدفقات السوائل (14 ، 15) والانتقالات في أفلام الصابون (16) إلى الكيمياء الجزيئية (17) ، والعقد في الحمض النووي (18) ، عيوب في الوسط المرتب (19 ، 20) ، الحساب الكمي (21 ، 22) ، والعوازل الطوبولوجية (23). الخصائص الطوبولوجية قوية ، لأنها محمية من جميع التشوهات المستمرة ، ومع ذلك فهي مرنة لنفس السبب ، مما يسمح بالضبط دون فقدان الوظيفة.

تتضمن بعض القوام الأكثر تعقيدًا وإثارة للاهتمام في الوسائط المرتبة عقدًا. نشأت فكرة اللورد كلفن عن نظرية "ذرة دوامة" (24) ، واستمرت فكرة ترميز الهياكل المعقدة في الحقول المستمرة في الديناميكا المائية المغناطيسية (25) ، وديناميكا الموائع (15) ، وفيزياء الطاقة العالية (26 -28) ، والكهرومغناطيسية الحقول (29 ، 30) ، وشهدت الإنجازات التجريبية الحديثة في البصريات (31) ، والبلورات السائلة (32) ، ودوامات السوائل (33). ربط العقد في مجال مستمر ينطوي على مستوى تعقيد أكبر بكثير مما هو عليه في ربطة العنق ، أو الحبل ، أو حتى البوليمر أو حبلا من الحمض النووي. في الحقل ، تُحاط العقدة بمواد يجب تكوينها بدقة بحيث تكون متوافقة مع المنحنى المعقود. ومع ذلك ، فإن هذا التعقيد يجلب فوائده الخاصة ، لأن الثراء الكامل للنظرية الرياضية للعقد يتم التعبير عنه بشكل طبيعي من حيث خصائص تكملة العقدة: كل شيء ليس عقدة. وبهذا المعنى ، فإن الحقول المعقدة مناسبة بشكل مثالي لدمج النطاق الكامل لنظرية العقدة الحديثة وإدراكها بشكل تجريبي.

البلورات السائلة عبارة عن أطوار متوسطة مرتبة حسب التوجه ، والتي يوفر مزيجها الفريد من المرونة اللينة والنشاط البصري والطبيعة السائلة بيئة خصبة لتطوير مواد خارقة جديدة ودراسة الطوبولوجيا منخفضة الأبعاد في الوسائط المرتبة. يركز الكثير من التركيز الحالي على الأنظمة الغروية - الجسيمات الغروية المنتشرة في مضيف بلوري سائل - والتي لها طابع مزدوج. من ناحية ، تتوسط البلورة السائلة تفاعلات مرنة طويلة المدى بين الغرويات ، مما يوفر آلية لتشكيل الهياكل الغروية والمواد الفوقية (1 –3 ، 10). من ناحية أخرى ، فإن الغرويات ، من خلال ظروف التثبيت التي تفرضها أسطحها ، تولد عيوبًا في البلورة السائلة وبالتالي تعمل على تحفيز خصائصها الطوبولوجية والتلاعب بها. على سبيل المثال ، تُظهر الغرويات المتعددة مجموعة متنوعة من تكوينات العيوب المتشابكة (34 ، 35) ، وحالات مثيرة للاهتمام بنفس القدر بدون عيوب (36) ، ويمكن حتى التلاعب بها لتشكيل عقدة وروابط عشوائية (32 ، 37). في الآونة الأخيرة ، شهد تقدم كبير في تصنيع الغرويات بطوبولوجيا مختلفة (38) - توري حتى الجنس الخامس - التحقق تجريبيًا من العلاقة بين طوبولوجيا الجسيمات وشحنة الخلل المصاحبة ، وتطوير برنامج للحصول على التحكم الطوبولوجي للمواد من خلال التصميم الطوبولوجي. على الرغم من أن الظواهر التي تعرضها هذه الأنظمة غنية بالفعل ، حيث أن هذه الغرويات (الكرات ، والتوري ، وما إلى ذلك) تمثل جميعها أسطحًا مغلقة وقابلة للتوجيه.

في هذه المقالة نوسع هذه الأفكار لتوفير توصيف طوبولوجي كامل لجميع الأسطح الغروانية المدمجة في مضيف بلوري سائل. تستغل الأسطح غير القابلة للتوجيه بشكل كامل الطبيعة غير القابلة للتوجيه للنظام البلوري السائل (39). توجد على جميع الأسطح غير القابلة للتوجيه ، بالضرورة ، مسارات مغلقة يعكس السطح الطبيعي اتجاهها حولها. بالنسبة للأسطح ذات التثبيت العادي ، فإن هذا يطبع انعكاسًا مناظرًا في حقل المخرج ، وهو التوقيع المنبّه لخط الكشف. بهذه الطريقة ، تفرض الأسطح غير القابلة للتوجيه إنشاء خطوط إزاحة محمية طوبولوجيًا. من خلال تغيير عمليات التضمين على السطح ، نستغل هذه الهيكلية لإنشاء حلقات كشف ثابتة في شكل عقدة وروابط طارة ، لأي صحول ضرب عصابات موبيوس الملتوية. من خلال هذا المزيج من الهندسة والطوبولوجيا ، نوضح الإعداد الطبيعي لإنشاء الحقول المعقدة المعقدة والتحكم فيها ودمج نظرية العقدة الرياضية في العلوم التجريبية.


مقدمة

الاقتران البكتيري هو العملية التي يتم من خلالها نقل الحمض النووي بشكل أحادي الاتجاه من خلية مانحة إلى خلية متلقية. يلعب دورًا حاسمًا في نقل الجينات الأفقي ، وهو الوسيلة الرئيسية التي تتطور بها البكتيريا وتتكيف مع بيئتها ، وأيضًا عملية ذات أهمية طبية حيوية هائلة لأن الاقتران هو الناقل الرئيسي لانتشار الجينات المقاومة للمضادات الحيوية. تم وصفه لأول مرة بواسطة Lederberg و Tatum في الأربعينيات 1. يشير اكتشافه إلى فجر البيولوجيا الجزيئية بمجرد إثبات أن نقل المعلومات الجينية كان أحادي الاتجاه وأن الجينوم بأكمله لـ الإشريكية القولونية يمكن أن تنتقل من خلية إلى أخرى بدءًا من موقع محدد 2. في الواقع ، اتبعت الاكتشافات التاريخية: رسم خرائط بكتريا قولونية الجينوم (يتم تعيينه في "دقائق" ، أي الوقت الذي يستغرقه جين معين ليتم نقله من متبرع إلى متلقي ، مع كون الوقت 0 هو بداية التزاوج - عندما يتم وضع خلايا المتبرع والمتلقي في وجود بعضها البعض) أو اكتشاف هيكل وتنظيم الجينات (يرجى الرجوع إلى الوصف الرائع لهذا البحث في محاضرات نوبل للآباء المؤسسين لمجال البيولوجيا الجزيئية ، فرانسوا جاكوب ، وأندريه لووف وجاك مونود في عام 1965 3).

عادةً ما يتم ترميز الأجهزة المختلفة المستخدمة أثناء الاقتران لتنفيذ نقل الحمض النووي بواسطة البلازميدات المقترنة أو العناصر الوراثية المتحركة الأخرى مثل العناصر المقترنة المتكاملة (ICE). تنتشر البلازميدات في كل مكان في البكتيريا وتُعرَّف بأنها مجموعة من الوحدات الجينية منظمة في رِبلكون مستقر ، دائري عادةً ، ذاتي التكاثر ، والذي لا يحتوي عادةً على الجينات الضرورية لوظائف الخلية (راجع المرجع 4). تحتوي العديد من هذه الوحدات على جينات تشفر البروتينات التي تتجمع في مجمعات كبيرة تتوسط في الغالب نقل البلازميد نفسه إلى خلية بكتيرية متلقية ، ولكن أيضًا بشكل مثير للاهتمام (ولكن نادرًا) إلى خلية حقيقية النواة مثل الخميرة أو الخلايا النباتية أو البشرية 5-7. ومن المثير للاهتمام أن هذه الوحدات تطورية مرتبطة بالعناقيد الموجودة في الجزر الجينومية لعدد محدود من مسببات الأمراض البكتيرية مثل هيليكوباكتر بيلوري, البورديتيلة السعال الديكي أو البكتيريا المستروحة حيث يلعبون أدوارًا أساسية في الإمراضية عن طريق حقن مؤثرات البروتين في مضيفات حقيقية النواة 8 (الشكل 1).

الشكل 1. العمليات المختلفة التي تشارك فيها أنظمة T4S

يتم التوسط في الاقتران في البكتيريا سالبة الجرام بواسطة ثلاثة مجمعات كبيرة: آلة معالجة الحمض النووي تسمى "الاسترخاء" وهي آلية نقل مضمنة في الغشاء تسمى "نظام الإفراز من النوع الرابع (T4S)" و Pilus 9.

يبدأ الاقتران بتجميع المادة المرتخية في موقع معين على DNA البلازميد يسمى "أصل النقل" أو OriT. يحتوي الاسترخاء على بروتين رئيسي واحد يسمى "Relaxase" وعدد من البروتينات الملحقة. يلعب Relaxase أدوارًا أساسية: (1) يحفز تفاعلًا شائكًا على خيط واحد من OriT DNA في ما يسمى جيد الموقع ويتفاعل بشكل تساهمي مع 5-فوسفات الناتج عن تفاعل الخدش و (2) يرتبط بنظام T4S من خلال التفاعلات مع أحد مكونات آلية النقل ، بروتين الاقتران (تمت مراجعته في المرجع 10).

نظام T4S هو واحد من ستة أنظمة إفراز مدمجة في كلا أغشية البكتيريا سالبة الجرام 11. الحد الأدنى ، تتكون من 12 بروتينًا يسمى "VirB1-11 و VirD4" (لاستخدام تسمية التسمية المشتقة من أغروباكتريوم توميفاسيانز نظام T4S) 12. ثلاثة مكونات ، VirB7 ، VirB9 و VirB10 ، تشكل ما يسمى بمركب الغشاء الخارجي (OMCC) ، غائب في أنظمة T4S إيجابية الجرام حيث لا يوجد OM 13. يتصل OMCC بمجمع الغشاء الداخلي (IMC) المكون من VirD4 و VirB4 و VirB3 و VirB6 و VirB8 وجزء من VirB10. يتم توصيل OMCC و IMC من خلال ساق مجهول التكوين ، ربما يكون مصنوعًا من VirB2 و VirB5 14 أو VirB10 14-16. يشغِّل النظام ما لا يقل عن اثنين من ATPases (VirB4 و VirD4) ، أو في بعض الأحيان ثلاثة (VirB4 و VirD4 و VirB11).

أخيرًا ، يعتبر العمود المقترن للبكتيريا سالبة الجرام عنصرًا أساسيًا في الاقتران. لعقود من الزمان ، كانت السمة الوحيدة في تصريف الخلايا التي يمكن ملاحظتها أو تنقيتها 17. وهي مكونة من مكون رئيسي ، VirB2 ، ومكون ثانوي ، VirB5. يتجمع VirB2 في خيوط حلزونية كبيرة ربما يكون VirB5 عند طرفه 18. تم افتراض أن Pili تعمل إما كأجهزة ملحقة تتوسط في التعرف على الخلايا المتلقية والتعلق بها أو تعمل كقناة لنقل Relaxase / ssDNA ، أو كليهما. بعض الشعيرات المقترنة قادرة على التراجع ، الأمر الذي سيجمع الخلايا المانحة والمتلقية معًا 19 مما يؤدي إلى التقارب الشديد. في الواقع ، لوحظت وصلات اقتران ضيقة مما أدى إلى اقتراح أن الاتصالات من خلية إلى خلية مطلوبة لحدوث الاقتران 20 ، 21. ومع ذلك ، فقد لوحظ أيضًا النقل عندما تكون الخلايا متباعدة بعض الشيء (انظر المناقشة التفصيلية أدناه).

في هذه المراجعة ، سأصف أولاً المعرفة الحديثة عن كل من هذه المجمعات ، ثم سأناقش الرؤى الميكانيكية المختلفة والمتناقضة أحيانًا التي ألقى أحدث بحث حول آليات الاقتران وإفراز النوع الرابع.


بناء منصة BOMB للبيولوجيا الجزيئية

المكونات الأساسية لمنصة الخرزة المغناطيسية هي الخرزات نفسها ومغناطيس قوي بما يكفي لشل حركتها. على الرغم من أن العديد من الباحثين في علوم الحياة سيكونون على دراية بالخرز المملوك (على سبيل المثال ، DynaBeads لالتقاط الأجسام المضادة ، وخرز AMPure لاختيار الحجم) ، إلا أن القليل منهم يدركون أنه يمكنهم تجميع الخرز ومكونات المغناطيس بأنفسهم من مواد رخيصة. ومع ذلك ، من أجل القيام بذلك ، يجب شرح بعض المفاهيم التي يحتمل أن تكون غير مألوفة.

أولاً ، تأتي الحبيبات المغناطيسية المستخدمة عادةً في البيولوجيا الجزيئية في شكلين رئيسيين - إما جزيئات صغيرة نسبيًا (50 نانومتر إلى 2 ميكرومتر) مصنوعة من قلب حديدي صلب أو مجموعات أكبر من الفريت بوليمر (1-5 ميكرومتر) [5]. كلا النوعين من الحبيبات يعملان بشكل جيد لتنقية الحمض النووي ومعالجته ، ومع ذلك ، فإن خواصهما الفيزيائية والكيميائية المختلفة تغير سلوكهما. على سبيل المثال ، يقلل البوليمر الموجود داخل حبات الفريت-بوليمر الأكبر بشكل فعال من كثافة الحبيبات بحيث تقل احتمالية استقرارها خارج المعلق أثناء خطوات المناولة. تحتوي حبات الفريت الصغيرة ذات النواة الصلبة على مساحة سطح نسبي أكبر للربط ويمكن أيضًا صنعها بسهولة في مختبر بيولوجيا جزيئية قياسي (انظر بروتوكولات BOMB 1-3).

يتمثل أحد الجوانب الرئيسية للخرز المغناطيسي المستخدم في البيولوجيا الجزيئية في أنه ، بغض النظر عن حجمها ، يجب أن تكون مغلفة كيميائيًا. السبب الأول للقيام بذلك هو توفير الاستقرار للخرز. بدون طلاء ، ستؤدي أكسدة الفريت إلى تلوث العينات التي يحتمل أن تكون حساسة بأيونات الحديد ، وستفقد الحبيبات خصائصها المغناطيسية بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يمنح الطلاء الكيميائي وظيفة إضافية للخرز المغناطيسي. على سبيل المثال ، تُستخدم أغلفة السيليكا أو الكربوكسيل بوليمر بشكل شائع لأنها ، بالإضافة إلى توفير ثبات الحبيبات ، تكون خاملة كيميائيًا نسبيًا (سيليكا) أو مشحونة سالبة (كربوكسيل) ، مما يسهل امتصاص الأحماض النووية سالبة الشحنة من الحبيبات خلال خطوات الشطف. هنا ، نحدد بروتوكولًا بسيطًا لإعداد الخرز المطلي بالسيليكا أو الكربوكسيل في مختبر علوم الحياة القياسي وإنتاج رفوف مغناطيسية مناسبة لشل حركتها.


إذا تخيلنا أننا نسير على ممر واسع ، ولا يمكننا إلقاء نظرة خاطفة على الحافة ، سواء على السطح الجانبي أو إلى الجانب الآخر ، فأنا لا أعتقد أن هناك طريقة لمعرفة ذلك. لنفترض أن الممر به درابزين على "كلا الجانبين" ، وتبدأ في تعليم الدرابزين وأنت تبقي يدك اليمنى عليه. بعد إكمال حلقة كاملة ، ستكون أسفل النقطة عبر الممر من حيث بدأت. من هناك ، لن ترى أي علامة حتى الآن ، لأنك تحت المسار الذي بدأت منه. إذا واصلت التقدم ، ستعود في النهاية ، بعد حلقة أخرى ، إلى النقطة التي بدأت منها ، وستكون العلامة الوحيدة التي تراها على الدرابزين ، وليس على الدرابزين عبر الطريق إلى يسارك.

ما حدث هنا يكون أكثر وضوحًا إذا فكرت في ما يحدث عندما قطعنا شريط mobius على طول خط الوسط. يؤدي إجراء هذا القطع إلى إضافة حافة ثانية ، مما ينتج عنه حلقة عادية ، تكون إحدى حافتها هي الحافة الأصلية لشريط mobius ، ويتم إنتاج الحافة الأخرى بواسطة القطع. المسار الموصوف في الفقرة أعلاه هو السير على طول إحدى حافة الحلقة الناتجة.

إذا تمكنا من الوصول لأسفل وتحديد الحافة الجانبية لمسارنا ، فهناك طريقة لمعرفة ذلك. نقوم بعمل علامات منتظمة (أو علامة مستمرة) على طول الحافة الجانبية إلى اليمين ، وأحيانًا نتحقق عبر المسار على يسارنا ، لمعرفة ما إذا كانت هناك أي علامات على الحافة الجانبية للمسار هناك. في منتصف الطريق على طول المسار الكامل (حلقتان) ، ستلاحظ علامات على الجانب الأيسر ، مصنوعة من "أسفل" المسار. سيكون هذا دليلًا على أنك على طريق موبيوس.


