معلومة

استخراج الحمض النووي Pyura

استخراج الحمض النووي Pyura


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

أواجه صعوبة في استخراج الحمض النووي الجيني من عينات مختلفة من Pyura chilensis ؛ يتحلل الحمض النووي كما يمكن رؤيته على الجل.

لطالما استخدمنا مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي الجينومي GeneJET (بواسطة ThermoFisher) ، وهي تعمل بشكل جيد مع عينات من الأنواع الأخرى ؛ لذا فإن المجموعة ليست هي المشكلة.

لطالما استخدمنا عينات الأنسجة المخزنة في 95٪ من الإيثانول (والتي يتم غسلها بالماء قبل استخراج الحمض النووي) ، ولكن المشكلة لا تزال قائمة بغض النظر عما إذا كانت العينات عمرها يوم واحد أو عمرها بضع سنوات. يبدو أن طريقة التخزين تعمل بشكل جيد لاستخراج جدنا من الأنواع الأخرى.

بعد ذلك ، أعتقد أن المشكلة تكمن في Pyura نفسها. لذلك يجب أن أعرف ما إذا كان الاستخراج أو التخزين غير مناسب لـ Pyura. قرأت أن Pyura بها الكثير من النحاس. خططنا لاستخدام مخزن مؤقت جديد لتخزينه: الملح المشبع DMSO ، الذي يحتوي على EDTA.

أود أن أسأل ما إذا كان أي منكم قد عمل على الإطلاق مع هذا الكائن الحي (وإذا كان لديك ، فكيف تمكنت من استخراج الحمض النووي منه). هل لديك أي اقتراحات بشأن أي من بروتوكولات تنقية الحمض النووي؟

الممر الأول هو السلم (1 كيلو بايت) وآخر 3 ممرات بها أشياء طويلة غير واضحة بدلاً من العصابات هي عينات الحمض النووي الخاصة بي.


بالإشارة إلى صورة الهلام الخاصة بك ، فإن الحمض النووي الجينومي (في ممرات عينات Pyura الثلاثة) لا يبدو متدهوراً بشكل سيء. إذا كانت علامة الحجم سلمًا 1 كيلو بايت ، فإن غالبية الحمض النووي تكون ذات حجم جزيئي مرتفع. أثناء الاستخراج ، من الشائع أن يصبح الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي المرتفع "مقطوعًا" إلى حد ما (مقسم ميكانيكيًا إلى أجزاء أصغر). يمكن أن يظهر هذا على هيئة ملف إغماء تشويه للأسفل. قد تكون الممرات محملة بشكل زائد إلى حد ما أيضًا. يمكنك محاولة استخدام تقنية استخراج أكثر لطفًا ومعرفة ما إذا كانت تساعد على رضاك. أي من هؤلاء الذين ذكرتهم سيعمل.

سيظهر الحمض النووي الجينومي المتحلل بشكل سيئ على شكل "مسحة" أكثر كثافة بالقرب من الجزء السفلي من معيار حجم 1 كيلو بايت.


هذا من عمل منشور بواسطة Segovia et al. 2017:

تم استخدام أنسجة الوشاح (0.2 جم) من كل فرد لاستخراج الحمض النووي باستخدام DNeasy Blood® & Tissue Kit (QIAGEN® ، الولايات المتحدة الأمريكية) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس كمية / نقاء الحمض النووي في Nanodrop 2000 (Thermo ، الولايات المتحدة الأمريكية).

لقد قاموا بتعريف SNP من الجينوم. لذلك أفترض أن جدنا الخاص بهم سيكون ذا نوعية جيدة.


استخراج الحمض النووي Pyura - علم الأحياء

تقرير عملي معمل علم الحيوان المنهجي ، أغسطس 2010

السيتوكروم ج وحدة أوكسيديز الفرعية I تسلسل جزئي لمجدافيات كالانويد مفترضة تم الحصول عليها من بيورا فيتاتا (Chordata: Ascidiacea: Pleurogona: Pyuridae)

قسم الأحياء ، قسم العلوم البيولوجية ، كلية العلوم ، جامعة هوكايدو ، سابورو 060-0810 ، اليابان

