معلومة

A3. Dimerization ومواقع الربط المتعددة - علم الأحياء

A3. Dimerization ومواقع الربط المتعددة - علم الأحياء


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

في الأمثلة السابقة ، نظرنا في حالة الجزيء الكبير M الذي يربط ligand L في موقع واحد ، كما هو موضح في المعادلة أدناه:

[M + L rightleftharpoons ML ]

أين

[K_d = dfrac {[M] [L]} {[ML]}. التسمية {1} ]

رأينا أن منحنيات الربط ( (ML ) مقابل (L ) أو (Y ) مقابل (L ) هي القطعي، مع (K_d = L ) بنصف الحد الأقصى للربط.

يحدث مثال خاص ، ولكنه شائع لهذا التوازن ، عندما يرتبط الجزيء الكبير بنفسه ليشكل ثنائيات ، كما هو موضح أدناه:

[M + M rightleftharpoons M ^ 2 = D ]

حيث (D ) هو الثنائى وأين

[K_d = dfrac {[M] [M]} {[D]} = dfrac {[M] ^ 2} {[D]} label {11} ]

للوهلة الأولى ، تتوقع أن يكون الرسم البياني ([D] ) مقابل ([M] ) قطعيًا ، مع (K_d ) مرة أخرى يساوي ([M] ) بنصف الحد الأقصى تركيز ديمر. اتضح أن هذا صحيح ، لكن الاشتقاق البسيط منظم لأنه في الاشتقاق السابق ، كان من المفترض أن (M_o ) تم إصلاحه و (L_o ) متنوع. في حالة تشكيل الثنائيات ، (M_o ) ، الذي يمثل بشكل سطحي كلا من (M ) و (L ) في التعبير المشتق السابق ، كلاهما يتغير.

مرة أخرى ، يمكن كتابة تعبير توازن الكتلة لـ (M_o ):

[[M_o] = [M] + 2 [D] label {12} ]

حيث يكون المعامل 2 ضروريًا لأنهم 2 M في كل ثنائى.

بشكل أكثر عمومية ، في حالة تشكيل القواطع (Tri) ، ورباعية العجلات (Tetra) ، وأوليغومرات أخرى ،

[[M_o] = [M] + 2 [D] + 3 [Tri] + 4 [Tetra] + : .... label {13} ]

إعادة ترتيب المعادلة المرجع {12} وحل لـ (M ) يعطي

[[M] = [M_o] -2 [D] label {14} ]

يؤدي استبدال المعادلة ref {14} في التعبير (K_d ) (المعادلة المرجع {1}) إلى

[K_d = dfrac {(M_o-2D) (M_o-2D)} {D} ]

حيث يمكن إعادة ترتيبها في شكل تربيعي:

[4D2 - (4M_o + K_d) D + (M_o) ^ 2 = 0 label {15} ]

وهو الشكل (y = ax ^ 2 + bx + c ). يعطي حل المعادلة التربيعية ([D] ) عند أي ([M_o] ). قيمة (ص ) تشبه التشبع الجزئي، يمكن حسابه ، حيث (Y ) هو جزء من المجموع الممكن (D ) ، والذي يمكن أن يختلف من 0-1.

[Y = dfrac {2 [D]} {[M_o]} label {16} ]

يظهر أدناه رسم بياني لـ (Y ) مقابل (M_o ) مع ثابت تفكك ثنائي الأبعاد (K_d = 25 ، mu M ).

الشكل 1: منحنى ربط التشبع لثنائي جزيء ضخم

لاحظ أن المنحنى يظهر بشكل قطعي مع تشكيل ثنائي الأبعاد نصف أقصى يحدث بتركيز إجمالي (M ) (M_o = K_d ). لاحظ أيضًا أنه حتى عند (M_o = 1000 ، mu M ) ، وهو 40x (K_d ) ، يتم تشكيل 90٪ فقط من الإجمالي الممكن (D ) ( (Y = 0.90) )). من أجل البساطة

[M + L <=> ML ]

التوازن ، إذا (L_o ) = 40x (K_d ) و (M_o ll L_o ) ، إذن

[Y = dfrac {L} {K_d + L} = dfrac {L} {(L / 40) + L} = 0.976 ]