كشف التعقيد المتشابك للحمض النووي: الجمع بين النمذجة الرياضية وعلم الأحياء التجريبي لفهم النسخ المتماثل وإعادة التركيب والإصلاح

كيف يغير الحمض النووي ، الجزيء الذي يحتوي على معلومات وراثية ، شكله ثلاثي الأبعاد أثناء العمليات الخلوية المعقدة للتكرار وإعادة التركيب والإصلاح؟ هذا أحد الأسئلة الأساسية في البيولوجيا الجزيئية والتي لا يمكن الإجابة عليها دون مساعدة من النمذجة الرياضية. يمكن تقديم المفاهيم الأساسية للطوبولوجيا والهندسة في التدريس الجامعي لمساعدة الطلاب على فهم التحولات الهيكلية المعقدة غير البديهية التي تحدث في كل خلية حية. تحفز Topoisomerases ، وهي فئة رائعة من الإنزيمات تشارك في التكاثر وإعادة التركيب والإصلاح ، تغييرًا في طوبولوجيا الحمض النووي من خلال سلسلة من الخطوات الميكانيكية عالية التنسيق. يمكن لطلاب البيولوجيا والرياضيات الجامعيين تصور واستكشاف مبادئ عمل توبويزوميراز باستخدام المواد المتاحة بسهولة مثل الفيلكرو والشرائط وأسلاك الهاتف والسحابات والأنابيب. يمكن استخدام هذه الألعاب البسيطة كأدوات تعليمية قوية لإشراك الطلاب في الاستكشاف العملي بهدف التعرف على كل من الرياضيات وبيولوجيا بنية الحمض النووي.


5. البروتينات

البروتينات عبارة عن بوليمرات حيوية خطية تتكون من بقايا أحماض أمينية مختلفة مرتبطة تساهميًا معًا بواسطة روابط ببتيدية. يلعبون دورًا مهمًا في جميع العمليات البيولوجية تقريبًا بما في ذلك إشارات الخلايا وتحفيز التفاعلات الأيضية والدعم الهيكلي. من أجل أداء وظيفتها ، يجب أن تنثني معظم البروتينات إلى بنية ثلاثية الأبعاد مضغوطة (الحالة الأصلية) ، والتي تمليها في النهاية تسلسل الأحماض الأمينية الفريد.

تُعرف عدة آلاف من البروتينات التي تحتوي على مجموعة متنوعة من الهياكل والوظائف. نظرًا لتباينها وتعقيدها الهيكلي ، فقد ثبت أن البروتينات تمتلك مجموعة واسعة من السمات الطوبولوجية المعقدة (الشكل 8). يمكن أن تؤدي التفاعلات غير التساهمية بين الجزيئات إلى حلقات متشابكة قليلة القسيمات من وحدات البروتين الفرعية ، حيث تشكل الحلقتان رابط هوبف وبالتالي تصبحان غير منفصلين (الشكل 8 (أ)) [133]. في حالات أخرى ، يمكن أن ينتج عن الترابط التساهمي مثل روابط ثاني كبريتيد أو تفاعلات السلسلة على الجانب المعدني روابط تساهمية أو عقدة تتشكل إما أثناء الطي أو بعده. يوضح الشكل 8 (ب) بنية رابط Hopf التي تشكلت نتيجة روابط ثاني كبريتيد داخل الجزيئية داخل كل وحدة فرعية من بروتين ثنائي الأبعاد [134]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن طوبولوجيا حزمة اللاسو المثقوبة (PLB) التي تم اكتشافها مؤخرًا هي مثال على شكل يشبه العقدة حيث تخلق رابطة ثاني كبريتيد حلقة تساهمية يتم من خلالها ربط جزء من سلسلة البولي ببتيد (الشكل 8 (ج)) [135]. يمكن أن تتشكل "عقدة السيستين" عندما تمر رابطة ثاني كبريتيد بين جزأين من سلسلة بولي ببتيد عبر حلقة مكونة من رابطتين أخريين من ثاني كبريتيد وقطاعات العمود الفقري المتصلة بهما (الشكل 8 (د)). تشمل الأمثلة عائلة السيكلوتيد من البروتينات المصغرة النباتية التي تحدث بشكل طبيعي وعائلة عوامل النمو والسموم [136–138]. في كل هذه الحالات ، يتم إنشاء الرابط أو العقدة بواسطة رابطة تساهمية أو بنية قليلة القسيمات.

الشكل 8. أنواع مختلفة من هياكل البروتين المعقدة طوبولوجيا. في كل لوحة ، تظهر بنية البروتين المنتجة باستخدام Pymol (www.pymol.org/) على اليسار ، مع تمثيل مبسط لطوبولوجيا النظام على اليمين. (أ) يشكل التركيب البلوري لبيروكسيريدوكسين البقري الثالث رابط هوبف ، رمز PDB: 1ZYE. في التمثيل المبسط ، تمثل الدوائر المملوءة باللونين الأزرق والأحمر وحدة فرعية أحادية السلسلة ترتبط معًا لتشكل بنية حلقة قليلة القسيمات ذات رتبة أعلى. (ب) P. aerophilum يتم ربط سينسيز السترات ثنائي الأبعاد طوبولوجيًا عن طريق رابطتين ثنائي كبريتيد داخل الجزيئي (أشرطة سوداء) ، رمز PDB: 2IBP. يتم تلوين كل سلسلة بروتين بشكل منفصل ، في هذه الحالة باللون الأزرق أو الأزرق المخضر.(ج) طوبولوجيا حزمة اللاسو المثقوبة للبنية الأصلية للبتين ، حيث ينشئ جسر ثاني كبريتيد (أشرطة سوداء) حلقة تساهمية يتم من خلالها ربط جزء من سلسلة البولي ببتيد ، رمز PDB: 1AX8. (د) يحتوي التركيب البلوري لعامل نمو الأعصاب على شكل عقدة السيستين المحددة بثلاثة روابط ثنائي كبريتيد (أشرطة سوداء) ، رمز PDB: 1BET. (هـ) سلسلة العمود الفقري متعدد الببتيد من بكتريا قولونية يحتوي methyltransferase YbeA على عقدة ثلاثية الفصوص (31) ، كود PDB: 1NS5. (و) التركيب البلوري للفوسفاتيز البشري له هيكل منزلق العقدة ، كود PDB: 1EW2. بالنسبة إلى (ج) - (و) ، يتم تلوين كل من الهياكل والتمثيلات المختصرة من الأزرق (N-terminus) إلى الأحمر (C-terminus). يتم تمثيل بقايا السيستين في (ب) - (د) كعصي وخطوط في الهيكل وتمثيل مبسط ، على التوالي.

يمكن أيضًا أن تتجلى الطوبولوجيا المعقدة مثل الارتباط أو العقد داخل سلسلة العمود الفقري للبروتين نفسها. يوضح الشكل 8 (هـ) مثالاً لفئة من البروتينات التي تمتلك خاصية طوبولوجية معقودة في هياكلها التي تشكلت بواسطة مسار العمود الفقري متعدد الببتيد وحده [13 ، 15 ، 139]. في حالة أخرى ، تنشأ أيضًا بنية العقد المنزلق للبروتين عندما تشكل سلسلة بروتينية عقدة ثم تنثني مرة أخرى على نفسها لفك العقدة تمامًا ، مما يجعل الهيكل غير معقد عند النظر إليه بالكامل (الشكل 8 (و)) [140-142] . يركز هذا القسم من المراجعة على البنية والوظيفة ، وعلى وجه الخصوص ، طي هذه الأنواع من البروتينات المعقدة والمتقطعة. لا تتم هنا مناقشة البروتينات التي تحتوي على عُقَد تكونت بواسطة روابط تساهمية مثل ثنائي الكبريتيدات ، ويتم توجيه القراء المهتمين بهذه الهياكل إلى منشورات أخرى حول هذه الأنظمة [136 ، 137 ، 143–146].

5.1 بروتينات معقودة ومتشابكة

لفترة طويلة ، كان يُعتقد أنه من غير المحتمل للغاية ، إن لم يكن من المستحيل ، أن تقوم سلسلة البولي ببتيد بـ "عقدة" نفسها لتشكيل بروتين مطوي وظيفي. كان هذا جزئيًا بسبب حقيقة أنه في ذلك الوقت ، لم يتم تحديد أمثلة للبروتينات شديدة الترابط داخل بنك بيانات البروتين (PDB) [147]. في هذه الدراسة ، تم اكتشاف عقدة ضحلة جدًا في مادة الأنهيدراز الكربونية بواسطة مانسفيلد [147]. كان أحد التحديات في البحث عن عقدة البروتين هو صعوبة تحديد ما إذا كانت العقدة موجودة داخل بنية معقدة. وهكذا ، لسنوات عديدة ، لم يتم اكتشاف عقدة في هياكل البروتين. مع تطوير أدوات حسابية ورياضية مختلفة لاكتشاف وتحديد العقدة ، أصبح من الواضح أن هياكل البروتين المعقدة الطوبولوجية موجودة ، حتى أن بعضها يحتوي على عقدة عميقة للغاية [24 ، 26 ، 148 ، 149]. يوجد الآن عدد قليل من خوادم الويب التي بسّطت مهمة تحديد العقدة في البروتينات ويمكنها تحديد ما إذا كانت البنية تحتوي على عقدة بسرعة ، وإذا كان الأمر كذلك ، فما النوع [150 ، 151]. بالإضافة إلى ذلك ، فإن قاعدة بيانات KnotProt الأخيرة (http://knotprot.cent.uw.edu.pl/) التي أنشأها Sulkowska وزملاؤه تصنف البروتينات المعقدة وتمثل تعقيدها (نوع العقدة وعمق العقدة) على أنها `` عقدة ''. بصمة "على شكل مخطط مصفوفة [142 ، 152 ، 153]. تم استخدام مخططات المصفوفة ، وهي طريقة ممتازة لتصور العُقد والعُقَد في البروتينات ، في الأصل في تحليل العقد المنزلق في البروتينات بواسطة مجموعة ييتس [140].

حتى الآن ، تم اكتشاف أكثر من 750 بروتينًا معقودًا داخل PDB ، أي ما يعادل 1٪ تقريبًا من جميع المدخلات [152]. القائمة الحالية لأمثلة هذه الهياكل متوفرة في الجدول 2. وتجدر الإشارة إلى أن قاعدة بيانات KnotProt يتم تحديثها بانتظام [152]. على مر السنين ، لوحظ عدد متزايد من البروتينات المعقدة في جميع مجالات الحياة الثلاثة [15 ، 142 ، 154]. وتشمل هذه الهياكل التي تحتوي على ثلاثي الفصوص (31) ، رقم ثمانية (41) ، جورديان (52) وتفريغ (61) عقدة مع ثلاثة وأربعة وخمسة وستة تقاطعات متوقعة للعمود الفقري متعدد الببتيد ، على التوالي (الشكل 9).

الجدول 2. أمثلة على البروتينات المعقدة والمتقطعة. لكل طية ، يتم إعطاء رمز PDB لبنية البروتين أو بروتين نموذجي في الأسرة. + و - تشير إلى عقدة اليد اليمنى واليسرى والعقدة ، على التوالي.

عائلة البروتين أو البروتين كود PDB نوع العقدة
ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي الريبي (α/β عقدة) 1NS5 31 + عقدة
الأنهيدراز الكربوني 1LUG 31 + عقدة
SAM synthetase 1FUG 31 + عقدة
أضعاف ترانسكارباميليز 1JS1 31 + عقدة
بروتين غشاء مبادل الصوديوم / الكالسيوم 3V5S 31 + عقدة
طية إصبع الزنك 2K0A 31 - عقدة
Ribbon-helix-helix superfamily 2EFV 31 - عقدة
بروتين معقود صناعيا 3MLG 31 - عقدة
الصنف الثاني اختزال حمض الكيتول 1 سنة 41 عقدة
مجال ربط الكروموفور من فيتوكروم 2O9C 41 عقدة
هيدروليسات Ubiquitin C- الطرفية (UCHs) 2ETL 52 - عقدة
α-الحمض ديهالوجيناز أنا 3BJX 61 + عقدة
الفوسفاتيز القلوية 1ALK 31 + عقدة
كيناز ثيميدين 1P6X 31 + عقدة
بروتين غلوتامات سيمبورت 2NWL 31 + الانزلاق
سلفاتاز 4TN0 31 + عقدة
ستيف B116 2J85 31 + الانزلاق
عامل تحفيز موت الخلايا المبرمج 1GV4 31 - عقدة
الصوديوم: عائلة الناقل العصبي 2 أ 65 31 + & أمبير 41 عقدة
عائلة البيتين / كارنتين / ناقل الكولين (BCCT) 4AIN 31 + & أمبير 41 عقدة

الشكل 9. تراكيب البروتينات المعقدة التي تحتوي على أربعة أنواع مختلفة من العقد (31, 41, 52, 61) في العمود الفقري متعدد الببتيد. (أ) YbeA ، عقد ثلاثي الفصوص (31) ميثيل ترانسفيراز من بكتريا قولونية، كود PDB: 1NS5. (ب) بكتريا قولونية الفئة الثانية من اختزال حمض الكيتول ، والتي تحتوي على رقم ثمانية (41) عقدة ، كود PDB: 1YRL. (ج) ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1) ، الذي يحتوي على عقدة مع خمسة تقاطعات مسقطة (5)2) ، كود PDB: 2ETL. (د) α-الحمض ديهالوجينيز الذي يحتوي على تفريغ (61) عقدة ، كود PDB: 4N2X. اللوحة العلوية: المخططات الشريطية لسلاسل البولي ببتيد المنتجة باستخدام Pymol (www.pymol.org/). اللوحة السفلية: عرض مبسط لسلسلة البروتين تظهر العقدة ، تم إنشاؤها باستخدام KnotPlot (//knotplot.com/). يتم تلوين كل من الهياكل والتمثيلات المختصرة من الأزرق (N-terminus) إلى الأحمر (C-terminus).

عقدة Trefoil هي أكثر أنواع العقدة انتشارًا وأبسطها في البروتينات. أول عقدة بروتين ثلاثية الفصوص تم تحديدها كانت تلك الموجودة في الأنهيدراز الكربوني - وهي عائلة من البروتينات تشارك في تحفيز تفاعل ثاني أكسيد الكربون مع كربونات الهيدروجين و H + [147]. ومع ذلك ، فإن هذا النبات ذو الثلاث ورقات ضحل إلى حد ما حيث يمتد الطرف C عبر حلقة واسعة من خلال عدد قليل من المخلفات. بعد سنوات قليلة من دراسة مانسفيلد عام 1994 ، تم اكتشاف عقدة ثلاثية الفصوص أعمق بكثير في بكتريا قولونية إنزيم S-adenosylmethionine synthetase ، وهو إنزيم يحفز التفاعل بين الميثيونين و ATP [155 ، 156]. إلى حد بعيد ، فإن العائلة الأكبر والأكثر دراسة من البروتينات المتشابكة بعمق هي ثلاثية الفصوص α/β طي العقدة - فئة من ميثيل ترانسفيرازات (MTases) التي تنتمي إلى عائلة SpoU [157 ، 158]. تشترك هذه البروتينات المعقدة في سمات هيكلية مشتركة ومن المحتمل جدًا أن تكون جميع MTases التي تحفز نقل مجموعة الميثيل من S-adenosyl methionine (AdoMet) إلى ذرات الكربون أو النيتروجين أو الأكسجين في DNA و RNA والبروتينات والجزيئات الصغيرة الأخرى [ 159]. في المحلول ، تشكل جميع الثنائيات ذات المنطقة المعقدة جزءًا من موقع ربط AdoMet وتشكل جزءًا كبيرًا من السطح البيني الثنائى [157 ، 160–163]. تم العثور على عقدة ثلاثية الفصوص أيضًا في اثنين من متماثلات N-succinylornithine transcarbamylase the AOTCase من X. campestris يحفز التفاعل من N-acetylornithine و carbamyl phosphate إلى acetylcitrulline [164] ، و SOTCase من باء الهشة يروج للكرباميل لـ N-succinylornithine [165]. إلى جانب وجودها في الإنزيمات ، تم تحديد عقد ثلاثية الفصوص أيضًا في Rds3p ، وهو بروتين رابط للمعادن حقيقي النواة ضروري للربط المسبق للرنا المرسال [166] ومؤخرًا في عائلة بروتينات غشاء مبادل الصوديوم / الكالسيوم [152].

تم التعرف أيضًا على عقد أكثر تعقيدًا في البروتينات التي تحفز التفاعلات الأنزيمية المختلفة. تم العثور على عقدة بروتينية عميقة ، مكونة من ثمانية في مركب اختزال حمض الكيتول النباتي ، والتي تشارك في التخليق الحيوي للأحماض الأمينية متفرعة السلسلة [167 ، 168]. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد عقدة جوردية في عائلة اليوبيكويتين الكاربوكسيل-الطرفية للثدييات (UCHs) ، البروتينات هي إنزيمات تزيل التكاثر تحفز انقسام رابطة الأيزوببتيد المتكونة بين السلاسل الجانبية لليسين والأوبيكويتين من البروتين وغيرها من المقاربات ، وبالتالي يشاركون في نظام اليوبيكويتين البروتيازومي [169-171]. عقدة البروتين الأكثر تعقيدًا المعروفة حتى الآن هي العقدة 61 تم اكتشاف عقدة تحميل وتفريغ في ده آي ، أ α- هالوجيناز حمض الهالوجين الذي يحفز إزالة الهاليدات من الحموض العضوية [154]. بصرف النظر عن هذه الإنزيمات ، فقد ثبت أن عقدة الرقم ثمانية موجودة أيضًا في مجال ربط الكروموفور لمستقبلات ضوئية حمراء / حمراء بعيدة من البكتيريا. D. radiodurans [172, 173].