المواد والطرق
تم الحصول على الزقدي بشكل خفي في خليج أوشورو ، هوكايدو ، اليابان ، حوالي 43 درجة و 12 درجة مئوية و 140 درجة مئوية و 51 درجة مئوية ، في 31 مايو 2010 بواسطة شين هاياس ، تم تصويره وتحديده بواسطة هيروشي كاجيهارا على أنه بيورا فيتاتا على أساس Nishikawa (1992: 600، pl.144-1) قبل التثبيت في 99٪ EtOH. تم استخلاص الحمض النووي من القناة الهضمية للعينة باستخدام طريقة السيليكا (Boom وآخرون. 1990) مع بعض التعديلات. تم إذابة الحمض النووي المستخرج في 30 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات وحفظه في درجة حرارة - 20 درجة مئوية. تم إيداع عينة القسيمة المورفولوجية المتبقية في متحف جامعة هوكايدو تحت رقم الكتالوج ICHU22080146 (الاتصال: د. هيروشي كاجيهارا ، [email protected]).
جزء حوالي 600 نقطة أساس من السيتوكروم الميتوكوندريا ج تم تضخيم جين أوكسيديز الفرعي الأول (COI) عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) باستخدام LCO1490 (5 & Prime-GGTCAACAAATCATAAAGATTGG-3 & prime) و HCO2198 (5 & prime-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 & Prime) (Folmer وآخرون. 1994). تم إجراء PCR بداية ساخنة بواسطة جهاز تدوير حراري ، iCycler (Bio-Rad) ، في حجم تفاعل 20- ومايكروول يحتوي على 1 وميكروول من إجمالي الحمض النووي (حوالي 10 و ndash100 نانوغرام) و 19 ميكرول من الخلط المسبق المصنوع من 632- وماء ميكروول منزوع الأيونات ، 80- ومايكرول إكس طق Buffer (TaKara Bio) ، 64- & microl dNTP (كل 25 مم) ، 8- & microl لكل برايمر (كل 10 & microM) ، و 0.1- & microl TaKara Ex طق (5 U / & microl، TaKara Bio). تتألف حالة التدوير الحراري من تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 30 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتلدين عند 45 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والاستطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 45 درجة مئوية واستطالة نهائية عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
تمت تنقية منتج PCR بطريقة السيليكا (Boom وآخرون. 1990). تم تسلسل كلا الخيوط باستخدام BigDye & reg Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (النظم البيولوجية التطبيقية) باتباع بروتوكول الشركة المصنعة ، باستخدام نفس مجموعة التمهيدي كتضخيم PCR الأولي. تم إجراء التسلسل باستخدام محلل DNA ABI Prism 3730 (النظم الحيوية التطبيقية). تم تشغيل بيانات الكروماتوجرام والتسلسل باستخدام برنامج MEGA v4 (Tamura وآخرون. 2007).

نتائج ومناقشة
تم الحصول على إجمالي 606 نقطة أساس من تسلسل COI. ومع ذلك ، أشار بحث بلاست النيوكليوتيد لهذا التسلسل في المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية إلى أن التسلسل ربما جاء من مجداف الأرجل كالانويد ، بدلاً من الزقدي. استنتج أنه يجب توخي الحذر لتجنب الجهاز الهضمي لاستخراج الحمض النووي من الزكاة.

التصنيف
حق اللجوء الحبليات
فصل Ascidiacea
أسرة Pyuridae هارتمير ، 1908
جنس بيورا مولينا ، 1782
بيورا فيتاتا (ستيمبسون ، 1852)
(رسم بياني 1)



رسم بياني 1. بيورا فيتاتا (ستيمبسون ، 1852) (ICHU22080146) ، منظر جانبي.

Boom، R.، Sol.، C.JA، Salimans، M. M.، Jansen، C.L، Wertheim-van Dillen، P. M.E، and van der Noordaa، J. 1990. طريقة سريعة وبسيطة لتنقية الأحماض النووية. مجلة علم الأحياء الدقيقة السريرية28: 495 و ndash503.

Folmer، O.، Black، M.، Hoeh، W.، Lutz، R. and Vrijenhoek، R. 1994. بادئات الحمض النووي لتضخيم السيتوكروم الميتوكوندريا ج أوكسيديز الوحدة الفرعية الأولى من اللافقاريات الميتازونية المتنوعة. البيولوجيا البحرية الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية 3: 294 و ndash299.

نيشيكاوا ، ت. 1999. Chordata. ص. 573 & ndash608. في: نيشيمورا ، س. (محرر) دليل لحيوانات شاطئ البحر في اليابان مع الصور الملونة والمفاتيح. المجلد. II. هويكوشا ، أوساكا. الثاني عشر + رجاء 73 & ndash144 + 663 ص.

Tamura، K.، Dudley، J.، Nei، M. and Kumar، S. 2007. MEGA4: Molecullar Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) إصدار برنامج 4.0. علم الوراثة الجزيئي والتطور 24: 1596 و - 1599.


زائدة
تسلسل COI من ICHU22080146 (تم تحديده على أنه تصاعدي بيورا فيتاتا) ، على الرغم من أنها تمثل على الأرجح مجدافيات كالانويد.


يساعد هذا النشاط القصير الطلاب على تصور أحد أهم الجزيئات على هذا الكوكب ، وهو الحمض النووي. يمكن القيام بهذا النشاط باستخدام مواد بسيطة توجد في معظم المنازل. نحن نستخدم الموز ، ولكن يمكن أيضًا استخدام الفراولة أو أي فاكهة أخرى طرية بدرجة تكفي لهرس الفطر. النشاط مكتوب للطلاب في المدرسة المتوسطة أو المستوى الأعلى ، ولكن مع وجود إرشادات أكثر كثافة ، يكون هذا النشاط مفيدًا للطلاب في أي عمر.