ترتبط حالة تجميع مونومر البروتين ارتباطًا وثيقًا بنشاطه البيولوجي. بالنسبة للبروتينات التي يمكن أن تشكل الثنائيات ، فإن بعضها نشط في الحالة الأحادية ، بينما ينشط البعض الآخر مثل الثنائيات. يمكن للتركيزات العالية ، مثل الموجودة في ظل الظروف التي يتبلور فيها البروتين لتحليل بنية الأشعة السينية ، أن تدفع البروتينات إلى الحالة القاتمة ، مما قد يؤدي إلى استنتاج خاطئ مفاده أن البروتين النشط هو ديمر. تحديد التركيز الفسيولوجي الفعلي لـ ([M_o] ) و (K_d ) يعطي الباحثين معرفة بقيمة (Y ) التي يمكن ربطها بالنشاط البيولوجي. على سبيل المثال ، الإنترلوكين 8 ، وهو كيموكين يربط بعض الخلايا المناعية ، موجود في صورة ثنائيات في التحديدات الهيكلية للأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي ، ولكن كمونومر بتركيزات فسيولوجية. ومن ثم فإن المونومر ، وليس الثنائى ، يربط مستقبلاته بالخلايا المناعية. البروتياز الفيروسي (الهربس الفيروسي ، بروتياز فيروس نقص المناعة البشرية) نشطة في شكل خافت ، حيث يتشكل الموقع النشط في الواجهة البينية.

حالة خاصة أخرى: ربط L إلى موقعين مختلفين Kds

تحقق من الرسم البياني التفاعلي لترى كيف تؤثر الأحجام النسبية لـ Kds عليه.

Wolfram Mathematica CDF Player - ربط L إلى موقعين (مطلوب مكون إضافي مجاني)


التكامل المقارن على تقويم العظام FZD7: مواقع الربط المحفوظة لعوامل النسخ PU.1 و SP1 و CCAAT-box و TCF / LEF / SOX داخل منطقة محفز 5'من تقويم العظام للثدييات FZD7

يتم نقل إشارات WNT الأساسية من خلال مستقبل عائلة Frizzled (FZD) والمستقبل المشترك LRP5 / LRP6 لتنظيم جينات MYC و CCND1 و FGF20 و JAG1 و WISP1 و DKK1 ، بينما يتم نقل إشارات WNT غير الكنسية من خلال مستقبل عائلة FZD و PTK7 / R / مستقبلات مشتركة RYK لتنشيط سلاسل إشارات RHOA / RHOU / RAC / CDC42 و JNK و PKC و NFAT و NLK. يتم تنظيم FZD7 ، المعبر عنه في الجهاز الهضمي الطبيعي ، في سرطان المريء وسرطان المعدة وسرطان القولون والمستقيم وسرطان الخلايا الكبدية. هنا ، تم التعرف على جينات الشمبانزي FZD7 والبقرة Fzd7 وتمييزها باستخدام المعلوماتية الحيوية (Techint) والذكاء البشري (Humint). تم تحديد جينات الشمبانزي FZD7 والبقرة Fzd7 ضمن تسلسل الجينوم NW_001232110.1 و AC173037.2 ، على التوالي. أظهر الشمبانزي FZD7 والبقرة Fzd7 هوية الأحماض الأمينية الكلية بنسبة 100٪ و 97.2٪ مع FZD7 البشري. كانت جميع بقايا الأحماض الأمينية التسعة التي تم استبدالها بين FZD7 البشري و FzE3 البشري متطابقة مع تلك الموجودة في FZD7 البشري في أخصائي تقويم الشمبانزي والبقرة والفأر والجرذان FZD7. التحليلات الوظيفية التي تستخدم FzE3 مع العديد من أدوات الاستنساخ و / أو أخطاء التسلسل غير صالحة. كان أخصائيو تقويم FZD7 عبارة عن بروتينات غشائية مكونة من سبعة غشاء مع مجال Frizzled خارج الخلية ، وعزر leucine zipper حول مجال الغشاء الخامس ، وزخارف ربط DVL- و PDZ السيتوبلازمية. كان Ser550 و Ser556 من أطباء تقويم العظام FZD7 مواقع الفسفرة المفترضة لـ aPKC. تم توقع Dimerization و Ser550 / 556 الفسفرة كآليات تنظيمية للإشارة من خلال FZD7. كان موقع بدء النسخ لجين FZD7 البشري 735 نقطة أساس في المنبع لنهاية NM_003507.1 RefSeq 5'-end. بالإضافة إلى سرطان الجهاز الهضمي وسرطان الخلايا الكبدية وسرطان البنكرياس ، تم التعبير عن FZD7 mRNAs البشرية في الكيسات الأريمية ، والخلايا الجذعية الجنينية غير المتمايزة (ES) ، وأسلاف الأديم الباطن المشتقة من ES ، والأسلاف العصبية المشتقة من ES ، والقوقعة الجنينية ، وظهارة الشبكية الصباغية ، والشم. تجديد الكبد والتصلب المتعدد. كشفت تحليلات الجينوم المقارن أن مواقع الربط لعوامل النسخ PU.1 و SP1 / Krüppel و CCAAT-box و TCF / LEF / SOX تم حفظها بين مناطق محفز 5'من أخصائي تقويم الثدييات FZD7.