تم العثور على هياكل سليبكنوتيد أيضًا في عدد من البروتينات (الشكل 8 (و)) [140]. لا يمكن تحديدها باستخدام الطرق القياسية لاكتشاف العقدة في البروتينات ، حيث في هذه الحالات ، تتراجع العقدة عندما يتم سحب السلسلة عند كلا الطرفين. على هذا النحو ، ليس من المستغرب أن يتم التغاضي عن هذه الهياكل حتى وقت قريب نسبيًا. في عام 2007 ، اكتشف ييتس وزملاؤه لأول مرة عددًا من عقدة البروتين باستخدام نهج قائم على حقيقة أن العقد المنزلق تصبح عقدة حقيقية في مرحلة ما عندما يتم تقصير سلاسل البولي ببتيد [140]. في الوقت الحالي ، تم تحديد أكثر من 450 عقدة بروتينية [152] وقائمة بأمثلة على هذه الهياكل مدرجة في الجدول 2. ومن الجدير بالذكر أن قاعدة بيانات KnotProt هي قاعدة البيانات الأولى والوحيدة حاليًا التي توفر تفاصيل حول الهياكل المنزلق. [152].

الفوسفاتيز القلوي هو أكبر عائلة من البروتينات التي تحتوي على عقدة منزلقة عميقة [15 ، 140 ، 152]. في حالة بكتريا قولونية الفوسفاتيز القلوي ، يجب حذف 30 من البقايا من الطرف C قبل أن ينتج التشكل المعقود. على غرار البروتينات المعقدة ، تم العثور أيضًا على العديد من عقدة البروتين التي تم اكتشافها حتى الآن في إنزيمات أخرى مثل كينازات ثيميدين وسلفاتازات [15 ، 140 ، 152]. ومن المثير للاهتمام ، أنه تم العثور أيضًا على عقدة منزلقة في بروتينات الغشاء التي تمتد عبر غشاء الخلية بأكمله والتي تكون مطمورة بشكل دائم [15 ، 140 ، 152]. تشمل الأمثلة عائلات الصوديوم: ناقلات عصبية ، ناقلات البيتين / كارنيتين / الكولين (BCCT) والبروتون: ناقلات الغلوتامات [142].

يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول هياكل البروتين المعقّدة والمتشابكة في المراجعات الحديثة الأخرى [12 ، 13 ، 15 ، 174] وخادم KnotProt [152]. وتجدر الإشارة إلى أن قاعدة بيانات KnotProt توفر أيضًا معلومات أساسية شاملة حول الوظائف البيولوجية للبروتينات ذات العقد والعقد المنزلق [152].

5.2 الأدوار والآثار المحتملة للعقدة والانزلاق

تم العثور على البروتينات المعقدة طوبولوجيًا ليتم حفظها عبر عائلات مختلفة [142] ، مما يشير إلى أن العقدة نفسها قد تكون مفيدة ومهمة لوظيفة البروتين. لقد تم التكهن بأن الطوبولوجيا المعقدة يمكن أن تلعب دورًا رئيسيًا في زيادة النشاط التحفيزي أو تقارب ارتباط الترابط (ربما عن طريق تقليل الديناميكيات) أو تعزيز الاستقرار (الديناميكا الحرارية والحركية والميكانيكية) للبروتين. حتى الآن ، لا يُعرف سوى القليل نسبيًا عن المزايا الوظيفية ، إن وجدت ، لهذه الهياكل المعقدة المعقدة على نظيراتها غير المعقدة. ومع ذلك ، تم إجراء العديد من الدراسات التجريبية والحسابية لمعالجة هذا السؤال.

أظهرت العديد من التقارير أن المناطق المعقدة للبروتينات المعقدة تلعب أدوارًا حاسمة في الأنشطة الأنزيمية والربط الترابطي. كما تمت مناقشته في القسم 5.1 ، فقد لوحظ أن المناطق المعقدة للبروتينات في α/β-تشكل عائلة SpoU MTase المعقدة جزءًا من الموقع النشط الذي ترتبط به الرابطة (مثالان على α/β تم توضيح عقدة MTases في الشكل 10 (أ)) [159-162]. في حالة N-succinylornithine transcarbamylase ، أثبت Virnau وزملاؤه من خلال دراسة حسابية أن وجود العقدة في متماثل عقدة AOTCase قد يعدل هيكليًا موقعه النشط وبالتالي قد يغير نشاطه الأنزيمي (من حيث خصوصية الركيزة) بالمقارنة مع نظيرتها غير المعقدة OTCase (الشكل 10 (ب)) [149]. بالإضافة إلى ذلك ، الدراسات الهيكلية D. radiodurans كشف فيتوكروم أن العقدة الراسخة بعمق في مجال ربط الكروموفور على اتصال مع حامل اللون [172 ، 173]. أظهرت دراسة حديثة حول الحفاظ على بصمات الأصابع المتشابكة في UCHs أيضًا أن هناك ارتباطًا بين مواقع بقايا الموقع النشط والنقاط التي تميز طوبولوجيا العقد (أي النواة المعقدة) [142]. على الرغم من هذه الأمثلة ، لا يزال هناك القليل من الأدلة التجريبية المباشرة على أن البنية المعقدة يمكن أن تؤثر على نشاط البروتين.

الشكل 10. أمثلة تسلط الضوء على الأدوار المحتملة للعقد وعقد الانزلاق. (أ) هياكل Dimeric من α/β-عقدة MTases YibK ، كود PDB: 1MXI (يسار) و YbeA ، رمز PDB: 1NS5 (يمين) ، ملون لإظهار حلقة العقد باللون السماوي وسلسلة معقودة باللون الأحمر. يظهر S-adenosyl homocysteine ​​، وهو عامل مساعد لـ MTase ، كنموذج عصا. (ب) هياكل المقطع المعقود (المخلفات 171-278) من AOTCase مع منتج التفاعل N-acetylcitrulline والسلاسل الجانبية المتفاعلة الممثلة كعصي ، رمز PDB: 3KZK (يسار) ، والقسم المقابل (غير معقود) (بقايا 189-286) ) في OTCase مع المانع L-norvaline (مشابه لرباط L-ornithine) والسلاسل الجانبية المتفاعلة الموضحة على شكل عصي ، رمز PDB: 1C9Y (يمين). تحتوي العقدة على حلقة صلبة غنية بالبرولين (بقايا 178-185 ، حمراء اللون) يتم من خلالها ربط السلسلة. (ج) اللوحة اليسرى: بوليمرات معقودة وغير معقودة ("معقودة بشكل سطحي") باستخدام تركيبتين مختلفتين من البروتين. اللوحة اليمنى: أول منحنيات انصهار مشتقة تم الحصول عليها للبوليمرات المعقدة وغير المعقدة. مقتبس من [179] ، بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد. (د) هياكل بروتينات الغشاء LeuT (Aa) ، رمز PDB: 2A65 و Glt (Ph) ، رمز PDB: 2NWL ، حيث تكون حلقة العقدة المنزلق بلون سماوي وسلسلة معقودة باللون الأحمر. يتم تمثيل الحلزونات على شكل أسطوانات لتسهيل التصور. يتم إنتاج جميع الهياكل باستخدام Pymol (www.pymol.org/).

أثيرت أيضًا مسألة ما إذا كان للعقد أي تأثير على الديناميكيات التوافقية للبروتينات. في بروتين فيتوكروم ، لوحظ أن شكل الثمانية عقدة تجلس حيث يمكن أن تكون الصلابة المتزايدة مهمة في قيادة التغييرات التوافقية التي تحدث عندما يمتص حامل اللون الطاقة الضوئية [172 ، 175]. أظهرت الأساليب الحسابية الحديثة باستخدام نماذج شبكية بسيطة حوضًا أصليًا ضيقًا وأقل امتدادًا لـ 52- بنية معقودة نسبة إلى هيكل مشابه ولكن غير معقد ، مما يوحي بصلابة معززة [176]. ومع ذلك ، دراسات تجريبية من قبل أندرسون وآخرون، والتي قامت بقياس 15 N من معلمات استرخاء الدوران باستخدام تجارب NMR لـ 52- لم يُسجل UCH-L1 المعقد أي فروق ذات دلالة إحصائية بين خصائص الاسترخاء للبروتين المعقود بالنسبة للبروتينات غير المعقدة ذات الحجم المماثل [177]. وبالتالي ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت الهياكل المعقدة يمكن أن تؤثر على الديناميات التوافقية للبروتين بشكل واضح ، ولا سيما من الناحية التجريبية.

تم بذل الكثير من الجهود البحثية لمعالجة مسألة ما إذا كانت العقدة يمكن أن توفر ثباتًا ديناميكيًا حراريًا أو حركيًا أو ميكانيكيًا إضافيًا لبنية البروتين. سولكوسكا وآخرون إجراء عمليات محاكاة خشنة الحبيبات للتكشف الحراري والميكانيكي للعقد (AOTCase) والمتغيرات غير المعقدة (OTCase) للبروتينات الشبيهة بـ transcarbamylase بالإضافة إلى التركيب التركيبي للبروتين الأصلي المعقد المعاد توصيله لإزالة العقدة [178] . في هذه الحالة ، تم العثور على بنية معقودة تتكشف فترات أطول من البروتينين الآخرين غير المعقدين ، والتي تُعزى إلى الإحباط الطوبولوجي والهندسي [178]. في محاولة لفحص الثبات الحراري المحتمل للبروتينات المعقدة في دراسة تجريبية ، صمم ييتس وزملاؤه بوليمر معقود وغير معقد ("معقود بشكل سطحي") [179]. لقد أظهروا أن السلسلة المعقّدة تتمتع باستقرار حراري أعلى من السلسلة غير المعقّدة (الشكل 10 (ج)) ، على الرغم من أنه من المهم ملاحظة أن التفتح في كلتا الحالتين لم يكن قابلاً للعكس تمامًا ، وبالتالي تم الإبلاغ عن درجات حرارة الانصهار الظاهرة فقط. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات الحسابية باستخدام محاكاة مونت كارلو لنموذج شبكي بسيط باستخدام إمكانات شبيهة بـ Gō أن عقدة ثلاثية الفصوص لم يكن لها أي تأثير على الاستقرار الديناميكي الحراري لبنية بروتينية بسيطة [180]. بدلاً من ذلك ، وجد أن العقدة تعزز الاستقرار الحركي حيث يتكشف البروتين المعقود بمعدل أبطأ بشكل واضح من نظيره غير المعقد [180]. أظهرت دراسات أخرى من قبل نفس المجموعة أن عقدة بروتينية أكثر تعقيدًا من الناحية الطوبولوجية ، 52 العقدة ، عززت بوضوح الاستقرار الحركي للبروتين مقارنةً بالبروتين الذي يحتوي على 31 عقدة [176].

تم فحص مقاومة البروتينات المعقدة للتكشف الميكانيكي بواسطة الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). كان أول نظام تمت دراسته هو الأنهيدراز الكربوني ب. المواقف الأخرى التي أدت إلى فك العقدة [181 ، 182]. على الرغم من أن هذه الدراسات الأولية تشير إلى وجود تأثير كبير للعقدة على الاستقرار الميكانيكي ، إلا أن النتائج لم تُلاحظ في دراسات AFM للأنظمة الأخرى المعقدة [175]. في حالة الأنهيدراز B الكربوني ، سلطت عمليات المحاكاة الحديثة الضوء على الأسباب المحتملة لاستقراره الآلي الرائع [183]. كشفت هذه الدراسات أنه بعد حدث أولي محدود نوعًا ما تتكشف العقدة حول جزء داخلي β-هيكل الصفيحة في لب البروتين. وبالتالي ، يتم إحكام العقدة ولكن يتم التقاطها محليًا بشكل فعال بواسطة عقبة هيكلية في السلسلة. يتم المساعدة في ذلك من خلال تأثيرات التثبيت لأيون الزنك ، والذي ينسق مع المنطقة التي تصبح متشابكة بواسطة العقدة. تشرح عمليات المحاكاة سبب كون طول الكفاف المرصود في تجارب AFM أصغر بكثير من المتوقع لسلسلة بولي ببتيد ممدودة بالكامل تحتوي على عقدة مشدودة. في امتداد مثير للاهتمام لعملهم الأولي ، قام إيكاي وزملاؤه بتكرار ترادفي للأنهيدراز الكربوني ب. بدمج AFM مع القياسات البيوكيميائية للنشاط والربط ، تمكنوا من إثبات أن منطقة العقد الطرفية C كانت ضرورية للنشاط [ 184].

الاستقرار الميكانيكي لـ 41تم فحص بروتين فيتوكروم معقد أيضًا بواسطة Bornschögl وزملاؤه باستخدام AFM [175].ومع ذلك ، في هذه الحالة ، لم يلاحظوا أي مقاومة معززة عند شد العقدة لأن قوة التمديد للتكشف (73 pN) كانت ضمن النطاق الموجود للبروتينات الأخرى غير المعقدة. يبدو أن ما إذا كانت العقدة تساهم في الاستقرار الميكانيكي أم لا ، قد يعتمد على عدد من العوامل بما في ذلك جوانب أخرى من بنية البروتين وربما سحب السرعة / القوة وما إلى ذلك. اقترحت العديد من الدراسات الحسابية أن العقدة قد تزيد من الاستقرار الميكانيكي للبروتين المعقود ، مما يجعلها أكثر مقاومة لمسارات الإزاحة الخلوية والتدهور [149 ، 178 ، 185 ، 186]. مرة أخرى ، ما إذا كانت العقدة تمنح أي تأثير استقرار مفيد لبروتين معقود على نظيره غير المعقد لا يزال غير حاسم ، وبالتالي لا يزال يتعين اختباره بمزيد من الدراسات التجريبية والحاسوبية.

طرح العدد الكبير من عقدة البروتين التي تم تحديدها الآن أيضًا مسألة ما إذا كانت هذه الهياكل لها أي دور وظيفي أو هيكلي في البروتين. في حالة المثلية بكتريا قولونية قام الفوسفاتيز القلوي ، والييتس وزملاؤهم بهندسة بقايا السيستين في مواضع مختلفة في الحلقة البارزة للعقدة المنزلقة بحيث أدى الترابط ثنائي الكبريتيد بين الوحدتين الفرعيتين إلى نظام معقود [140]. باستخدام التمسخ الحراري ، أظهرت النتائج أن المسوخات المعقدة كانت أكثر استقرارًا من الناحية الحرارية من النوع البري أو المسوخات الضابطة الأخرى. يشير هذا إلى أن العقدة المنزلقة في الهيكل قد تلعب دورًا في ثبات الإنزيم بالحرارة [140]. وتجدر الإشارة أيضًا إلى أن البروتين الشبيه بالبروتين B116 المنزلق موجود في فيروس يصيب المحبة للحرارة. سلفولوبس Archaebacteria 140. في دراسة أخرى ، أظهرت تحليلات بصمات الأصابع المتشابكة لقنوات النقل عبر الغشاء من خمس عائلات مختلفة من البروتينات أن الهيكل المنزلق العقدة محفوظ. وقد أدى ذلك إلى تكهنات بأن الحلقة المنزلق ، التي تربط معًا عدة غشاء α- القفزات ، قد تثبت مكانها داخل الغشاء أثناء عمل الناقل والتوازي [142] (انظر الشكل 10 (د) للحصول على أمثلة لتركيبات اثنين من بروتينات الغشاء المنزلق).

5.3 رؤى تجريبية وحاسوبية حول كيفية طي البروتينات المعقدة والمتقطعة

كانت دراسة كيفية تحقيق البروتينات لتشكيلها ثلاثي الأبعاد الفريد (الحالة الأصلية) محور اهتمام العديد من الباحثين في مجال طي البروتين. لعقود عديدة ، ركزت دراسات الطي المكثفة على البروتينات الأحادية الصغيرة ، وبالتالي فإن آليات كيفية طيها أصبحت الآن راسخة نسبيًا [187-191]. وتشمل هذه الآليات الهيكلية ، والتكثيف التنوي ، والانهيار الكارهة للماء ، والتي يمكن اعتبارها نقاطًا على طيف لآلية موحدة [187 ، 188]. أظهرت نظريات الطي الحالية أن البروتينات الأحادية الصغيرة ، التي تنثني بكفاءة وسرعة ، يمكن أن تحقق تكوينها الأصلي منخفض الطاقة من مجموعة سلاسل متعددة الببتيد المشوهة بطريقة تعاونية للغاية وتجتاز مناظر طبيعية ذات طاقة سلسة نسبيًا وموجهة. . ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح كيف يمكن تطبيق هذه المفاهيم والآليات على البروتينات الأكبر حجماً ذات الطوبولوجيا الأكثر تعقيدًا بما في ذلك فئات البروتينات المعقدة والمتشابكة. لا يتعين على هذه البروتينات تجنب المصائد الحركية فحسب ، بل يتعين عليها أيضًا التغلب على الحواجز الطوبولوجية الهامة أثناء الطي. يلخص هذا القسم التطورات الأخيرة التي تم إجراؤها نحو فهم الآليات التي ينطوي عليها تكوين هذه الأنواع من الهياكل المعقدة.

5.3.1. دراسات تجريبية على البروتينات المعقدة.

على الرغم من أن توضيح كيفية طي البروتينات المعقدة باستخدام الأساليب التجريبية لا يزال يمثل تحديًا ، فقد تم إحراز بعض التقدم الكبير في السنوات الأخيرة. ركزت معظم دراسات الطي التجريبية على البروتينات المعقدة على العقد ثلاثية الفصيلة α/β MTases ، من YibK من المستدمية النزلية و YbeA من بكتريا قولونية [194–201]. كلا البروتينين هما متجانسات ، والتي ترتبط بالعاملين المشتركين AdoMet و S-adenosyl homocysteine ​​(AdoHcy) وتحتوي على عقدة ثلاثية الفصوص عند الطرف C حيث يمر ما لا يقل عن 40 من البقايا عبر حلقة متشابهة الحجم (الشكل 10 (أ)) [160 ، 202]. تم استخدام تقنيات فيزيائية حيوية واسعة النطاق للتحقيق في آليات الغرز والطي لمنقي YibK و YbeA المنقى والمعبر بشكل متجانس. كلاهما يتكشف بشكل عكسي في المختبر عند إضافة مادة كيميائية ممسّكة مع ما يصاحب ذلك من خسارة في البنية الثانوية والثالثية [195 ، 198]. أظهرت الدراسات الحركية أن YibK و YbeA يطويان بالمثل من خلال آليات متسلسلة تضم واحدة أو أكثر من الحالات الوسيطة الأحادية وخطوة تقليل المعدل البطيئة [196 ، 198].