الوقت المطلوب: 45 دقيقة

  • يجب أن تكون حاوية واحدة من الصابون والملح أكثر من كافية لاستخدام فئة كبيرة ، لكننا نقترح أن يكون لديك اثنتين من كل واحدة في متناول اليد فقط في حالة استخدامها.
  • يعمل هذا النشاط بشكل عام بشكل أفضل مع مجموعات صغيرة من الطلاب يعمل كل منهم على استخراج الموز الخاص بهم. هذا أيضًا يجعل من المحتمل أن يكون لدى مجموعة واحدة على الأقل حمض نووي مرئي للغاية.
  • تأكد من وجود أكياس بسحاب إضافية وفلاتر قهوة إضافية في متناول اليد ، في حالة حدوث أي انقطاع.
  • إذا انكسر مرشح القهوة وسقطت هريسة الموز في قاع الزجاج ، اسكبها مرة أخرى في الكيس ، وقم بتأمين مرشح جديد ، ثم اسكب الهريسة مرة أخرى ببطء أكثر ، واتركها تجف أثناء الصب.

ملحقات:

عند دمجه مع قراءة إضافية من Ask A Biologist ، أو مهام قصيرة إضافية ، يمكن أن يفي نشاط استخراج الحمض النووي هذا بالعديد من معايير التعلم.

  • ستساعد قصة "DNA ABCs" الطلاب على فهم أهمية الحمض النووي في الحياة ، بالإضافة إلى التركيب الكيميائي والفيزيائي للحمض النووي.
  • ستساعد صفحة القصة "الوصول إلى علم الوراثة" الطلاب على التمييز بين الجينات والكروموسومات وفهم الأليلات.
  • بالنسبة لطلاب المدارس الثانوية ، ستساعدهم قصة "التحكم في الجينات" على فهم تخليق البروتين.
  • يمكن للطلاب محاولة معرفة مقدار الحمض النووي في جسم الإنسان البالغ. يمكنك إما تقديم المعلومات التالية إليهم ، أو جعلهم يبحثون عنها عبر الإنترنت:

      خلوي

      • ستساعد قصة "اللبنات الأساسية للحياة" الطلاب على فهم بنية الخلية ووظيفتها.
      • ستساعد قصة "الخلايا التي تعيش في الخلايا" الطلاب على فهم أنواع الخلايا المختلفة الموجودة.
      1. سوف يدرك الطلاب أن الجزيئات الصغيرة ملموسة.
      2. سوف يتبع الطلاب التوجيهات ويفهمون أن المواد الكيميائية الأساسية (الأملاح والمنظفات) يمكن استخدامها لتفكيك الخلايا وأجزاء الخلايا ولجعل الجزيئات تلتصق بالجزيئات الأخرى.
      3. الامتداد: سيكتسب الطلاب فهمًا أساسيًا لبنية الحمض النووي.
      4. الامتداد: سوف يفهم الطلاب الخلايا وأنهم قاموا بتفكيك غشاء الخلية والغشاء النووي للوصول إلى الحمض النووي.

      تقنية استخراج الحمض النووي

      الهدف في هذه التجربة هو استخراج الحمض النووي من عينة الفاكهة. هناك حاجة إلى بعض المعرفة بالخلفية العلمية وراء استخراج الحمض النووي للقيام بذلك.

      عملية استخراج الحمض النووي هي إجراء كيميائي حيوي بسيط إلى حد ما يمكن تقسيمه إلى ثلاث خطوات رئيسية: كسر الخلية (التحلل) ، وتدمير الأغشية داخل الخلية ، وإخراج الحمض النووي من المحلول.

      تصف الأقسام التالية كيفية ارتباط كل خطوة بالخصائص الفيزيائية والكيميائية الحيوية للحمض النووي.


      • عازلة استخراج الحمض النووي: 1000 مل من الماء منزوع الأيونات ، 50 مل من منظف الأطباق الصافي ، 1 ملعقة صغيرة من الملح
      • الفراولة (الفواكه الأخرى تعمل أيضًا)
      • كيس Ziploc ، فلاتر القهوة وقمع
      • أنابيب الاختبار أو الأكواب أو الأكواب لجمع المرشح
      • الإيثانول أو كحول الأيزوبروبيل بنسبة 91٪ (مبرد)

      1. أضف حبة فراولة (أو نصفها) إلى كيس تخزين Ziploc.
      2. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي واهرس الفراولة والعازل لمدة دقيقة واحدة تقريبًا.
      3. استخدم قمعًا ومرشحات قهوة لتصفية عصير الفراولة في دورق.
      4. انقل ملف ترشيح إلى أنبوب اختبار ، يجب عليك فقط ملء أنبوب الاختبار بحوالي نصف ممتلئ وتجنب نقل أي رغوة.
      5. اسكبي ببطء أو قطري الكحول البارد فوق خليط الفراولة. تريد طبقة واحدة فوق خليط الفراولة.
      6. سوف تتشكل خيوط بيضاء في طبقة الإيثانول ، استخدم قضيب التحريك أو المسواك لتلف الخيوط.


      مقدمة

      مع الآلاف من الأنواع الموصوفة ، الزقديات ، أو النافورات البحرية (الشعبة: Chordata ، subphylum: Tunicata ، الفئة: Ascidiacea) تشكل مجموعة فريدة من الحبال البحرية غير الفقارية اللاطئة (Shenkar and Swalla 2011 Shenkar et al. 2012). بسبب موقعهم المنهجي الرئيسي كسلسلة أخت من الفقاريات (Delsuc et al. . من وجهة النظر البيئية ، تساهم دورة حياتها القصيرة نسبيًا وقدرتها على الازدهار في بيئات غنية بالمغذيات ونقص الحيوانات المفترسة في نجاحها في البيئات التي تم إدخالها حديثًا (Lambert 2001 Shenkar and Loya 2008). والنتيجة الطبيعية هي أن الأسكيديين هم من بين أسوأ الأنواع البحرية الغازية وأن معدل دخولهم قد زاد خلال العقد الماضي (لامبرت 2009). ومن ثم فمن الضروري تطوير أدوات تمكننا من التمييز بين الأنواع غير الأصلية من الأنواع الأصلية والتأكد من مصدر الأنواع التي تم إدخالها. لسوء الحظ ، من المعروف أن علم اللاهوت النسقي صعب ، لأن الأنواع يتم تصنيفها في الغالب على أساس الخصائص التشريحية الداخلية مثل الغدد التناسلية أو شكل حلقة القناة الهضمية والمواقع ، وهياكل الكيس الخيشومي (Monniot et al.1991). وبالتالي ، فإن التعريفات الخاطئة للأنواع الزكية متكررة (Mastrototaro و Dappiano 2008 Lambert 2009). توفر التسلسلات الجزيئية طريقة لاستكمال تحديد الأنواع ، خاصة في المواقف التي يكون فيها التمييز التقليدي القائم على التشكل للأنواع غير كافٍ (Geller et al. 2010). توفر الواسمات الجزيئية ، ولا سيما تسلسل الحمض النووي للميتوكوندريا (mt) ، بديلاً قويًا للنهج المورفولوجي. كمثال على ذلك ، تم استخدام الحمض النووي mt بنجاح لإثبات بشكل لا لبس فيه وجود نوعين خفيين في الزقدي العالمي. Ciona intestinalis (إيانيلي ، بيسول ، وآخرون ، 2007). على الرغم من ذلك ، فإن الأنواع الأسكيدية هي أنواع سريعة التطور (Yokobori وآخرون 1999 ، 2005 Tsagkogeorga ، Turon ، وآخرون 2010) ، وهي ميزة تعقد استخدام خصائصها الجزيئية لاستنتاج تاريخها التطوري (Delsuc et al.2006). وبشكل أكثر تحديدًا ، فإن جينومات mt الأسكيدية متغيرة للغاية في جميع الخصائص الجينومية تقريبًا ، والتي تشمل على سبيل المثال ، معدلات عالية للغاية من اختلاف التسلسل وإعادة ترتيب الجينات المتفشية ، حتى في المستويات التصنيفية المنخفضة مثل الأنواع المتجانسة والمشفرة (Iannelli ، Griggio ، وآخرون 2007 Gissi وآخرون 2010). هذا التطور السريع للغاية لجينومات الجبل الزقدي يجعل تضخيم تسلسلها مهمة صعبة ، وهذا بدوره يفسر ندرة هذه الجينومات المتسلسلة. وبالتالي نهدف إلى تطوير طريقة بسيطة وفعالة يمكن من خلالها الحصول بسهولة على جينومات جبل زقدي كاملة.

      أحدثت تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) ثورة في الحصول على البيانات في علم الأحياء. على الرغم من أن بروتوكولات التسلسل قد تم تطويرها في الأصل لاستخراج جينوم أو نسخة من كائن حي واحد ، فمن الممكن خلط عدة عينات في خلية تدفق واحدة (أي تسلسل متعدد الإرسال) طالما يمكن فصل التسلسلات من العينات المختلفة لاحقًا. تسمح طرق تعدد الإرسال القياسية بتجميع ما يصل إلى 96 عينة مختلفة عن طريق إدخال الرموز الشريطية (أو العلامات) أثناء إعداد مكتبة الحمض النووي (Binladen et al.2007). باتباع خطوة التسلسل ، يتم فصل القراءات بناءً على علامات الباركود الخاصة بها ، بحيث يتم إجراء هذا التجميع لكل عينة على حدة. تتمثل ميزة هذا النهج في إمكانية إنشاء مفاضلة بين العدد الإجمالي للقراءات المتاحة من تشغيل NGS واحد وعدد القراءات المطلوبة للحصول على التغطية المرغوبة لكل عينة فردية. ومع ذلك ، فإن عيب مثل هذا النهج هو أنه يتطلب إنشاء مكتبات جينومية منفصلة لكل عينة ، مما قد يكون مكلفًا. اقترحت العديد من الدراسات خلط عدة عينات دون تشفيرها وفصل التسلسلات فقط بعد خطوة التجميع (بولوك وآخرون 2000 ماك كوميش وآخرون 2010 تيمرمانز وآخرون 2010 ديتاي وآخرون 2012). نشير هنا فقط إلى الدراسات غير النظرية. في Timmermans وآخرون. (2010) ، استند فصل ما بعد التجميع إلى تسلسلات الطُعم ، وهي تسلسلات قصيرة (200 & # x020131000 bp) تم الحصول عليها لكل عينة باستخدام تسلسل Sanger. في McComish et al. (2010) ، تم إجراء الفصل من خلال مقارنة contigs المجمعة بمجموعة من جينومات mt المرجعية وثيقة الصلة. كلا Timmermans et al. (2010) وماكوميش وآخرون. (2010) شظايا مضخمة من تفاعل البلمرة المتسلسل الطويل المتسلسل (PCR) تغطي كامل الجينوم. لسوء الحظ ، فإن الحصول على شظايا PCR الطويلة أمر صعب للغاية في الغلالة بسبب إعادة ترتيب الجينات المنتشرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي المصنوعات اليدوية PCR في بعض الأحيان إلى كونتيجات جبل كيميري (Timmermans et al. 2010).