لاستكشاف أحداث العقد المتسلسلة أثناء طي YibK و YbeA ، قام مالام وزملاؤه ببناء مجموعة من بروتينات الاندماج المعقود فيها A. fulgidus تم دمج هذا ، وهو بروتين ثابت مكون من 91 بقايا ، مع N- أو C- أو كليهما من كلا الطرفين MTases [201]. تم استخدام هذا باعتباره "سدادة جزيئية" في محاولة لتعطيل أحداث الخيوط أو لمنع السلسلة من العقد تمامًا. بشكل ملحوظ ، أثبتت هذه التجارب أن كلا البروتينين يمكن أن يقاوم اندماج نطاقات إضافية لكل من نهايتيهما N و C وقادران على الانطواء إلى حالات أصلية أو شبيهة بالأصلية قادرة على ربط العامل المساعد. تمثل بروتينات الاندماج التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة بعضًا من البروتينات الأكثر تعقيدًا المعروفة ، وهي الانصهار الطرفي C الذي يتطلب حوالي 140 من البقايا أو أكثر لتمريرها عبر حلقة لتشكيل الحالة الأصلية المعقدة. من المثير للدهشة أن جميع بروتينات الاندماج أظهرت حركيات قابلة للتفتت والانكسار تشبه إلى حد بعيد MTase الأصلي ، مما يعطي أول تلميح إلى أن سلسلة البولي ببتيد قد تظل معقودة حتى في حالة غير منظمة للغاية مشوهة كيميائيًا. وقد تبين فيما بعد أن هذا هو الحال من خلال في المختبر اكتشفت التجارب القابلة للطي على المتغيرات الدائرية من YibK و YbeA ، مالام وزملاؤه أن المجموعات المشوهة ، حتى في التركيزات العالية من مادة كيميائية تمسخ في ظل الظروف لم يكن هناك بنية ثانوية أو ثالثة أو منعدمة ، تحتوي على سلاسل بولي ببتيد معقودة محبوسة حركيًا [194] . ثم خلص إلى أن كل ما سبق في المختبر التجارب القابلة للطي على هذه البروتينات المعبر عنها بشكل متجانس والتي تم تغيير خصائصها كيميائيًا قد سبرت في الواقع الانعكاس من حالة غير مطوية ولكن معقودة إلى بنية أصلية معقودة ومطوية. تشير هذه النتيجة غير المتوقعة إلى وجود تفاعلات في حالة التشوه والتي تعمل على استقرار العقدة حركيًا. على الرغم من أن قياسات الأشعة فوق البنفسجية البعيدة تشير إلى عدم وجود بنية ثانوية مهمة موجودة في حالة التحريف ، فإن التخصيصات الحديثة للرنين المغناطيسي النووي والعمود الفقري والتحولات الكيميائية في YbeA المشوهة باليوريا ، توضح أنه ، في الواقع ، لا تزال بعض الهياكل الثانوية المتبقية تحت هذه الظروف [203) ]. تم تأكيد حقيقة أن العقدة يمكن أن تستمر في حالة التشوه الطبيعي على مدى فترة طويلة من الزمن أيضًا من قبل مجموعة أخرى شاركت في هذا التوازن الذي يتكشف ويعكس تحولات MTase المتجانسة هيكليًا والتي أظهرت تباطؤًا واضحًا [204]. تم التكهن بهذا السلوك ليكون متسقًا مع فك اقتران الأحداث المتكشفة وفك الارتباط للبروتين المعقود [204]. في الآونة الأخيرة ، تم إجراء تجارب نقل طاقة الرنين بالرنين أحادي الجزيء (FRET) لتوصيف الحالة المشوهة لـ TrmD ، وهو MTase آخر ذو عقد ثلاثي الوريقات [205]. أشارت النتائج إلى أن العقدة لم يتم الاحتفاظ بها فقط في ظل ظروف تغيير طبيعة (مماثلة لتلك الخاصة بـ YibK و YbeA) ولكن أيضًا انزلقت نحو الطرف C لسلسلة البولي ببتيد أثناء عملية التفتح [205].

حتى وقت قريب ، لم تكن هناك دراسات تجريبية حول كيفية تكوين العقدة لأول مرة من سلسلة بولي ببتيد خطية غير معقودة. ومع ذلك ، مع استخدام تقارن في المختبر نظام ترجمة النسخ وتجارب تحليل النبضات الحركية ، كان مالام وجاكسون قادرين على تحري طي السلاسل الوليدة من YibK و YbeA بعد أن تم تصنيعها لأول مرة بواسطة الريبوسوم (الشكل 11 (أ)) [199]. أظهرت النتائج أن السلاسل الوليدة يمكن أن تطوى بشكل صحيح إلى هيكلها ذي العقد الثلاثية ، وإن كان ذلك ببطء شديد. علاوة على ذلك ، لوحظت فترة تأخر كبيرة بين تخليق السلسلة وظهور حالة أصلية مستقرة من الناحية البروتينية. كانت النتائج متسقة مع عقدة البروتين والطي من سلسلة وليدة غير معقودة في البداية ، مما يدل على أن العملية المرتبطة بخطوة العقدة تحد من المعدل. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن GroEL-GroES chaperonin له تأثير كبير على معدل الطي لسلاسل البولي ببتيد المترجمة حديثًا ، مما يثبت أن المرافقين من المرجح أن تكون مهمة في الطي بعد متعدية هذه البروتينات المعقدة. في الجسم الحي.

الشكل 11. التوصيف التجريبي لطي أحجار الميثيل المنقولة ذات العقد الثلاثي ، YibK و YbeA. (أ) تمثيل تخطيطي لمسارات الطي والتشابك التي تمت ملاحظتها تجريبياً. (ب) رسم تخطيطي يوضح آلية نشطة محتملة لعمل تشبيرونين GroEL-GroES البكتيرية على طي ناقل الميثيل البكتيري ذو العقد الثلاثية. D ، تحريف الصفات أنا ، وسيط N ، مواطن.

في الآونة الأخيرة ، قمنا بالتحقيق في سلوك العقد والطي للسلاسل الوليدة لمحطات N- و C المختلفة. في المختبر نظام النسخ - الترجمة وتجارب النبض - التحلل البروتيني الحركي [206]. أظهرت النتائج أنه يمكن تصنيع هذه البروتينات متعددة المجالات ذات العقد العميقة للغاية في المختبر وعقدة تلقائيًا دون مساعدة من أي مرافقين جزيئية ، وإن كان ذلك ببطء شديد. بالإضافة إلى ذلك ، تم استنتاج أن الطرف C لهذه البروتينات أمر بالغ الأهمية لخيوط سلسلة البولي ببتيد لتشكيل العقدة ، وبالتالي توفير أول رؤية تجريبية لآلية العقد لهذه الفئة من MTase البكتيري المعقود. أثبتت التجارب الإضافية مع GroEL-GroES chaperonin أنها تساعد بنشاط في طي البروتينات المعقدة بواسطة آلية قد تتضمن الكشف عن وسيطة غير معقودة وغير معقودة بشكل حركي (الشكل 11 (ب)). لا توفر هذه الملاحظات الرئيسية معلومات حيوية حول مسار الطي المعقد للبروتينات ذات العقد الثلاثية فحسب ، بل توفر أيضًا رؤى إضافية حول كيفية مقاومة البروتينات المعقدة الطوبولوجي للضغوط التطورية وتحقيق الطي الفعال. في الجسم الحي.

في عام 2010 ، صممت مجموعة Yeates بروتينًا صناعيًا ثلاثي الفصيلة معقودًا عن طريق الربط التساهمي بين مونومرين متشابكين في البنية القاتمة لـ HP0242 من جرثومة المعدة [207]. ان في المختبر تم إجراء توصيف تجريبي لهذا البروتين المصمم المتشابك ومتغير أحادي غير معقد من HP0242 dimer. أظهرت النتائج أنه على الرغم من أن المتغير المعقود كان أكثر ثباتًا من المتغير غير المعقد ، إلا أنه ينثني بمعدل أبطأ إلى حد كبير (حوالي 20 ضعفًا) ، مما يشير إلى أن العقد ، أو بعض الأحداث المرتبطة به ، من المحتمل أن يكون محددًا للمعدل.

تم استخدام AFM أيضًا لدراسة التفتح الميكانيكي للأنهيدراز الكربوني الضحل المعقود بثلاثية الوريقات ب. محتفظ بها [182 ، 208]. وبالمثل ، أسفرت التجارب التي تتكشف عن AFM الميكانيكية على عقدة الرقم ثمانية في مجال ربط الكروموفور للفيتوكروم أيضًا عن عقدة متشددة من حوالي 17 وحدة بنائية [175]. على الرغم من أن هذه التجارب لا توفر بالضرورة معلومات شاملة عن مسارات الطي لهذه البروتينات ، إلا أنها كانت حاسمة في إثبات أن العقد كانت موجودة في الهيكل وفي تحديد الحد الأدنى لطول سلسلة البولي ببتيد المطلوبة للعقد.

بالإضافة إلى البروتينات ذات العقد الثلاثية الموصوفة بالتفصيل أعلاه ، فإن المجموعة الأخرى من البروتينات المعقدة التي يوجد لها أي توصيف تجريبي كبير لمساراتها القابلة للطي هي 52-UCHs معقود [177 ، 209]. تم تحديد الكشف عن اثنين من UCHs بشريين - UCH-L1 ، وهو شكل عصبي من الإنزيم ، و UCH-L3 ، يتم التعبير عنه في كل مكان في العديد من أنواع الخلايا ، وفي كلتا الحالتين ، تم تحديد في المختبر وقد تبين أن التفتح / إعادة التشكيل بمواد كيميائية قابلة للانعكاس يمكن عكسه بالكامل [177 ، 209]. في حالة UCH-L3 ، تم تركيب بيانات كشف التوازن على نموذج بسيط ثنائي الحالة [209] بينما كان نموذج UCH-L1 متسقًا مع نموذج ثلاثي الحالات يتم فيه ملء حالة وسيطة [177]. باستخدام تجارب تبادل الهيدروجين والديوتيريوم بالرنين المغناطيسي النووي (HDX) ، تميزت الحالة الوسيطة بشكل غير مباشر ووجد أن العنصر المركزي β- يبقى قلب الورقة من البروتين منظمًا في حين أن العديد من المناطق المحيطة به α- انفتحت القفزات [177]. على الرغم من أنه لم يتم نشر تحليل أكثر اكتمالاً لمسار الطي لـ UCH-L1 ، إلا أن الطي يشبه UCH-L3 ، بحيث يحتوي كلاهما على مراحل متعددة للتكشف والانقلاب تشير إلى مسارات متوازية وعدد سكان لا يقل عن اثنين ، الدول الوسيطة المستقرة (Luo وآخرون نتائج غير منشورة).

5.3.2. الدراسات الحسابية على البروتينات المعقدة.

ألقت العديد من الدراسات الحسابية ضوءًا كبيرًا على طي البروتينات المعقدة. كانت عمليات المحاكاة الحبيبية الخشنة ممتازة في الكشف عن الآلية (الآليات) المحتملة والسمات العامة لكيفية طي البروتينات المعقدة [210 ، 211]. والين وآخرون أجرى أول محاكاة باستخدام أ جα تمثيل نموذجي لـ YibK ، وعلى غرار الدراسات التجريبية ، لاحظ مساران متوازيان للطي [210]. وخلصوا أيضًا إلى أن هناك حاجة إلى تفاعلات محددة غير أصلية تتضمن بقايا في المنطقة الطرفية C من السلسلة لكي يتماسك البروتين وينطوي بنجاح. في المقابل ، أظهر Sulkowska وزملاؤه أن التفاعلات المحلية وحدها كافية لمحاكاة طي YibK و YbeA باستخدام نموذج مبني على هيكل خشن ، على الرغم من أن عدد المسارات الناجحة كان فقط 1-2٪ [211]. أوضحت هذه المحاكاة أيضًا أن أحداث الكشف الجزئي (التراجع) كانت ضرورية لأن الترتيب الذي تتشكل به جهات الاتصال الأصلية أمر بالغ الأهمية للطي الصحيح للهيكل المعقود وأن الطي يحدث بشكل متكرر من خلال وسيط منزلق (الشكل 12 (أ)). الأهم من ذلك ، في نفس الدراسة ، أثبتت محاكاة متغير معاد توصيله وغير معقد أن هناك حواجز طوبولوجية مهمة في طي الهيكل المعقود [211]. باستخدام نموذج مشابه ، كشفت النتائج الأولية من عمليات محاكاة الكشف الحركية الحديثة لـ MTase المتجانسة بنيويًا أن كشف البروتين إلى حالة غير مطوية بالكامل غير معقد يحدث في عملية متدرجة [204]. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت عمليات المحاكاة أن فك السلسلة يكون بطيئًا مقارنة بالتكشف الأولي [199].

الشكل 12. المحاكاة الحسابية لمسارات طي البروتينات المعقدة. (أ) النموذج القائم على الهيكل المستخدم لمحاكاة طي MTase ذي العقد الثلاثية حيث يحدث مسار الطي الذي يؤدي إلى التشكل الأصلي المعقود من خلال تكوين "عقدة منزلقة" وسيط. يجب أن تستخدم التكوينات غير الصحيحة آلية "رجوع" من أجل الهروب من المصائد الحركية التي تعمل كحواجز طوبولوجية. مقتبس من [211]. (ب) لقطات مأخوذة من محاكاة الطي لـ 61-بروتين معقد ، DehI. حقوق النشر 2010 Bölinger وآخرون [154]. (ج) محاكاة ديناميات جزيئية قائمة على بنية كل الذرة لمسار الطي لـ MJ0366. يشكل البروتين حلقة مع chirality الصحيحة (I) ، والتي يتبع منها طريقان إلى الحالة الأصلية (N): مسار "توصيل" أو "منزلق". يعتبر T مثالاً على كيفية احتجاز البروتين حركيًا وبالتالي عدم تمكنه من الانتقال إلى N. مقتبس من [141]. (د) تمثيلات تخطيطية لسحب بروتين معقد ثلاثي الفصوص في نقاط مختلفة (المشار إليها بواسطة الدوائر) وتطابقها النهائي الناتج.

تم استخدام مناهج حسابية مماثلة أيضًا في محاكاة الطي لـ 61- عقدة في دهي [154]. على الرغم من أن احتمالية حدوث طيات ناجحة كانت منخفضة ، فقد كشفت الدراسة أن بنية العقد المعقدة يمكن تشكيلها من خلال عملية ربط بسيطة. في هذه الحالة ، يتم محاذاة حلقتين غير معقودتين ، وحلقة صغيرة وحلقة أكبر (تتضمن منطقة غير منظمة غنية بالبرولين) ويمكن تشكيل عقدة من خلال طريقين بديلين (الشكل 12 (ب)) [154]. في المسار الأول ، يتم تمرير الطرف C عبر الحلقة الأصغر (حلقة S) عبر تشكيل عقدة قبل أن تنقلب الحلقة الأكبر (حلقة B) فوق الحلقة الأصغر. في المسار الآخر ، يتم عكس ترتيب الخطوتين.

على النقيض من البروتينات الصغيرة جدًا ذات البنى البسيطة (التي تتميز عمومًا بمعدلات تتكشف وقابلة للطي بسرعة) ، لم يتم تطبيق محاكاة الديناميكيات الجزيئية لجميع الذرات (MD) على نطاق واسع على الأنظمة المعقدة ، لأنها غالبًا ما تكون كبيرة جدًا بحيث لا يمكن أن تكون مثل هذه الأساليب الذرية. تستخدم. ومع ذلك ، فقد كان من الممكن استخدام هذه الطريقة في حالات قليلة على البروتينات الصغيرة الضحلة ، مثل MJ0366 من M. jannaschii، أحد أصغر البروتينات ذات العقد الثلاثية التي تم اكتشافها حتى الآن [141]. كشفت البيانات المأخوذة من التحليل الديناميكي الحراري للتكشف / الطي أن النظام ثلاثي الحالات ، وأن الوسيط يتشكل أولاً عن طريق التواء الحلقة ، متبوعًا بخطوة تحديد المعدل المرتبطة بخيوط الطرف C عبر الحلقة . عند درجات حرارة قريبة من درجة حرارة الطي ، لوحظ وجود آليتين للطي لتشكيل الهيكل الأصلي المعقود ، حيث يمكن أن يحدث الخيوط عبر (1) طريق توصيل (يمر الطرف C عبر حلقة العقد أولاً) أو (2) التكوين من عقدة (الشكل 12 (ج)) [141]. ومن المثير للاهتمام أن خفض درجة حرارة المحاكاة أدى إلى تغييرات ميكانيكية. وتشمل هذه التعقيدات عبر خيوط الطرف N و "التراجع" للبروتينات المشوهة في الفخاخ الطوبولوجية. في الآونة الأخيرة ، أظهرت عمليات المحاكاة على VirC2 ، وهو بروتين له نفس الطية مثل MJ0366 ولكنه يمتلك عقدة أعمق ، أيضًا أن له ملفًا شخصيًا للطاقة الحرة مماثلًا ، مما يشير إلى أن الطوبولوجيا تلعب دورًا رئيسيًا في آلية الطي [212]. تم استخدام إمكانات شبيهة بـ Gō حيث يوجد حد أدنى من إحباط الطاقة لمحاكاة طي متحولة مقطوعة من MTase آخر معقود بثلاثية الوريقات [213]. اقترحت نتائج هذه الدراسة مسارًا يتم فيه طي المنطقة الطرفية N للبروتين أولاً وأن خيوط الطرف C عبر البنية لتشكيل العقدة هي خطوة متأخرة ومحددة للمعدل [213].