      في هذا العمل ، اخترنا استخدام منصة Illumina لتسلسل المستخلصات الجينومية الإجمالية لأنواع متعددة مختلطة معًا. وهكذا ، تم تسلسل كل من شظايا الحمض النووي و mt من أنواع متعددة معًا ، وتم استرداد تسلسل mtDNA حسابيًا من خلال خطوة التجميع. نهجنا مشابه للنهج المستخدم من قبل Groenenberg et al. (2012) ، الذي حصل على الانقسام الكامل للحلزون عن طريق تسلسل Illumina وتجميع de novo للحمض النووي الكلي المستخرج من عينة متحف واحدة. بعد Timmermans et al. (2010) ، تم استخدام تسلسل الطعم هنا لتحديد تسلسل mt لكل عينة بدلاً من التسلسلات وثيقة الصلة ، كما في McComish et al. (2010) ، منذ أن قمنا بالتسلسل ، على سبيل المثال ، الممثل الأول لعائلة تمت مناقشة موقعها النشئي (على سبيل المثال ، Corellidae Tsagkogeorga et al.2009). تتمثل ميزة نهجنا & # x0201cbrute force & # x0201d في أنه لا يعتمد على مواد أولية محددة ولا على بروتوكولات التخصيب كما أنه أعمى عن ترتيب الجينات mt. باستخدام هذا النهج ، نجحنا في تجميع خمسة ميتوجينومات كاملة جديدة: Rhodosoma turcicum (Phlebobranchia: Corellidae) ، بوتريلويدس Aff. ليتشي و Polycarpa mytiligera (Stolidobranchia: Styelidae) ، هالوسينثيا سبينوزا، و عصابة بيورا (Stolidobranchia: Pyuridae) (شكل 1 أ و ج& # x02013F، على التوالى). بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام نهج تسلسل PCR و Sanger القياسي ، حصلنا على جينوم mt لـ Ascidiella aspersa (Phlebobranchia: Ascidiidae) (شكل 1 ب). نحن نصف ونناقش نهجنا الجديد لتسلسل mtDNA باستخدام تقنية NGS ، جنبًا إلى جنب مع خصائص جينومات mt الزقدي الستة الجديدة من حيث تنظيم الجينوم وإشارة النشوء والتطور.

      تسلسل الأنواع Ascidian في هذا العمل. (أ) Rhodosoma turcicum (Corellidae) ، (ب) Ascidiella aspersa (Ascidiidae) ، (ج) بوتريلويدس Aff. ليتشي (Styelidae) ، (د) Polycarpa mytiligera (Styelidae) ، (ه) هالوسينثيا سبينوزا (Pyuridae) و (F) عصابة بيورا (Pyuridae).


      تنقية وتركيز الحمض النووي من المحاليل المائية

      تقدم هذه الوحدة الإجراءات الأساسية لمعالجة حلول الحمض النووي أحادي أو مزدوج السلسلة من خلال خطوات التنقية والتركيز. هذه التقنيات مفيدة عندما تحتاج البروتينات أو الجزيئات الذائبة إلى الإزالة من المحاليل المائية ، أو عندما تحتاج محاليل الحمض النووي إلى التركيز. ال

      ، باستخدام استخراج الفينول وترسيب الإيثانول (أو الأيزوبروبانول) ، مناسب لتنقية الحمض النووي من الأحجام الصغيرة (& لتر 0.4 مل) بتركيزات أقل من 1 مجم / مل. تحدد ثلاثة بروتوكولات دعم طرقًا لعزل الفينول المستخدم في الاستخراج ، وتركيز الحمض النووي باستخدام البيوتانول ، واستخراج المذيبات العضوية المتبقية باستخدام الأثير. بديل لهذه الطرق هو تنقية الحمض النووي باستخدام خرز زجاجي وهذا أيضا مقدم. يمكن أيضًا استخدام هذه البروتوكولات لتنقية الحمض النووي الريبي. يتم استخدام البروتوكولين البديلين الأخيرين لتركيز الحمض النووي الريبي واستخراج وترسيب الحمض النووي من أحجام أكبر ومن المحاليل المخففة ، ولإزالة قليل النوكليوتيدات وثلاثي الفوسفات منخفض الوزن الجزيئي.