كما تم استخدام محاكاة الديناميكيات الجزيئية لمحاكاة تنكشف درجات الحرارة العالية لـ YibK [214]. كشفت عمليات المحاكاة عن ما يصل إلى أربع حالات وسيطة في مشهد الطاقة الحرة المتسقة مع المسارات المتوازية والوسائط المتعددة التي لوحظت في الدراسات التجريبية.بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن حالة YibK المشوهة غير مقيدة فقط في درجات حرارة محاكاة عالية جدًا ، عندما تخرج أطراف C من حلقة العقد عبر تشكل عقدة. تم استخدام عمليات محاكاة أخرى للكشف عن الاستقرار الميكانيكي للبروتينات المعقدة وتأثير موضع السحب وسرعة السحب ودرجة الحرارة على فتح / فك ربط اثنين من وحدات MTases الأخرى [215]. لقد تبين أن سحب السلسلة من كلا الطرفين يؤدي إلى شد العقدة بينما يمكن أن يؤدي السحب في مواضع أخرى إلى فك السلسلة (الشكل 12 (د)).

استخدمت دراسات حسابية مختلفة أيضًا محاكاة مونت كارلو على نماذج شبكية باستخدام إمكانات شبيهة بـ Gō لفهم آلية طي البروتينات المعقدة. في هذه الحالات ، يتم استخدام إمكانات تستند إلى نموذج بوليمر عام ويتم تضمين تفاعلات جذابة إضافية للمخلفات التي تتلامس مع بعضها البعض في الحالة الأصلية. أظهر Faisca وزملاؤه أن طي نموذج بروتين ثلاثي الفصوص شديد العقد كان أبطأ بكثير من متغير مشابه هيكليًا ولكن غير معقد ، وأن العقد كان حدثًا متأخرًا وملازمًا للطي [216]. باستخدام نفس النموذج ، قام سولير وفايسكا بفحص تأثير الربط السطحي على طي النظام [217]. في هذه الحالة ، تم توضيح أن تنقل الطرف الأقرب إلى العقدة أمر بالغ الأهمية لنجاح الطي ويؤدي العائق إلى انخفاض في معدل الطي وتغيير في مسار العقد بحيث يتضمن خيوط الطرف الآخر. في الآونة الأخيرة ، قامت نفس المجموعة بتوسيع هذه الدراسات واستخدمت نفس النموذج للتحقيق بمزيد من التفصيل في تأثير العقدة وعمق العقدة والعنصر على خصائص الطي لـ 31بروتينات معقّدة [180]. كشفت النتائج أن البروتينات شديدة العقد لديها احتمالية أكبر للاحتفاظ بعقدها في المجموعة المشوهة ، بما يتفق مع الدراسات التجريبية. علاوة على ذلك ، فقد تبين أن جهات الاتصال الأصلية المحددة داخل النواة ذات العقد ثلاثية الفصيلة ضرورية في الحفاظ على العقدة في حالة التشوه ، وأن الخيط يحدث في المراحل المتأخرة من الطي [180]. في الآونة الأخيرة ، وسع سولير وزملاؤه دراساتهم للتحقيق في آلية الطي الخاصة بـ 5 الأكثر تعقيدًا2- عقدة [176]. على غرار عقد ثلاثية الفصوص ، تبين أن نهاية السلسلة الأقرب إلى النواة المعقدة مهمة لحركة الخيوط لتشكيل العقدة ولم تكن في أي حال آلية تتضمن التكوين الأولي لـ 31-عقدة لوحظ. ومع ذلك ، فقد تم اكتشاف أن احتمال ما يصاحب ذلك من غزل وطي من 52البروتينات المعقدة أصغر بكثير من تلك الخاصة بالعقد ثلاثية الوريقات مثل الخيوط لتشكيل الـ 52 العقدة هي حدث توافقي متأخر بشكل خاص [176].

محاكاة مونت كارلو لـ Cα أظهر نموذج AOTCase ذو العقد الثلاثية أن الاتصالات غير الأصلية بين الطرف C والمناطق الأخرى في البروتين ضرورية لتشكيل حلقة العقد التي يتم من خلالها ربط السلسلة [218] ، بما يتوافق مع الدراسة التي أجراها والين وزملاؤه [210]. تم أيضًا إبراز أهمية التفاعلات غير الأصلية في تعزيز طي الهيكل الأصلي المعقود لـ AOTCase و MJ036 مؤخرًا في عمليات المحاكاة التي تستخدم نماذج البروتين ذات الدقة الهيكلية المختلفة (الحبيبات الخشنة أو الذرية) ومجالات القوة المختلفة (من النقية الأصلية المركزية. للذرات الواقعية) [219]. مرة أخرى ، يبدو أنه تم العثور على جهات الاتصال هذه بين الطرف C وحلقة ، يتم من خلالها ربط السلسلة.

5.3.3. الدراسات التجريبية والحسابية على العقد المنزلق.

أظهرت العديد من دراسات المحاكاة أن العقدة المنزلق قد تكون تكوينًا وسيطًا مهمًا في طي البروتينات المعقدة [141 ، 142 ، 211 ، 212] وبالتالي ، فإن فهم الآليات المتضمنة في تكوينها يمكن أن يقدم نظرة ثاقبة حول مدى عمق البروتينات المتشابكة. باستخدام عمليات المحاكاة القائمة على الحبيبات الخشنة ، قام Sulkowska وزملاؤه بالتحقيق في طي ثيميدين كيناز ووجدوا أن هيكله المنزلق يمكن تحقيقه من خلال آلية `` التقليب '' البسيطة التي تدور فيها حلقة معقودة على النواة الأصلية غير المعقدة للبروتين [211]. من المرجح أن يكون دوران الحلقة مدعومًا بوجود بقايا الجلايسين والبرولين في مناطق المفصلات [211]. ومع ذلك ، فإن معدل النجاح المنخفض لأحداث الطي التي لوحظت يشير إلى أنه قد تكون هناك حاجة إلى عوامل أخرى للتغلب على الحاجز الطوبولوجي أو أن الحاجز كبير. قامت نفس المجموعة بتوسيع هذه الدراسات واستخدمت نفس النموذج لتحليل الكشف الميكانيكي للعقدة المنزلقة في نفس البروتين [220]. أدت قوى التمدد الضعيفة إلى فك سلس للعقدة المنزلقة بينما لوحظ وجود وسيط ثابت مع عقدة مشدودة عند قوى سحب كبيرة بما فيه الكفاية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا السلوك للبنى ذات العقد المنزلق يختلف عن السلوك الملحوظ للبوليمرات المرنة بشكل منتظم [220]. في الآونة الأخيرة ، استخدم هو وزملاؤه AFM للدراسة التجريبية للتكشف الميكانيكي لـ AFV3-109 ، وهو بروتين له بنية بسيطة نسبيًا معقودة [221 ، 222]. أظهرت النتائج أن العقدة المنزلق غير مقيدة وسلسلة البولي ببتيد ممتدة بالكامل عند تطبيق قوى ميكانيكية على كلا الطرفين كما هو متوقع [221]. في المقابل ، أدى تطبيق القوى على الطرف N والحلقة الملولبة إلى تشديد العقدة المنزلق في عقدة ثلاثية الوريقات تتضمن

13 من مخلفات الأحماض الأمينية [222]. في كلتا الحالتين ، وُجد أن عملية التفتح تتقدم عبر مسارات متوازية متعددة إما بطريقة ثنائية أو ثلاثية ، وتتوافق مع آلية التقسيم الحركي للتكشف الميكانيكي [221 ، 222].

5.4. التطور والحفظ

على الرغم من حقيقة أن هناك الآن عددًا كبيرًا من البروتينات المعقدة طوبولوجيًا في PDB ، فمن الجدير بالذكر أن معظم البروتينات غير متشابكة. يشير هذا إلى أن التطور ، بشكل عام ، قد تجنب مثل هذه الهياكل. ومع ذلك ، فقد أثبتت دراسة حديثة أجراها Sulkowska وزملاؤه أنه عند حدوثها ، يتم حفظ كلٍ من الهياكل المعقدة والمتشابكة عبر عائلات مختلفة على الرغم من التشابه المنخفض جدًا في التسلسل [142]. مما لا يثير الدهشة ، أن أجزاء البروتينات المحفوظة بقوة توجد داخل النواة المعقدة ومناطق المفصلات المحتملة التي تم التكهن بها تعتبر مهمة في خيوط السلسلة لتشكيل عقدة أو عقدة منزلقة [142].

بالنسبة لبعض عائلات البروتينات ، حيث يوجد عدد كبير من المتغيرات المعقدة وغير المعقدة ، كان من الممكن إجراء تحليل جيني للتسلسلات ، وبالتالي تحديد كيفية تطور الهياكل المعقدة من أسلاف غير معروفة. قام Potestio وزملاؤه بتوليد شجرة نسج من طيات تشبه ترانسكارباميلاز [223]. في هذه الحالة ، كان معروفًا أن بعض المتغيرات المعقدة وغير المعقدة لها درجات مختلفة من هوية التسلسل مما يشير إلى مسارات حيث تباعدت الهياكل وبالتالي التسلسلات في أوقات مختلفة. على سبيل المثال ، يشترك الإنزيمان المعقودان AOTCase و SOTCase بنسبة 35٪ فقط في هوية التسلسل [224] بينما يحتوي AOTCase المعقود على 41٪ من هوية التسلسل مع OTCase غير المعقد [225]. أظهرت إعادة بناء شجرة النشوء والتطور أن جميع المتماثلات المعقدة تسكن فرعًا فرعيًا من الشجرة وأنها تختلف عن المتماثلات غير المعقدة من خلال وجود مقاطع حلقة إضافية [223]. وبالتالي ، فقد تم اقتراح أن بعض الهياكل العقدية قد تطورت من الهياكل غير المعقدة عن طريق إدخال حلقة "تعزيز العقدة" ، والتي تشمل بشكل فعال جزءًا آخر من السلسلة وبالتالي تشكل العقدة.

تورطت الحلقات أيضًا في تكوين هياكل معقودة من دراسات أخرى. استخدم Virnau وزملاؤه مناهج حسابية لإظهار أن AOTCase Transcarbamylase المعقود يمتلك حلقة صلبة غنية بالبرولين ، والتي تفتقر إلى OTCase غير المعقد (الشكل 10 (ب)) [149]. ومن المثير للاهتمام ، أن عقدة التحميل في α- حمض الهالوجيناز الهالوجيني يتكون جزئيًا أيضًا من حلقة كبيرة غنية بالبرولين تربط منطقتين غير معقدتين داخل الهيكل [154].

باستخدام نهج مختلف تمامًا ، أظهرت مجموعة Yeates أيضًا طريقًا آخر لهياكل معقودة من خلال التصميم العقلاني لهيكل جديد معقود. في هذه الحالة ، تم تكوين بروتين أحادي العقدة عن طريق اندماج سلاسل C- و N- الطرفية لجهاز homodimer الذي يشكل بنية شديدة التشابك ولكن غير معقد. أظهرت هذه الدراسة أن الاندماج الجيني والتكرار الترادفي لجين بروتين ثنائي غير معقد يمكن أن يؤدي إلى بنى معقودة ثلاثية الوريقات [207].

من الواضح أنه بمجرد تشكيلها من خلال بعض المسارات التطورية ، يتم الحفاظ على هياكل البروتين المعقدة والمتقطعة. ومع ذلك ، من خلال كل من الدراسات التجريبية والحسابية ، نعلم أيضًا أن هذه الأنواع من الهياكل لها مسارات قابلة للطي أكثر تعقيدًا من نظيراتها غير المعقدة. يشير هذا إلى أن الأشكال المعقدة والمتشابكة داخل عائلات البروتين قد تكون ، بطريقة ما ، مفيدة ومهمة إما لوظيفة البروتين أو تنظيمه.

5.5 ملخص

باختصار ، حققت كل من الدراسات التجريبية والحسابية تقدمًا كبيرًا في إنشاء بعض السمات العامة الرئيسية لمسارات طي البروتينات المعقدة طوبولوجيًا. على النقيض من البروتينات الأحادية الصغيرة ذات الطيات البسيطة ، من الواضح أن البروتينات ذات الهياكل المعقدة طوبولوجيًا أو معقودة متشابكة لها مناظر طبيعية للطاقة أكثر تعقيدًا مع العديد من الحالات الوسيطة والمسارات المتوازية. قدمت الدراسات الحسابية رؤى ثاقبة لعملية الطي ، والتي قد تتضمن تشكيل حلقة ملتوية متبوعة بخيوط عبر تكوين عقدة وسيطة أو مسار توصيل أو آلية "قلب" ، حيث قد تكون خطوة العقد محدودة السرعة [141 ، 211 ، 226]. بالإضافة إلى ذلك ، يبدو أن التفاعلات غير الأصلية قد تلعب دورًا أكثر أهمية لهذه الأنواع من الهياكل ذات البنى المعقدة مقارنةً بطي البروتينات الأصغر ذات الطيات البسيطة نسبيًا [227 - 229]. علاوة على ذلك ، فإن تكوين الأنواع غير المطوية العابرة التي تؤدي إلى مصائد حركية في مشهد الطاقة الحرة للبروتينات المعقدة طوبولوجيًا على الأرجح يتطلب أحداثًا رجعية وربما عمل المرافقين الجزيئيين بحيث يمكن تحقيق البنية الأصلية بسرعة وكفاءة. ، 211]. يتناقض مشهد الطاقة القابل للطي هذا "المحبط" مع مسارات الطي السلسة نسبيًا المقترحة لبروتينات أصغر وأبسط [192 ، 230].

أظهر عدد من الدراسات الحديثة أنه يتم الاحتفاظ بالبروتينات المعقّدة والمتشابكة مما يشير إلى أن العقدة أو العقدة المنزلقين قد تلعب دورًا في بنية البروتين أو استقراره أو وظيفته أو تنظيمه. على الرغم من هذه النتيجة ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت هناك أي خصائص مفيدة للهيكل المعقود على الهيكل غير المعقود. في الواقع ، ما إذا كانت هناك أي خصائص كيميائية أو فيزيائية لمثل هذه الهياكل تختلف اختلافًا جوهريًا عن تلك غير المعقدة. من المحتمل أن يوفر فهم هذه الخصائص وتحديدها رؤى أساسية لتطبيقات هندسة البروتين والتطورات العلاجية المستقبلية.


كان لـ CRISPR حياة قبل أن تصبح أداة لتحرير الجينات

أسلحة التطور الشامل كانت البكتيريا والعتائق المسلحة بأنظمة كريسبر في حالة حرب مع الفيروسات على مدى دهور. هنا ، تهاجم جحافل الفيروسات المعروفة باسم العاثيات البكتيريا لتحويلها إلى مصنع لصنع الفيروسات.

شارك هذا:

إنه النجم المبهر لعالم التكنولوجيا الحيوية: أداة جديدة قوية يمكنها تغيير بنية الحمض النووي بدقة وبدقة. إنه يعد بعلاجات للأمراض ، ومحاصيل أقوى ، والبعوض المقاوم للملاريا وأكثر من ذلك. الهيجان حول التقنية - المعروفة باسم CRISPR / Cas9 - على قدم وساق. كل أسبوع ، يتم نشر نتائج CRISPR الجديدة في المجلات العلمية. في المحاكم ، تتشاجر الجامعات على براءات الاختراع. تنشر وسائل الإعلام تقارير عن الاختراقات وكذلك أخلاقيات هذه اللعبة التي تغير قواعد اللعبة بشكل شبه يومي.

ولكن هناك جانب أقل لمعانًا بالترتر واللمعان لـ CRISPR ، وهو أمر مغرٍ تمامًا لأي شخص متعطش لفهم العالم الطبيعي. تأتي البيولوجيا الكامنة وراء تقنية كريسبر من معركة كانت مستعرة منذ دهور ، بعيدًا عن الأنظار ومع ذلك في كل مكان حولنا (وعلينا ، وفينا).

تعود أصول أداة التحرير CRISPR إلى الميكروبات - البكتيريا والعتيقات التي تعيش بأعداد فاحشة في كل مكان من الفتحات الموجودة تحت سطح البحر إلى المخاط في أنف الإنسان. لمليارات السنين ، كانت هذه الكائنات وحيدة الخلية على خلاف مع الفيروسات - المعروفة باسم العاثيات - التي تهاجمها ، والغزاة وفيرة لدرجة أن قطرة واحدة من مياه البحر يمكن أن تستوعب 10 ملايين. وتلعب أنظمة CRISPR الطبيعية (هناك العديد منها) دورًا كبيرًا في هذا الصراع. إنهم يعملون بمثابة حراس البوابة ، ويقومون بشكل أساسي بفهرسة الفيروسات التي تدخل الخلايا. إذا ظهر الفيروس مرة أخرى ، يمكن للخلية - ونسلها - التعرف عليه وتدميره. ستعلم دراسة هذا النظام علماء الأحياء الكثير عن علم البيئة والمرض وأنماط الحياة الكلية للحياة على الأرض.

لكن الانتقال من قصة الكتاب المدرسي البسيطة إلى الحياة الواقعية أمر فوضوي. في السنوات القليلة التي تلت تقدير الوظيفة الدفاعية لأنظمة CRISPR لأول مرة ، عمل علماء الأحياء الدقيقة على جمع العينات وإجراء التجارب وسحق رزم من بيانات الحمض النووي لمحاولة فهم ما تفعله الأنظمة. من ذلك نشأ الكثير من علم وظائف الأعضاء الأنيق ، وكتلة من التعقيد ، ومفاجآت كثيرة - وأكثر من القليل من الغموض.

اشترك للحصول على أحدث من أخبار العلوم

عناوين وملخصات من أحدث أخبار العلوم من المقالات ، يتم تسليمها إلى بريدك الوارد

زبادي فاسد

علم الأحياء معقد ، وقد استغرقت صواميله ومساميره الأساسية بعض الاكتشاف. هناك جزأان لأنظمة CRISPR / Cas: بت CRISPR وبت Cas. تم العثور على بت CRISPR - أو "التكرارات المتقطعة القصيرة المتناظرة المتباعدة بانتظام" - في أواخر الثمانينيات والتسعينيات. بعد ذلك ، صاغ العلماء القصة معًا ببطء من خلال دراسة الميكروبات التي تزدهر في أحشاء الحيوانات وفي المستنقعات المالحة ، والتي تسبب الطاعون والتي تُستخدم في صنع الزبادي والجبن اللذيذ.

لم يعرف أي من العلماء ما كانوا يتعاملون معه في البداية. لقد رأوا امتدادات من الحمض النووي بنمط مميز: أطوال قصيرة من التسلسل المتكرر مفصولة بتسلسلات أخرى للحمض النووي تُعرف الآن بالفواصل. كان كل فاصل فريدًا. نظرًا لأن قائمة الفواصل يمكن أن تختلف من خلية إلى أخرى في نوع ميكروب معين ، فقد كان الإدراك المبكر هو أن هذه الاختلافات يمكن أن تكون مفيدة في "الكتابة" في الطب الشرعي - يمكن للباحثين معرفة ما إذا كانت حالات التسمم الغذائي مرتبطة ، أو ما إذا كان شخص ما قد سرق ثقافة بداية الزبادي للشركة.

لقاءات قريبة

تستخدم البكتيريا كريسبر / كاس كشكل من أشكال المناعة أو الدفاع عن النفس ضد الغزاة. تقوم البكتيريا ببناء مكتبة من المواد الجينية من الغزاة السابقين ، بحيث إذا هاجم الغازي نفسه مرة أخرى ، يمكن للبكتيريا ونسلها تعطيلها.

إل ماررافيني /طبيعة سجية 2015 ، مقتبس من J. Hirshfeld

لكن النتائج الغريبة تراكمت. اتضح أن بعض تلك الفواصل تطابق الحمض النووي للعاقمات. في سلسلة من التقارير في عام 2005 ، أظهر العلماء ، على سبيل المثال لا الحصر ، أن سلالات بكتيريا حمض اللاكتيك العقدية الحرارية تحتوي على فواصل مطابقة للمادة الوراثية من العاثيات المعروف أنها تصيبها العقدية. وكلما زاد عدد الفواصل التي تمتلكها السلالة ، زادت مقاومة العاثيات للهجوم عليها.

بدأ هذا يشبه إلى حد كبير المناعة المكتسبة أو التكيفية ، على غرار نظام الأجسام المضادة الخاص بنا: بعد التعرض لتهديد معين ، يتذكر جهاز المناعة لديك ، وبعد ذلك تكون مقاومًا لهذا التهديد. في تجربة كلاسيكية نُشرت في علم في عام 2007 ، أظهر باحثون في شركة دانيسكو للأغذية أن الأمر كذلك. يمكنهم رؤية فواصل جديدة تضاف عندما تصيب العاثية ثقافة S. ثيرموفيلوس. بعد ذلك ، كانت البكتيريا محصنة ضد العاثية. يمكنهم هندسة فاصل فجائي بشكل مصطنع في DNA CRISPR ورؤية المقاومة تظهر عندما أخذوا الفاصل بعيدًا ، وفقدت المناعة.

كان هذا مفيدًا لصناعة يمكن أن تجد أوعية كاملة من البكتيريا التي تصنع الزبادي تم القضاء عليها بسبب غزو العاثيات. يقول رودولف بارانجو من جامعة ولاية كارولينا الشمالية في رالي ، الذي قام بالكثير من أعمال دانيسكو ، إنه كان وقتًا مثيرًا علميًا وتجاريًا. يقول: "لم يكن الأمر مجرد اكتشاف نظام رائع ، بل كشف أيضًا عن تقنية قوية لمقاومة العاثيات لصناعة الألبان".

الجزء الثاني من نظام CRISPR / Cas هو بت Cas: مجموعة من الجينات تقع بالقرب من مجموعة فواصل CRISPR. اقترحت تسلسل الحمض النووي لهذه الجينات بقوة أنها تحمل تعليمات للبروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بطريقة ما - الالتصاق به ، وقطعه ، ونسخه ، وتفكيكه. عندما قام الباحثون بإبطال مفعول جين Cas أو آخر ، رأوا أن المناعة تتعثر. من الواضح أن الجزأين من النظام - كريسبر وكاس - كانا فريقًا.

استغرق الأمر العديد من التجارب للوصول إلى النموذج الأساسي الحالي لكيفية محاربة أنظمة CRISPR / Cas للعاثيات - وليس فقط العاثيات. يمكن أن تدخل أنواع أخرى من الحمض النووي الغريب في الميكروبات ، بما في ذلك الحلقات الدائرية المسماة بالبلازميدات التي تنتقل من خلية إلى أخرى وأجزاء الحمض النووي التي تسمى العناصر القابلة للنقل ، والتي تقفز داخل الجينوم. يمكن لـ CRISPRs صد هؤلاء المتسللين ، بالإضافة إلى الحفاظ على جينوم الميكروب في ترتيب مرتب.

تعمل العملية على النحو التالي: يقوم الفيروس بحقن مادته الجينية في الخلية. عند استشعار هذا الخطر ، تختار الخلية شريطًا صغيرًا من تلك المادة الجينية وتضيفها إلى الفواصل في مجموعة كريسبر. هذه الخطوة ، المعروفة باسم التحصين أو التكيف ، تنشئ قائمة بالمواجهات التي تعرضت لها الخلية مع الفيروسات أو البلازميدات أو أجزاء غريبة أخرى من الحمض النووي بمرور الوقت - مرتبة بدقة بترتيب زمني عكسي ، من الأحدث إلى الأقدم.

يتم التخلص من الفواصل الأقدم في النهاية ، ولكن يمكن أن تنمو مجموعة CRISPR لتصبح طويلة - حامل الرقم القياسي حتى الآن هو 587 فاصلًا في Haliangium ochraceum، ميكروب محب للملح معزول عن قطعة من الأعشاب البحرية. يقول بارانجو: "يشبه الأمر النظر إلى آخر 600 لقطة كانت في ذراعك". "فكر بالامر."

فاصل جديد في مكانه ، يتم تحصين الميكروب الآن. يأتي الاستهداف في وقت لاحق. إذا دخلت هذه العاثية نفسها إلى الخلية مرة أخرى ، فسيتم التعرف عليها. قامت الخلية بعمل نسخ من الحمض النووي الريبي من الفاصل ذي الصلة ، والذي يرتبط بالنقطة المطابقة على جينوم العاثية الغازية. يقود هذا "الحمض النووي الريبي التوجيهي" بروتينات كاس إلى استهداف وقص الحمض النووي للعاثية ، مما يؤدي إلى تشويه سمكة الدخيل.

جميع شرائط كريسبر

قسّم العلماء مجموعة أنظمة كريسبر المعروفة إلى خمسة أنواع و 16 نوعًا فرعيًا بناءً على بيانات تسلسل الحمض النووي. يختلف توزيع الأنواع في العتائق والبكتيريا.

ك. ماكاروفا وآخرون / نات. القس ميكروبيو. 2015 ، مقتبس من J. Hirshfeld

يعرف الباحثون الآن أن هناك عاصفة من قصاصات الورق لأنظمة كريسبر المختلفة ، وتستمر القائمة في النمو. بعضها بسيط - مثل نظام CRISPR / Cas9 الذي تم تكييفه لتحرير الجينات في الكائنات الأكثر تعقيدًا (SN: 4/15/17 ، ص. 16) - وبعضها متقن ، مع نشر العديد من خيول البروتين لإنجاز المهمة.

أولئك الذين يتجسسوا على تطور أنظمة كريسبر يقومون بفك شفرة قصة معقدة. يبدو أن جزء صندوق أدوات كريسبر المتضمن في المناعة (إضافة الفواصل بعد حقن العاثيات لموادها الجينية) قد نشأ من نوع معين من العناصر القابلة للنقل يسمى كاسوسون. لكن الجزء المسؤول عن الاستهداف له أصول متعددة - في بعض الحالات ، يكون نوعًا آخر من العناصر القابلة للنقل. في حالات أخرى ، إنه لغز.

السلبيات

بالنظر إلى قوة أنظمة كريسبر لدرء الأعداء ، قد يعتقد المرء أن كل ميكروب محترم موجود في التربة والمخارج والبحيرات والشجاعة والخياشيم على هذا الكوكب سيكون له واحد. ليس كذلك.

الأرقام غير مؤكدة ، ويرجع ذلك جزئيًا إلى أن العلم لم يقترب من تحديد جميع الميكروبات الموجودة في العالم ، ناهيك عن فحصها جميعًا بحثًا عن كريسبر. لكن مجموعات البيانات الجينية الميكروبية المتراكمة حتى الآن تثير اتجاهات مثيرة للاهتمام.

تشير Tallies إلى أن أنظمة CRISPR أكثر انتشارًا في العتائق المعروفة مقارنة بالبكتيريا المعروفة - توجد مثل هذه الأنظمة في ما يقرب من 90 في المائة من العتائق وحوالي 35 في المائة من البكتيريا ، كما يقول يوجين كونين ، عالم الأحياء التطوري الحسابي في المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، Md. العتائق والبكتيريا ، على الرغم من صغر حجمها وحيدة الخلية ، على طرفي نقيض من شجرة الحياة.

يقول كونين ، ربما الأهم من ذلك ، أن جميع الميكروبات المعروفة تقريبًا التي تعيش في بيئات فائقة الحرارة بها كريسبر. تشير النماذج الحسابية لمجموعته إلى أن أنظمة CRISPR تكون مفيدة للغاية عندما تواجه الميكروبات مجموعة كبيرة ومتنوعة من الفيروسات لجعل الذاكرة التكيفية جديرة بالامتلاك. ولكن إذا كان هناك الكثير من التنوع والفيروسات تتغير بسرعة كبيرة ، فإن CRISPRs لا تساعد حقًا - لأنك لن ترى نفس الفيروس مرة أخرى. ويقول إن الأنظمة البيئية فائقة السرعة تتمتع بقدر ثابت من تنوع العاثيات ليس مرتفعًا جدًا أو منخفضًا.

وأنظمة كريسبر لها سلبيات. مثلما يمكن للناس تطوير تفاعلات المناعة الذاتية ضد أجسامهم ، يمكن للبكتيريا والعتيقات أن تصنع عن طريق الخطأ فواصل كريسبر من أجزاء من الحمض النووي الخاص بها - وتخاطر بمضغ المواد الجينية الخاصة بها. رأى الباحثون هذا يحدث. يقول روتم سوريك ، عالم الجينوم الميكروبي في معهد وايزمان للعلوم في ريهوفوت بإسرائيل: "لا توجد مناعة بدون تكلفة".

لكن الأخطاء نادرة ، وقد اكتشف سوريك وزملاؤه مؤخرًا سبب ذلك في الميكروب الذي يدرسونه. أفاد الباحثون في طبيعة سجية في عام 2015 ، تم إنشاء فواصل كريسبر من أجزاء خطية من الحمض النووي - ويكون الحمض النووي للعاثية خطيًا عندما يدخل الخلايا. الكروموسوم البكتيري محمي بسبب شكله الدائري. إذا انكسر وأصبح خطيًا لتعويذة ، كما هو الحال عند تكرارها ، فإنه يحتوي على إشارات تمنع بروتينات Cas.

هناك سلبيات أخرى لأنظمة كريسبر. ليس من المكافأة دائمًا إبعاد العاثيات والغزاة الآخرين ، والتي يمكن أن تجلب أحيانًا أشياء مفيدة. الإشريكية القولونية O157: H7 ، من شهرة التسمم الغذائي ، يمكن أن تجعل البشر مرضى بسبب الجينات السامة التي تحملها والتي تم جلبها عن طريق العاثية ، على سبيل المثال لا الحصر من الأمثلة التي لا تعد ولا تحصى. حتى أنظمة كريسبر نفسها منتشرة في جميع أنحاء المملكة الميكروبية عبر العاثيات أو البلازميدات أو العناصر القابلة للنقل.

بالنسبة للميكروبات التي تفتقر إلى أنظمة كريسبر ، هناك العديد من الطرق الأخرى لصد الحمض النووي الغريب - قد يتم تخصيص ما يصل إلى 10 في المائة من الجينوم الميكروبي للحرب الصقورية ، ولا يزال يتم الكشف عن أنظمة دفاع جديدة.

التدابير المضادة

الحرب بين البكتيريا والعاقمات ثنائية الجانب بالطبع. تمامًا كما يريد الميكروب إبقاء الأبواب مغلقة لحماية سلامته الوراثية والهروب من الدمار ، فإن العاثية تريد الدخول.

وهكذا تقاوم العاثية كريسبر. يتحول وراثيًا إلى أشكال لم تعد تتعرف عليها كريسبر. أو أنها تصمم مدفعية حسب الطلب. اكتشف عالم الأحياء الدقيقة جو بوندي دينومي ، الذي يعمل حاليًا في جامعة كاليفورنيا ، سان فرانسيسكو ، أسلحة مخصصة مثل طالب خريج في مختبر عالم الأحياء الدقيقة الجزيئية ألان ديفيدسون في جامعة تورنتو. علم الفريق أن البكتيريا الزائفة الزنجاريةالتي تعيش في التربة والمياه ويمكن أن تسبب التهابات خطيرة ، لديها نظام كريسبر قوي. ومع ذلك ، لا يبدو أن بعض العاثيات منزعجة منه.

وذلك لأن تلك العاثيات تحتوي على بروتينات صغيرة تلتصق وتتداخل مع هذا الجزء أو ذاك من آلية كريسبر ، مثل إنزيم كاس الذي يقطع الحمض النووي للعاثيات. أفاد الباحثون في عام 2015 أن الربط يعطل نظام كريسبر طبيعة سجية. ومنذ ذلك الحين ، وجد بوندي دينومي وآخرون جينات مضادة لـ CRISPR في عاثيات أخرى وأنواع أخرى من الحمض النووي المتداخل. يقول ديفيدسون إن الجينات شائعة جدًا لدرجة أنه يتساءل عن عدد أنظمة كريسبر النشطة حقًا.

في تطور غريب بشكل خاص ، وجدت عالمة الأحياء الدقيقة كيمبرلي سيد من جامعة كاليفورنيا ، بيركلي عاثية تحمل نظام كريسبر الخاص بها وتستخدمه لمحاربة بكتيريا الكوليرا التي تغزوها ، حسبما أفادت هي وزملاؤها في عام 2013 في طبيعة سجية. إنه يقطع جزءًا من الحمض النووي البكتيري الذي يمنع عادةً عدوى العاثيات.

بالطبع ، في هذا الشجار الذي لا ينتهي ، يتوقع المرء أن تكافح الميكروبات مرة أخرى ضد العاثيات. يقول بوندي دينومي: "إنه شيء يسألني كثيرًا:" رائع ، توجد مضادات CRISPRs ، لذا أين توجد مضادات CRISPRs؟ " لم يعثر أحد على مثل هذه الأشياء بعد.

محركات التطور

يعد دراسة أنظمة كريسبر في إعدادات معملية يتم التحكم فيها جيدًا أو في نوع واحد فقط من الميكروبات أمرًا واحدًا. من الأمور الأخرى أن نفهم ما تفعله جميع أنواع CRISPRs المختلفة لتشكيل النظام البيئي لنبع حار فقاعات ، أو أمعاء بشرية ، أو رئة مريضة ، أو نهر ملوث بالكوليرا. يمكن أن تنخفض تقديرات وفرة كريسبر مع إجراء المزيد من العينات ، خاصةً من ميكروبات الحصان الأسود التي لا يعرف الباحثون عنها سوى القليل.

في تقرير عام 2016 في اتصالات الطبيعةعلى سبيل المثال ، اكتشف عالم الأحياء الدقيقة جيل بانفيلد وزملاؤه من جامعة كاليفورنيا في بيركلي 1724 ميكروبًا في المياه الجوفية في كولورادو تمت معالجتها لزيادة وفرة الأنواع التي يصعب عزلها. كانت أنظمة كريسبر أكثر ندرة في هذه العينة منها في قواعد بيانات الميكروبات المعروفة.

يعد حساب CRISPRs مجرد بداية ، بالطبع. المجتمعات الميكروبية - بما في ذلك تلك الموجودة داخل أحشائنا ، حيث يوجد الكثير من أنظمة CRISPR والعاقمات - ديناميكية وليست مجمدة. كيف تشكل كريسبر تطور العاثيات والميكروبات في البرية؟ تعاونت مختبرات بانفيلدز وبارانجو لمشاهدة S. ثيرموفيلوس والعاثيات المحتضنة معًا في وسط حليب لمئات الأيام. لاحظ الفريق انخفاض أعداد البكتيريا مع غزو العاثيات ، ثم اكتسبت البكتيريا فواصل ضد العاثية وانتشرت - وانخفضت أعداد العاثيات بدورها. ثم نشأت أعداد جديدة من العاثيات ، محصنة ضدها S. ثيرموفيلوس الدفاعات بسبب التغيرات الجينية. بهذه الطريقة ، أفاد الباحثون في عام 2016 في مبيو، تعد كريسبر "أحد المحركات الأساسية لتطور العاثيات."

يمكن التقاط أنظمة كريسبر وإسقاطها ثم التقاطها مرة أخرى بواسطة البكتيريا والعتائق بمرور الوقت ، ربما مع تغير الظروف والاحتياجات. البكتيريا ضمة الكوليرا مثال على هذه الديناميكية ، كما أفاد Seed وزملاؤه في عام 2015 في مجلة علم الجراثيم. كانت السلالات القديمة والكلاسيكية لهذه الآفة الطبية تؤوي كريسبر ، لكن هذه السلالات انقرضت إلى حد كبير في البرية في الستينيات. السلالات التي تسبب الكوليرا اليوم لا تحتوي على كريسبر.