      استخراج الحمض النووي من أوراق النبات باستخدام رقعة إبرة مجهرية

      يعد عزل الحمض النووي عالي الجودة من العينات النباتية المصابة خطوة أساسية للكشف الجزيئي عن مسببات الأمراض النباتية. ومع ذلك ، فإن عزل الحمض النووي من الخلايا النباتية المحاطة بجدران خلوية صلبة من عديد السكاريد ينطوي على خطوات معقدة ويتطلب معدات معملية منضدة. ونتيجة لذلك ، يقتصر استخراج الحمض النووي للنبات حاليًا على المعامل المجهزة جيدًا وأصبح تحضير العينات أحد العقبات الرئيسية أمام الكشف الجزيئي في الموقع عن مسببات الأمراض النباتية. للتغلب على هذه العقبة ، تم تطوير طريقة بسيطة لاستخراج الحمض النووي من أنسجة أوراق النبات. يمكن أن تقوم رقعة إبرة مجهرية (MN) مصنوعة من كحول البولي فينيل (PVA) بعزل النبات أو الحمض النووي الممرض من أنواع نباتية مختلفة في غضون دقيقة. أثناء استخراج الحمض النووي ، تخترق رقعة MN البوليمرية أنسجة أوراق النبات وتكسر جدران الخلايا النباتية الصلبة لعزل الحمض النووي داخل الخلايا. الحمض النووي المستخرج هو تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) الذي يمكن تضخيمه دون تنقية إضافية. تم استخراج هذه الطريقة الأقل بضعاً بنجاح إنفستان فيتوفثورا الحمض النووي من أوراق الطماطم المصابة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام رقعة MN لعزل الحمض النووي من مسببات الأمراض النباتية الأخرى مباشرة في الحقل. وبالتالي ، فإن لديها إمكانات كبيرة لتصبح تقنية تحضير عينة سريعة في الموقع للكشف عن مسببات الأمراض النباتية. © 2020 بواسطة John Wiley & Sons، Inc.

      البروتوكول الأساسي: استخراج الحمض النووي القائم على رقعة إبرة مجهرية

      بروتوكول الدعم 1: تصنيع رقعة إبرة مجهرية

      بروتوكول الدعم 2: تضخيم PCR في الوقت الحقيقي للحمض النووي المستخرج من رقعة إبرة مجهرية


      مراجع

      Sinha R و Abu-Ali G و Vogtmann E و Fodor AA و Ren B و Amir A و Schwager E و Crabtree J و Ma S و Abnet CC وآخرون. تقييم الاختلاف في تسلسل أمبليكون المجتمع الميكروبي من قبل اتحاد مشروع مراقبة جودة الميكروبيوم (MBQC). Nat Biotechnol. 201735: 1077–1086.

      Costea PI و Zeller G و Sunagawa S و Pelletier E و Alberti A و Levenez F و Tramontano M و Driessen M و Hercog R و Jung FE وآخرون. نحو معايير معالجة عينات البراز البشرية في الدراسات الميتاجينومية. Nat Biotechnol. 201735: 1069–76.

      اتحاد مشروع الميكروبيوم البشري. هيكل ووظيفة وتنوع الميكروبيوم البشري السليم. طبيعة سجية. 2012486: 207-14.

      Qin J و Li R و Raes J و Arumugam M و Burgdorf KS و Manichanh C و Nielsen T و Pons N و Levenez F و Yamada T وآخرون. كتالوج الجينات الجرثومية في الأمعاء البشرية تم إنشاؤه بواسطة التسلسل الميتاجينومي. طبيعة سجية. 2010464: 59-65.

      Marotz C، Amir A، Humphrey G، Gaffney J، Gogul G، Knight R. استخراج الحمض النووي من أجل تبسيط metagenomics لعينات بيئية متنوعة. التقنيات الحيوية. 201762: 290-3.

      Wesolowska-Andersen A، Bahl MI، Carvalho V، Kristiansen K، Sicheritz-Ponten T، Gupta R، Licht TR. يؤثر اختيار طريقة استخراج الحمض النووي البكتيري من المواد البرازية على بنية المجتمع كما تم تقييمها من خلال التحليل الميتاجينومي. ميكروبيوم. 20142: 19.

      Franzosa EA و Morgan XC و Segata N و Waldron L و Reyes J و Earl AM و Giannoukos G و Boylan MR و Ciulla D و Gevers D et al. ربط metatranscriptome والميتاجينوم من الأمعاء البشرية. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111: E2329–38.

      هورز إتش بي ، شير إس ، هوينجر إف ، فيانا إم إي ، كونرادز جي. عزل انتقائي للحمض النووي البكتيري من العينات السريرية البشرية. طرق J Microbiol. 200872: 98-102.

      Marotz CA، Sanders JG، Zuniga C، Zaramela LS، Knight R، Zengler K. تحسين metagenomics لعاب الصيد عن طريق استنفاد الحمض النووي للمضيف الكيميائي. ميكروبيوم. 20186: 42.

      آيزنهوفر آر ، مينيتش جي ، ماروتز سي ، كوبر إيه ، نايت آر ، ويريش إل إس. التلوث في دراسات ميكروبيوم الكتلة الحيوية المنخفضة الميكروبية: قضايا وتوصيات. اتجاهات ميكروبيول. 201927: 105-17.

      سالتر إس جيه ، كوكس إم جي ، توريك إم ، كالوس إس تي ، كوكسون دبليو أو ، موفات إم إف ، تيرنر بي ، باركهيل جي ، لومان نيوجيرسي ، ووكر إيه دبليو. يمكن أن يؤثر التلوث الكاشف والمختبر بشكل حاسم على تحليلات الميكروبيوم القائمة على التسلسل. BMC بيول. 201412: 87.

      Glassing A ، Dowd SE ، Galandiuk S ، Davis B ، Chiodini RJ. قد يؤثر تلوث الحمض النووي البكتيري المتأصل في كواشف الاستخلاص والتسلسل على تفسير الكائنات الحية الدقيقة في عينات الكتلة الحيوية البكتيرية المنخفضة. الامعاء المرضية. 20168: 24.

      Minich JJ و Zhu Q و Janssen S و Hendrickson R و Amir A و Vetter R و Hyde J و Doty MM و Stillwell K و Benardini J وآخرون. يتيح KatharoSeq تحليل الميكروبيوم عالي الإنتاجية من عينات الكتلة الحيوية المنخفضة. أنظمة mSystems. 20183.

      موراليس إي ، تشن جي ، جراثوس كوالا لمبور. التحليل التكويني للميكروبيوم البشري في أبحاث السرطان. طرق Mol Biol. 1928 2019: 299-335.

      Dejea CM و Wick EC و Hechenbleikner EM و White JR و Mark Welch JL و Rossetti BJ و Peterson SN و Snesrud EC و Borisy GG و Lazarev M et al. تنظيم Microbiota هو سمة مميزة لسرطانات القولون والمستقيم القريبة. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014111: 18321–6.

      Bullman S و Pedamallu CS و Sicinska E و Clancy TE و Zhang X و Cai D و Neuberg D و Huang K و Guevara F و Nelson T et al. تحليل استدامة المغزلية واستجابة المضادات الحيوية في سرطان القولون والمستقيم. علم. 2017358: 1443–148.

      حسين سي ، روبيو آر سي ، أوسوليفان أو ، كوتر بي دي ، سكانلان بي دي. الحدود الفطرية: تحليل مقارن للطرق المستخدمة في دراسة ميكوبيوم الأمعاء البشرية. ميكروبيول أمامي. 20178: 1432.

      Rosenbaum J، Usyk M، Chen Z، Zolnik CP، Jones HE، Waldron L، Dowd JB، Thorpe LE، Burk RD. تقييم طرق استخلاص الحمض النووي من تجويف الفم على الجراثيم البكتيرية والفطرية. ممثل العلوم .2019: 1531.

      Shkoporov AN و Ryan FJ و Draper LA و Forde A و Stockdale SR و Daly KM و McDonnell SA و Nolan JA و Sutton TDS و Dalmasso M et al. بروتوكولات قابلة للاستنساخ للتحليل الميتاجينومي للعاقمات البراز البشرية. ميكروبيوم. 20186: 68.

      Kim D و Hofstaedter CE و Zhao C و Mattei L و Tanes C و Clarke E و Lauder A و Sherrill-Mix S و Chehoud C و Kelsen J وآخرون. تحسين الأساليب وتجنب المزالق في أبحاث الميكروبيوم. ميكروبيوم. 20175: 52.

      هورنونج BVH ، Zwittink RD ، Kuijper EJ. القضايا والمعايير الحالية للضوابط في أبحاث الميكروبيوم. FEMS Microbiol Ecol. 201995. https://doi.org/10.1093/femsec/fiz045

      Sinha R و Ahsan H و Blaser M و Caporaso JG و Carmical JR و Chan AT و Fodor A و Gail MH و Harris CC و Helzlsouer K وآخرون: الخطوات التالية في دراسة الميكروبيوم البشري والصحة في الدراسات المستقبلية ، Bethesda ، MD ، من 16 إلى 17 مايو 2017. ميكروبيوم 2018 ، 6:210.

      Sinha R و Abnet CC و White O و Knight R و Huttenhower C. مشروع مراقبة جودة الميكروبيوم: تصميم الدراسة الأساسية والتوجهات المستقبلية. جينوم بيول. 201516: 276.