يقول سيد: لا أحد يعرف السبب. لكن العلماء يؤكدون أنه من الخطأ وصف العلاقة بين الميكروبات والعاقمات والبلازميدات والعناصر القابلة للنقل باعتبارها حربًا مبسطة. لا تدمر العاثيات دائمًا الخراب ، بل يمكنها أن تنزلق جينوماتها بهدوء إلى الكروموسوم البكتيري وتتعايش بشكل حميد ، ويتم نسخها جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي للمضيف. يمكن أن تمنح العاثيات والبلازميدات والعناصر القابلة للنقل سمات جديدة ومفيدة - حتى في بعض الأحيان سمات أساسية. في الواقع ، فإن مثل هذه الحركة للحمض النووي عبر الأنواع والسلالات هي جوهر كيفية تطور البكتيريا والعتائق.

لذا فالأمر يتعلق بإيجاد التوازن. يقول لوتشيانو مارافيني ، عالم الأحياء الدقيقة الجزيئية في جامعة روكفلر في مدينة نيويورك ، والذي أظهر عمله لأول مرة أن قطع الحمض النووي كان مفتاح أنظمة كريسبر: "إذا قمت بدمج الكثير من الحمض النووي الغريب ، فلا يمكنك الحفاظ على الأنواع". لكنك تحتاج إلى السماح بدخول بعض الحمض النووي ، ومن المحتمل أن تسمح بعض أنظمة CRISPR بهذا: النظام الذي يدرس فيه المكورات العنقودية البشروية، على سبيل المثال ، لا تلاحق إلا العاثيات الموجودة في حالة قتل الخلايا ، أو الحالة التحليلية ، كما أفاد هو وزملاؤه في عام 2014 في طبيعة سجية.

تستمر القصة بعد الرسم

طريقان للسفر

لا تدمر العاثيات دائمًا الميكروبات التي تغزوها. لدى العديد منها حالتان: يمكنهم اختيار أنظمة تصنيع البروتين والحمض النووي الريبي في الخلية لإنتاج كميات أكبر من أنفسهم ، في ما يسمى بالدورة "اللايتية" ، مما يؤدي في النهاية إلى قتل الخلية. أو يمكنهم إدخال مادتهم الجينية في الكروموسوم المضيف ، ليتم نسخها بشكل سلبي في كل مرة تنقسم فيها الخلية ، في الدورة "اللايسوجينية". يمكن أن تكون هذه المادة الجينية المدمجة مفيدة للبكتيريا في بعض الأحيان.

إي أوتويل

المصادر: رون فينير وآخرون / نات. القس ميكروبيول. 2015 "دورات Lytic و Lysogenic من البكتيريا." علم الأحياء بلا حدود ، أغسطس 2016. bit.ly/boundless-phage

ما وراء الدفاع

هناك شيء واحد واضح جدًا حول أنظمة CRISPR: إنها محيرة من نواح كثيرة. كبداية ، يجب أن تعكس الفواصل في الميكروب قصته الخاصة والفردية عن العاثيات التي واجهها. لذلك قد تعتقد أنه سيكون هناك سلالات محلية ، وأن البكتيريا المأخوذة من فرنسا سيكون لها مجموعة فواصل مختلفة عن بكتيريا مأخوذة في الأرجنتين. ليس هذا ما يراه الباحثون دائمًا.

خذ المقرفة P. الزنجارية. راشيل ويتاكر ، عالمة الأحياء الميكروبية في جامعة إلينوي في أوربانا شامبين ، تدرس الزائفة تم جمع عينات من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي ، والذين تصاب رئتهم بعدوى مزمنة. لم تجد أي علامة على أن مريضين يعيشان بالقرب من بعضهما البعض يحملان المزيد من التشابه P. الزنجارية CRISPRs من مريضين على بعد آلاف الأميال. ومع ذلك ، من المؤكد أن المرء يتوقع أن تكون CRISPRs القريبة أقرب إلى التطابق ، لأن الزائفة واجهت عاثيات مماثلة. يقول ويتاكر: "إنه أمر غريب للغاية".

رأى آخرون الشيء نفسه في البكتيريا المحبة للحرارة المأخوذة من ينابيع حارة بعيدة جدًا. يقول كونستانتين سيفيرينوف ، الذي يدرس أنظمة كريسبر بجامعة روتجرز في نيو برونزويك بولاية نيوجيرسي ، إن الأمر يبدو كما لو أن العلماء لا يفهمون حقًا كيفية انتشار البكتيريا في جميع أنحاء العالم - فقد يكون هناك تأثير قوي للمرور البعيد عن طريق الهواء أو الرياح.

الغزاة مع الفوائد

NIAID / FLICKR (CC BY 2.0) Y_TAMBE / WIKIMEDIA COMMONS (CC BY-SA 3.0)

في بعض الأحيان تكون هناك مكافآت عندما يدخل الحمض النووي الغريب في الخلية. تم إرجاع القدرة على التهرب من المضادات الحيوية ومقاومة المعادن الثقيلة إلى جينات من العاثيات والبلازميدات والعناصر القابلة للنقل.

  • المكورات العنقودية الذهبية (أعلى اليسار)، السالمونيلا تيفيموريوم والبكتيريا الأخرى المسببة للأمراض أصبحت مقاومة لعقاقير المضادات الحيوية بمساعدة جينات المقاومة المحمولة على البلازميدات والعناصر القابلة للنقل والحمض النووي للعاثية. غالبًا ما يتم نقل جينات متعددة معًا.
  • الإشريكية القولونية O157: H7 يحتوي على سموم الشيغا ، هدية من الحمض النووي للعاثية ، من بين الصفات المستوردة الأخرى التي تجعل البكتيريا خطرة.
  • سلالات بكتريا قولونية, الزائفة الزنجارية (فوق على اليمين)، العصوية الرقيقة والبعض الآخر مقاوم للمعادن الثقيلة ، مثل الزئبق والزرنيخ والكروم. توجد هذه البكتيريا في المياه الملوثة وفي المستشفيات ، حيث تستخدم المعادن الثقيلة كمطهرات. غالبًا ما تنقل البلازميدات والعناصر القابلة للنقل المقاومة.
  • ريزوبيوم ليجومينوساروم وغيرها من الجذور الجذرية يمكن أن تسحب النيتروجين من الهواء وتجعله متاحًا للنباتات بسبب الجينات الموجودة على البلازميدات التي تؤويها البكتيريا.

الغرابة الأخرى هي القوة المختلفة لأنظمة كريسبر. البعض نشيط جدا. يرى عالم الأحياء الجزيئية ديفاكي بهايا من قسم بيولوجيا النبات في معهد كارنيجي للعلوم بجامعة ستانفورد علامات واضحة على إضافة الفواصل وإسقاطها بشكل متكرر في البكتيريا الزرقاء في الينابيع الساخنة في يلوستون ، على سبيل المثال. لكن الأنظمة الأخرى بطيئة ، و بكتريا قولونية، العمود الفقري الكلاسيكي لأبحاث علم الوراثة ، لديه نظام كريسبر ذو مظهر محترم - تم إيقاف تشغيله.

ربما كان متوقفًا لفترة طويلة. منذ حوالي 42000 عام ، مات طفل ماموث صوفي في ما يعرف الآن بشمال غرب سيبيريا. تم العثور على البقايا ، في عام 2007 ، في حالة جيدة لدرجة أن الأمعاء كانت سليمة و بكتريا قولونية يمكن استخراج الحمض النووي.

في بحث نُشر في علم البيئة الجزيئية في كانون الثاني (يناير) ، وجد فريق سيفرينوف أوجه تشابه مفاجئة بين الفواصل في مشتق الماموث بكتريا قولونية مجموعة كريسبر وتلك الموجودة في العصر الحديث بكتريا قولونية. "لم يكن هناك دوران في كل ذلك الوقت" ، يتساءل سيفرينوف. إذا لم يكن نظام CRISPR نشطًا ، فلماذا يتم ذلك بكتريا قولونية عناء الاحتفاظ بها؟

يقود هذا المأزق بدقة إلى ما يشير إليه بعض الباحثين على أنه "موقف فاضح" فكريا.

في بعض الحالات ، يتطابق التسلسل الجيني للفواصل بشكل جيد مع الحمض النووي للعاثية. ولكن بشكل عام ، فإن جزءًا فقط (حوالي 1 إلى 2 في المائة) من الفواصل التي يعرفها العلماء قد تم مطابقته مع فيروس أو بلازميد. في بكتريا قولونية، الفواصل لا تتطابق مع العاثيات التقليدية المعروفة بأنها تصيب البكتيريا. "هل هو وجود كمية ضخمة وغير معروفة من المادة المظلمة الفيروسية في العالم؟" يقول Koonin - أم أن العاثيات تتطور بسرعة فائقة؟ "أم أنه شيء مختلف تماما؟"

في مواجهة هذا اللغز ، يشك بعض الباحثين بشدة - ولديهم أدلة - أن أنظمة كريسبر قد تفعل أكثر من الدفاع عن أنها قد تكون لها وظائف أخرى. التواصل ، ربما. أو تشغيل الجينات وإيقافها.

لكن تسلسل كريسبر لبعض الميكروبات فعل يكون له معنى ، خاصة إذا نظرنا إلى الفواصل المضافة مؤخرًا ، وقد يكون البعض الآخر أدلة على العاثيات التي لا تزال غير مكتشفة. لذا ، حتى وهم يخدشون رؤوسهم حول العديد من الأشياء التي تعمل بتقنية CRISPR ، فإن العلماء متحمسون أيضًا للقصص التي يمكن أن تخبرها مجموعات CRISPR عن الفيروسات وأجزاء أخرى من الحمض النووي التي تواجهها البكتيريا والعتيقة والتي اختاروا ، لأي سبب كان ، تدوينها للتسجيل. . ما الذي تنتبه إليه الميكروبات؟ ماذا يتجاهلون؟

تقدم كريسبر نافذة جديدة مشرقة على مثل هذه الأسئلة ، وفي الواقع ، بدأت بالفعل في الكشف عن عاثيات وحقائق جديدة حول من يصيب من في العالم المجهري.

"يمكننا تصنيف كل ما هو موجود. تقول بوندي دينومي: "لكننا لا نعرف حقًا ما هو المهم". "يمكن أن تساعدنا CRISPRs على الفهم."

روزي ميستل كاتبة مستقلة تقيم في لوس أنجلوس.

تظهر هذه المقالة في عدد ١٥ أبريل ٢٠١٧ من أخبار العلوم مع العنوان & # 8220 ، كريسبر الأصلي: قبل أن يصبح أداة مشهورة ، كان محرر الجينات سلاحًا في حرب مجهرية لا تنتهي.”

أسئلة أو تعليقات على هذه المقالة؟ راسلنا على [email protected]

تظهر نسخة من هذه المقالة في عدد 15 أبريل 2017 من أخبار العلوم.

اقتباسات

R. Barrangou et al. يوفر كريسبر المقاومة المكتسبة ضد الفيروسات في بدائيات النوى. علم. المجلد. 315 ، 23 مارس 2007 ، ص. 1709. دوى: 10.1126 / العلوم 1138140.

إس. لاندر. أبطال كريسبر. زنزانة. المجلد. 164 ، 14 يناير 2016 ، ص. 18. دوى: 10.1016 / j.cell.2015.12.041.

لوس أنجلوس ماررافيني. مناعة كريسبر-كاس في بدائيات النوى. طبيعة سجية. المجلد. 526 ، 1 أكتوبر 2015 ، ص. 55. دوى: 10.1038 / Nature15386.

D. Paez-Espino et al. الكشف عن فيروم الأرض. طبيعة سجية. المجلد. 536 ، 25 أغسطس 2016. ص. 425. دوى: 10.1038 / nature19094.


4 تطبيقات

4.1 البنى النانوية Plasmonic القائمة على الحمض النووي

تُظهر الجزيئات اللولبية عادةً امتصاصًا مختلفًا للضوء المستقطب دائريًا باليد اليمنى واليسرى - وهي خاصية تُعرف باسم ثنائية التعميم (CD) ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع لتوصيف الهياكل الجزيئية اللولبية. [133] عندما يتم رسم الفرق بين امتصاص الضوء المستقطب الأيمن والأيسر كدالة لطول الموجة ، يظهر نمط من القمم والوديان بسبب تماثل الجزيئات الأساسية التي تعمل كنوع من بصمة للجزيء . معظم الوسائط التي تعرض إشارة قرص مضغوط لها استجابة بصرية ضعيفة للغاية. [134] ومع ذلك ، يمكن تضخيم الاستجابة الضوئية الضعيفة باستخدام الهياكل النانوية البلازمية. [135 ، 136] على سبيل المثال ، Kneer et al. أظهر استجابة CD محسّنة لورقة اوريغامي DNA عند وضعها بين جسيمتين من الذهب النانوي. [137]

يعتبر مأكل الطحين كمًا من التذبذب الجماعي لغاز الإلكترون الحر في المعدن ، [138] والذي يمكن أن يُثار بضوء تردد (طنين) معين يعتمد على الهندسة. إذا كان الطول الموجي للإثارة مشابهًا لحجم الجسيم المعدني أو أطول منه (حجم الجسيمات عادة من عشرات إلى مئات النانومتر) ، فإن مأكل الطحين يكون موضعيًا على سطح الجسيم. عندما يتم تحفيز مأكل الطحين ، يتصرف غاز الإلكترون في الجسيم مثل ثنائي القطب بسيط يتأرجح موازٍ لاتجاه المجال الكهربائي المتذبذب ، مما يعزز المجال الكهربائي ضمن طول موجي واحد من سطح الجسيم (منطقة المجال القريب) ويزيد من الجسيم. مقاطع عرضية لكل من التشتت والامتصاص. في حالة وجود جسيم آخر له تردد رنين مماثل في منطقة المجال القريب ، يمكن تشكيل وضع هجين جماعي. يمكن أن تتشكل الأنماط البلازمية اللولبية إما في مجموعات الجسيمات النانوية اليدوية أو في مجموعات مجمعة من الجسيمات النانوية الرنانة الفردية. [139] هذا النوع من الاستجابة الضوئية أقوى بكثير من تلك الخاصة بالجزيئات اللولبية ويمكن اكتشافه في نظام الضوء المرئي ، وهو أمر مرغوب فيه للغاية لتطبيقات الاستشعار.

يمكن أن يكون تصنيع أجهزة plasmonic اللولبية باستخدام طرق الطباعة الحجرية التقليدية مكلفًا وعرضة للخطأ ، لا سيما إذا كانت الأجهزة بها أشكال هندسية ثلاثية الأبعاد معقدة. نظرًا لكونه قويًا ودقيقًا وقابلًا للبرمجة ، فقد سمح التجميع الذاتي للحمض النووي بتصنيع بنى نانوية معقدة في المحلول. [108 ، 129 ، 132] يمكن لجزيئات الدنا إما ربط الجسيمات النانوية المعدنية بالشكل الهندسي الموصوف [108 ، 128] أو تعمل كقالب لتجميع الجسيمات النانوية المعدنية. [129 ، 131 ، 140] كما تم استخدام هياكل نانوية DNA ذاتية التجميع لبناء هياكل نانوية معدنية بالكامل بخصائص plasmonic مصممة. [141] لاحظ أنه في الهياكل البلازمية التي تمت مناقشتها هنا ، يعمل الحمض النووي كقالب يتم على أساسه ترتيب جسيمات plasmonic بطريقة مراوان.

كان أحد أقدم الأمثلة على البنية النانوية للحمض النووي البلازموني هو هرم الحمض النووي الذي يحتوي على أربعة جسيمات نانوية ذهبية مختلفة الحجم موضوعة عند رؤوس الهرم عن طريق خيوط الحمض النووي المرتبطة تساهميًا (شكل 5 أ). [108] أظهر جوفوروف وزملاؤه نظريًا أن جزيئات الذهب النانوية المرتبة على مثل هذه الأجسام على شكل هرم ، وكذلك على الحلزونات ، يجب أن تُظهر استجابة CD قوية في نظام الضوء المرئي ، متجاوزًا استجابة الجزيئات الطبيعية اللولبية. يان وآخرون.تم قياس استجابة القرص المضغوط تجريبياً من بنية نانوية هرمية للحمض النووي ، [128] مما يوضح أنه يمكن التحكم بدقة في شدة أطياف القرص المضغوط من خلال الترتيب المكاني لأنواع مختلفة من الجسيمات النانوية عند رؤوس الهرم (الشكل 5 ب). تم أيضًا تحقيق ترتيب شبيه بالهرم مكون من أربع جسيمات نانوية باستخدام حزمة أوريغامي من الحمض النووي تشبه الصفائح من خلال ربط ثلاث جسيمات نانوية ذهبية بجانب واحد من ورقة أوريغامي الحمض النووي والرابعة بالجانب الآخر ، مما يؤدي إلى إنشاء ترتيب مراوان. تم تجميع جزيئات الحمض النووي المعدنية الحلزونية بواسطة Kuzyk وزملاؤه من خلال تزيين قضيب اوريغامي مكون من 24 حلزونًا مكونًا من 10 جسيمات نانوية ذهبية مرتبة في نمط حلزوني. [142] تم العثور على استخدام اليد في ترتيب الجسيمات النانوية في مثل هذه الهياكل لقلب علامة انزياح زاوية القرص المضغوط في نظام الضوء المرئي.

إن دمج العناصر النشطة بصريًا في هياكل نانوية DNA الديناميكية التوافقية يجعل من الممكن تعديل النشاط البصري لمثل هذه الهياكل النانوية بواسطة المحفزات الخارجية. يمكن تحفيز الانتقال المطابق في البنية النانوية للحمض النووي إما عن طريق تغيير بيئة البنية النانوية أو باستخدام أشكال تصميم تقنية النانو الديناميكية للحمض النووي ، بما في ذلك خيوط الحمض النووي ذات القفل والمفتاح وإزاحة الشريط بوساطة الأصابع. [131] شرايبر وآخرون. [129] استخدمت الهياكل النانوية المعدنية الدنا الحلزونية لبناء أنظمة تعدل الاستجابة الضوئية عند التجفيف أو إعادة التميؤ (الشكل 5 ج). في هذه الأنظمة ، أدى التجفيف أو إعادة التميؤ إلى تغيير شكل الهياكل النانوية فيما يتعلق بالسطح الذي تم ربطها به ، مما أدى إلى تحويل اتجاه استجابة القرص المضغوط من الطبيعي إلى السطح في ظل الظروف الرطبة إلى موازاة السطح عند التجفيف. في دراسة جذرية ، Kuzyk وآخرون. قام بتجميع حزمتين من الأوريغامي المكونة من 14 حلزونيًا ، كل واحدة مزينة بنانورود ذهبي ، على شكل صليب واستخدمت خيوط دنا مساعدة لتبديل اتجاه الحزم من التوازي إلى الطبيعي والعكس بالعكس. [143] تم استخدام مبدأ مشابه لتحقيق بنى نانوية قابلة للتحويل إلى درجة الحموضة ، [130 ، 144] حيث تقارب معدل الحموضة لثلاثة توائم TAT / CGC في خيوط قفل الحمض النووي (الشكل 5 د). تبين أن طلاء قضبان الذهب بطبقة من الفضة يزيد بشكل كبير من الاستجابة الضوئية لأنظمة nanorod. [145] لان وآخرون. [131] أظهر التبديل بين أكثر من حالتين مراوان باستخدام هيكل تم فيه ربط العديد من العصي النانوية الذهبية بقالب أوريغامي للحمض النووي على شكل حرف V (الشكل 5 د). يمكن تحويل الهيكل المطوي إلى هيكل ممتد عن طريق إضافة خيوط DNA للقفل والمفتاح (التبديل 1 في الشكل 5 هـ) ، وأيضًا من المطابقات من اليد اليسرى إلى المطابقة اليمنى عبر تفاعل إزاحة حبلا بوساطة موطئ القدم (التبديل 2 في الشكل 5 هـ). في مقاربة أخرى ، [146] تم التحكم في التوجيه المتبادل للعديد من العصي المعدنية النانوية المرتبطة بطبقات متعددة من قضبان وأوراق اوريغامي الحمض النووي عن طريق خيوط مانعة ومنشطة ، مما أدى إلى تحقيق ثمانية أيسومرات بلازمونية متميزة.

جعل اقتران الجسيمات النانوية المعدنية بسقالة DNA من الممكن تضخيم التغييرات في استجابة القرص المضغوط التي تسببها التفاعلات الجزيئية لتطبيقات الاستشعار الحيوي. تم وصف أحد هذه المستشعرات بواسطة Ma et al. ، [132] حيث تم التوسط في التجميع الذاتي للعودات النانوية الذهبية عن طريق تهجين خيط التحليل إلى خيوط مترافقة مع العصي النانوية (الشكل 5f). في التجميع ، تم العثور على توصيل أحد nanorod بالآخر عبر دنا دوبلكس لتدوير أحد nanorod فيما يتعلق بالآخر ، مما يعطي النظام استجابة CD. تم العثور على سعة استجابة القرص المضغوط تزداد مع تركيز تحليل الحمض النووي والسماح باكتشاف تحليل الحمض النووي الموجود بتركيزات أتومولار.

4.2 DNA Spintronics

يضمن الانحناء الجوهري للجزيء اللولبي أنه عندما يتحرك الإلكترون من خلاله ، يتم إنشاء مجال مغناطيسي فعال. يعمل هذا المجال المغناطيسي على العزم المغناطيسي للإلكترون ، ونتيجة لذلك ، يختلف احتمال النفق عبر الجزيء اللولبي للإلكترونات ذات الدوران المعاكس. يشار إلى هذه الظاهرة باسم انتقائية الدوران المستحثة (كيبك) ، [148 ، 151 ، 152] تظهر بشكل تخطيطي في شكل 6 أ. يمكن إرجاع الأصول الفيزيائية لـ CISS إلى اقتران الدوران المغزلي ، وهو تأثير نسبي ينشأ من عزم الدوران المغناطيسي الذي يمارس على الإلكترون عندما يدور حول النواة. [153 ، 154] عند التفكير في مادة ثنائية الأبعاد ذات تناظر مكسور ، مثل السطح البيني ، فإن تيارات الإلكترون والدوران تقترن من خلال تأثير راشبا ، [153 ، 154] مما يسمح بمعالجة درجات الحرية المغزلية عبر المجال الكهربائي .

أظهرت التجارب أن جزيئات dsDNA يمكن أن تنتج تأثير كيبك قابل للقياس [148 ، 149] (الشكل 6 ب). في هذه التجارب ، تم امتصاص جزيئات ssDNA الثيولاتية على ركيزة Ni بينما ارتبطت خيوط ssDNA التكميلية بجسيمات الذهب النانوية. عند تهجين الحوامل ، تم تشكيل تقاطعات Ni-dsDNA-Au وتم فحص موصليةها الكهربائية باستخدام AFM مع طرف موصل يعمل في وضع التلامس. [148 ، 149] تم استخدام مغناطيس دائم لمغنطة ركيزة Ni ، مما أدى إلى إنشاء نطاقي توصيل في ركيزة Ni: نطاق واحد يتوافق مع الإلكترونات ذات الدوران المحاذي مع المجال المغناطيسي والآخر محاذاة عكس المجال المغناطيسي. النتيجة أناالخامس تظهر المنحنيات في الشكل 6 ب ، أسفل. عندما يتماشى اتجاه الدوران لركيزة Ni مع اتجاه النقل المفضل عبر الجزيء اللولبي ، يكون التيار أعلى مقارنةً بالوقت الذي تكون فيه ركيزة Ni ممغنطة في الاتجاه الآخر. نلاحظ أن أنا - ف المنحنيات متماثلة ، مما يعني أن الإلكترونات ذات الدوران المعاكس تتدفق من الذهب إلى النيكل عند تطبيق انحياز معاكس. نلاحظ كذلك أنه ، في spintronics DNA ، يحدث النفق بين المدارات العطرية للقواعد النووية ، ومع ذلك ، فإن الجزيئات اللولبية بدون مجموعات عطرية تظهر هذا التأثير أيضًا. يمكن أن يحدث هذا النوع من انتقائية السبين في أي مكان توجد فيه إمكانية لولبية.

أحد التطبيقات المحتملة لتأثير انتقائية الدوران في الحمض النووي هو تقسيم الماء الكهروكيميائي (الشكل 6 ج). يتم فصل الماء ، وهو عبارة عن قطعة واحدة مغزلية (لا تحتوي على إلكترونات غير مقترنة) ، في H2 (الفردي) و O2 (بشكل طبيعي في حالة الدوران الثلاثي ، مع دوران إجمالي واحد) ممنوع الدوران ، وبالتالي ، فإن هذه العملية بطيئة. [147] يمكن أن يساعد اختيار السبين في تسريع هذه العملية. في التجارب التي أجراها Mtangi وآخرون ، تم ربط جزيئات CdSe النانوية (الحمراء) بـ TiO2.2 الجسيمات النانوية ، ثم TiO22 تم ربط الجسيمات النانوية بالقطب الكهربائي الموصل لأكسيد القصدير المشبع بالفلور (FTO) ، ليكون بمثابة القطب الموجب. كان القطب Pt بمثابة الكاثود ، وتم إنتاج الهيدروجين من هذا الجانب. بسبب وجود الجزيئات اللولبية ، يمكن نقل الإلكترونات ذات حالة الدوران الواحدة من CdSe إلى التيتانيا. وبالتالي ، تم تحديد اتجاه الدوران للثقوب في الجسيمات النانوية CdSe بشكل جيد. نظرًا لأن ذرات الأكسجين لها نفس الدوران غير المزدوج ، فإن احتمال تكوين O2 كانت أعلى بكثير مما كانت عليه في نظام لا يحتوي على جزيئات مراوان. [150]

بسبب قابليتها للتبديل ووقت الاتساق الطويل ، تعد أنظمة الدوران مرشحة واعدة لتخزين المعلومات الكمومية. من الممكن أيضًا استخدام كيبك في بناء جهاز ذاكرة الدوران ، وقد تم تحقيقه تجريبيًا للعديد من الجزيئات (ولكن ليس الحمض النووي) اللولبية. [155-157] يوضح الشكل 6 د تصميم الذاكرة المستندة إلى كيبك ، والتي يمكن أن تستخدم dsDNA كجزيء مرشح كيبك. تصور اللوحة اليسرى للشكل 6 د ذاكرة كهربائية ، مكتوبة ومقرأة بواسطة التيار الكهربائي ، كما تصورها Koplovitz et al. [157] يتم أولاً ممغنط الجسيمات النانوية المغناطيسية الحديدية (الحمراء) في الاتجاه المضاد المحاذي لاتجاه الدوران ويفضل الانتقال من الركيزة إلى الجسيمات النانوية. للكتابة في الذاكرة ، يتم تطبيق جهد عالي عبر الجزيء. يُسمح للف واحد فقط بالمرور عبر الجزيء اللولبي إلى الركيزة ، وبالتالي ينقلب دوران الجسيم النانوي. لقراءة المعلومات ، يتم استخدام جهد أقل. نظرًا لأن حالات الدوران للبتات المكتوبة مشغولة بالفعل ، سيكون للبتات غير المكتوبة مقاومة أقل من البتات المكتوبة. تُظهر اللوحة اليمنى للشكل 6 د تصميمًا لجزء واحد من الذاكرة الضوئية ، مدفوعًا بضوء مستقطب دائريًا. عندما يتم إثارة الجسيمات النانوية بالضوء ، تتأرجح الشحنة مع المجال الكهربائي ، وتخلق عزم دوران صافي بين النقطة الكمومية المثارة والركيزة المغناطيسية ، تاركة مغنطة محلية في الركيزة. [147 ، 155] بن وآخرون. كانوا قادرين على قراءة هذا النوع من الذاكرة عن طريق قياس جهد القاعة عبر الركيزة. [155] في حين أن هذين النوعين من الذكريات الانتقائية للدوران متوافقان مع السيليكون ، فإن محو المعلومات يتطلب استبدالًا كيميائيًا للجزيئات بمقاوماتها ، والتي يمكن أن تكون عملية غير فعالة للغاية. نظرًا لأن طرق تبديل chirality الخاصة بأوريغامي DNA قد تم تطويرها بالفعل ، فمن المحتمل أن تلعب تركيبات DNA Origami دورًا في التطوير المستقبلي لهذا النوع من أجهزة الذاكرة.

4.3 مجالات التطبيق الناشئة الأخرى

إن التحكم في الهياكل النانوية للحمض النووي وقابليتها للتخصيص يجعلها فرصة جذابة لتوصيل الدواء المستهدف. على وجه التحديد ، عملت مجموعات الحمض النووي القائمة على اوريغامي كوسيلة لتوصيل عقار دوكسوروبيسين (Dox) المضاد للسرطان ، والذي يقحم بين قواعد الحمض النووي ، إلى الخلايا المصابة. [158 ، 160 ، 161] في إحدى هذه الدراسات [158] هيكلان نانويان شبيهان بالحمض النووي لأوريغامي لهما تصميمات عالمية مختلفة (شكل 7a) لإيصال Dox إلى خلايا سرطان الثدي البشرية. تم العثور على الهيكل الملتوي عالميًا لإطلاق الدواء بشكل أبطأ ، مقارنة بالبنية المستقيمة القائمة على الأوريغامي أو Dox المنتشر بحرية (الشكل 7 ب). وبالتالي ، يبدو أن حركية إطلاق الدواء يتم التحكم فيها من خلال الالتواء العالمي للبنية النانوية ، مما يفتح إمكانيات مثيرة للاهتمام لتنظيم إطلاق الدواء ديناميكيًا أو تكييف سرعة الإطلاق على وجود مؤشرات حيوية معينة.

يمكن تخزين المعلومات أو عرضها بدقة نانوية باستخدام DNA Origami كمواد بناء. يمكن تسخير انتقائية السبين في الحمض النووي لأوريغامي لبناء مجموعة من البتات ، والتي يمكن أن تعمل كجهاز ذاكرة. استخدمت الدراسات السابقة [155 ، 157] مجموعة من الاختصارات α- الببتيدات الحلزونية لتصنيع مثل هذا الجهاز (الشكل 6 د). تطبيق محتمل آخر هو شاشة قابلة للتبديل بشكل نشط (الشكل 7 ج) ، والتي يمكن بناؤها باستخدام الجسيمات النانوية المرتبة باستخدام اوريغامي الحمض النووي في نمط مراوان لتوفير استجابة قوية للقرص المضغوط. عندما يضيء الضوء الأيمن على طول المحور الحلزوني للحلزون الأيسر ، سيتم امتصاص الكثير من الضوء. [129] إذا تم تدوير اللولب نفسه بحيث يكون محوره الحلزوني متعامدًا مع الضوء ، فسوف ينخفض ​​الامتصاص. لقد تم إثبات مؤخرًا أنه يمكن تبديل حزمة DNA Origami بشكل عكسي بين التكوينات المستقيمة والمسطحة باستخدام قطب كهربائي. [162] يمكن استخدام هذه الآلية لتبديل حالات الامتصاص كهربائيًا لعمل عرض.

أخيرًا وليس آخرًا ، يمكن أن تكون الهياكل النانوية اللولبية مفيدة في توصيل الجزيئات الحيوية الفردية ، مثل خيوط الحمض النووي أو البروتينات غير المطوية. يوضح الشكل 7 د أحد هذه الاحتمالات ، حيث يوجه عيب الخطوة الحلزونية في غشاء الجرافين متعدد الطبقات توصيل خيط DNA واحد إلى مركز اللولب. [159] أثبتت محاكاة الديناميكيات الجزيئية وتجارب AFM أن إزاحة الجزيء الممتز على عيب متدرج له تباين اتجاهي وأن هذا الجزيء من المرجح أن يتحرك على طول حافة العيب المتدرج أكثر منه عبرها. وبالتالي ، فإن القوة الخارجية التي تغير الاتجاه في نمط يتطابق مع تباين بنية عيب الحافة ستجلب الجزيء إلى مركز الهيكل بغض النظر عن مكان امتزاز الجزيء ، في حين أن تطبيق القوة الخارجية في نمط chirality المعاكس سوف يتحرك الجزيء الممتز بعيدًا عن مركز الهيكل.


نقاش

في هذه الورقة ، قدمنا ​​دارات جينية اصطناعية للنمذجة المكانية بسيطة في التصميم والبناء ولكنها قوية وقابلة للضبط في الأداء. لم تتطلب الدوائر سوى الحد الأدنى من أجزاء الحمض النووي للتجميع ، ولكنها أنتجت الأنماط المرغوبة دون الحاجة إلى ضبط معماري دقيق. بالإضافة إلى ذلك ، كانت قوية ضد اضطرابات العوامل البيئية المختلفة (مثل تكوين الوسائط ، وقيمة الأس الهيدروجيني ، ودرجة الحرارة) والاختلافات في السياقات الخلوية (مثل الكائن الحي المضيف ورقم نسخة البلازميد). علاوة على ذلك ، على الرغم من قوتها ، كانت الدوائر قابلة للضبط بدرجة كبيرة للإشارات التنظيمية المصممة. بفضل قوتها وقابليتها للتكيف ، سمحت لنا الدوائر أيضًا بإنشاء هياكل مكانية يمكن التنبؤ بها للمجتمعات البكتيرية الاصطناعية وإنشاء صفائف يمكن التحكم فيها من الشبكات الخلوية والبقع في الفضاء. بالمقارنة مع الأمثلة الأخرى التي تم إنشاؤها للتحكم في سلوكيات النطاق المكاني (12 ، 17-19) ، توفر هذه الدراسة حلاً بسيطًا وموثوقًا به لبرمجة أنماط مكانية قوية وقابلة للضبط يمكن تسخيرها لإنشاء هياكل معقدة للسكان. هشاشة الدوائر هي إحدى العقبات الرئيسية في البيولوجيا التركيبية ، حيث تعيق بناء شبكات معقدة للوظائف المتقدمة وتطبيقات البيولوجيا التركيبية في بيئات العالم الحقيقي (10 ، 31-34). لمواجهة التحدي ، كان تطوير مبادئ ومنهجيات التصميم الجديدة هو الجهود الرئيسية. توضح هذه الدراسة أن التعدين العميق للقدرات غير المستغلة للأنظمة الطبيعية ، مثل الوظائف المزدوجة لـ nisin ، يمكن أن يكون إستراتيجية بديلة لبناء القوة. الأهم من ذلك ، مع التعدين المناسب ، قد لا يتطلب تنفيذ الوظيفة المطلوبة إنشاء دائرة معقدة وتحسينها.

يعمل هذا العمل على تعزيز قدرتنا في التحكم في المجتمعات الميكروبية واستشعار الإشارات البيئية. قد يفيد أيضًا في تطوير هندسة الأنسجة وتصنيع المواد الحيوية التي تتطلب تحكمًا زمانيًا مكانيًا في جزيئات الإشارة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لأن سلوك تمرير النطاق للدوائر المهندسة يحدث بشكل شائع في الطبيعة ، تقدم الدراسة نظرة ثاقبة لعمليات التنسيق الخلوي الأساسية للأنظمة الطبيعية ، مثل تجميع المجتمع الميكروبي وتطوير الأجنة.