      تقرير مختبر الأحياء عن استخراج الكلوروفيل

      الملخص ركزت هذه التجربة على استخلاص وفصل أصباغ البلاستيدات الخضراء. لإجراء العملية ، تم طحن الأوراق الخضراء في ملاط ​​مع بعض المواد الكيميائية وتم ترشيح السائل لاستخدامه لمزيد من التحليل. تم وضع شرائط من هذا المحلول على ورق ترشيح وبعد التجفيف يتم وضعها في منارة من المذيب. بعد ذلك تم فصل أصباغ البلاستيدات الخضراء بواسطة المذيب إلى مجموعات أكثر أو أقل قابلية للذوبان.

      الهدف كم عدد أنواع الصبغات الموجودة في الورقة الخضراء؟ من المأمول أن تكون قادرًا على تحديد أنواع الأصباغ الأربعة المختلفة للورقة.

      نظرًا لأن ورق الترشيح الذي يحتوي على المذيب سيفصل الأصباغ من حيث القابلية للذوبان ، فمن المتوقع ظهور تجزئة واضحة لكل منها. نظرًا لاستخدام العديد من المواد الكيميائية في العملية الكاملة لهذا المعمل ، فقد يكون لبعض المتغيرات تأثير على النتائج من حيث نقاء كل مادة كيميائية أو نقاء المرشح المستخدم.

      الخلفية إن البلاستيدات الخضراء ، في الأساس ، هي العضية المسؤولة عن التمثيل الضوئي.

      من الناحية الهيكلية ، فهي تشبه إلى حد كبير الميتوكوندريا. يحتوي على غشاء خارجي منفذ ، وغشاء داخلي أقل نفاذية ، ومساحة وسيطة ، وقسم داخلي يسمى العواصف. ومع ذلك ، فإن البلاستيدات الخضراء أكبر من الميتوكوندريا. يجب أن يكون حجمها أكبر لأن غشاءها غير مطوي في الكريستال. كما أن الغشاء الداخلي لا يستخدم في سلسلة نقل الإلكترون.

      في الواقع ، لم يكن أول مرشح استخدمناه هو & # 8217t حتى يحتوي على أصباغ كافية تتفاعل مع المذيب لخلق أي نتائج مفيدة. بعد إعادة طرق الترشيح وشريط الورق ، بدأ المذيب في أداء وظيفته. في غضون حوالي 10 دقائق ، امتص المذيب ببطء في الورق حتى خط القلم الرصاص الرمادي. بعد ذلك ، بعد تجفيف الشريط ، بالكاد يمكن للمرء تحديد لونين متميزين ، كل منهما على بعد بضعة ملليمترات فقط من كل منهما: أخضر مزرق وخط أخضر مصفر.

      ثم أعطانا الأستاذ جلين مقياسًا يجب على أساسه تحديد كل شريط صبغ بلونه الفردي ، وقياس المسافة فيما يتعلق بالأصل (الخط الأول المرسوم باستخدام المرشح) ثم حساب المرجع. كان على المرء أولاً تحديد اللون الدقيق لكل منها ، وكان هذا يمثل مشكلة بعض الشيء ، بسبب التدرج اللوني لمختلف النغمات الموجودة. كما هو موضح في الشكل 1 أو جدول البيانات 2 ، هناك ترتيب محدد لتوزيع كل نطاق لوني. تم حساب REF وفقًا للصيغة التالية: REF = مسافة ترحيل الصبغة (مم)

      تم ترحيل المذيب الأمامي (مم) الشكل 1 & # 8211 كاروتين (برتقالي) & # 8211 كاروتين & # 8211 أصباغ التحليل النفسي في كلوروبلاست & # 8211 الكلوروفيل & # 8211 الكلوروفيل أ (أخضر مزرق) & # 8211 الكلوروفيل ب (أخضر مصفر) الخلاصة كما هو متوقع ، تسبب المذيب في انتقال الأصباغ إلى مجموعات قابلية الذوبان الخاصة بها. كان Chlorophyll B الأخضر المصفر هو النطاق الأول الذي حددناه ، وهاجرنا مم فقط ، وهاجر Chlorophyll A الأخضر المزرق مم. أخبرنا هذا أنه لم يكن هناك سوى الكلوروفيل في الإجازة الخضراء ، على الرغم من أن الطلاب الآخرين الذين أجروا هذه التجربة حققوا أيضًا نتائج مختلفة.

      المشكلة الوحيدة التي يمكن ذكرها حول التصميم العام للمختبر هي الغرف ونظام التهوية # 8217. بعد فتح الزجاجة بالمذيب ، في غضون دقيقتين فقط ، انتشرت رائحة شديدة في الغرفة بأكملها مما جعل بعض الطلاب يشعرون بالدوار أو الصداع. لا توجد اقتراحات حقيقية لهذه المشكلة ، باستثناء التحدث إلى طاقم صيانة المدارس وإخبارهم بإصلاح المراوح. لا يمكن اشتقاق أسباب النتائج الغريبة إلا بسبب حقيقة أن المواد الكيميائية المستخدمة في هذه التجربة كانت نقية بدرجة كافية ، بالإضافة إلى الترشيح الذاتي.


      شاهد الفيديو: عملت فحص الحمض النووي مارح تصدقو من أي بلد طلعت DNA Myheritage test Arab (كانون الثاني 2023).