يطلق ارتباط المضادات الحيوية منعًا ذاتيًا لمنظم النسخ المضاد للأدوية المتعددة TipA

يمكن للتحقيقات في استراتيجيات المقاومة البكتيرية أن تساعد في تطوير عقاقير جديدة مضادة للميكروبات كإجراء مضاد للانتشار العالمي المتزايد لمقاومة المضادات الحيوية البكتيرية. تتضمن إحدى هذه الإستراتيجيات فئة TipA لعوامل النسخ ، والتي تشكل الحد الأدنى من أنظمة مقاومة الأدوية المتعددة المنظمة (MDR) ضد المضادات الحيوية المتنوعة. ومع ذلك ، ليس لدينا معلومات كافية فيما يتعلق بكيفية تحفيز ارتباط المضادات الحيوية على تنشيط النسخ لتصميم الجزيئات التي يمكن أن تتداخل مع هذه العملية. لمعرفة المزيد ، حددنا التركيب البلوري لـ SkgA من Caulobacter crescentus كبروتين تمثيلي لـ TipA. حددنا اتجاهًا مكانيًا غير متوقع وموقع مجال المستجيب TipAS المرتبط بالمضادات الحيوية في حالة apo. لاحظنا أن منطقة α6-α7 من مجال TipAS ، المسؤولة بشكل قانوني عن تشكيل غطاء الشق المرتبط بالمضادات الحيوية لإحاطة المضاد الحيوي المحكم بإحكام ، متورطة في الواجهة القاتمة وتستقر عبر التفاعل مع مجال ربط الحمض النووي في دولة apo. أظهرت التحليلات الهيكلية والكيميائية الحيوية الإضافية أن مجال TipAS غير المترابط يعيق ارتباطًا بالحمض النووي للمروج ولكنه يخضع لتحول توافقي ملحوظ عند ارتباط المضادات الحيوية لإطلاق هذا التثبيط الذاتي عبر مفتاح منطقة α6-α7 الخاصة به. ومن ثم ، فإن محفزات جينات MDR بما في ذلك بوليميرات TipA و RNA تصبح متاحة للنسخ ، مما يتيح مقاومة فعالة للمضادات الحيوية. تعمل هذه الأفكار حول الآلية الجزيئية لتنشيط بروتينات TipA على تعزيز فهمنا لبروتينات TipA ، وكذلك أنظمة MDR البكتيرية ، وقد توفر أدلة مهمة لمنع المقاومة البكتيرية.

الكلمات الدالة: البروتين المرتبط بالحمض النووي TipA آلية التنشيط المقاومة للمضادات الحيوية الهيكل البلوري المقاوم للمضادات الحيوية المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) هيكل منظم النسخ التنظيمي للنسخ المروج.

حقوق الطبع والنشر © 2020 Jiang et al. تم النشر بواسطة Elsevier Inc. جميع الحقوق محفوظة.

بيان تضارب المصالح

تضارب المصالح - يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة.

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح مع محتويات هذه المقالة


الكيمياء الحيوية - البروتينات الملزمة

يصف الفعالية التي يمكن أن يرتبط بها الارتباط الترابيطي والبروتين.

كلما كانت قيمة Kd أصغر كلما كان الربط أقوى لأن Kd = P L / PL ، كلما زاد Kd كلما كان الربط أضعف.

الاستجابة الخلوية هي نوع من الاستجابة المناعية التي تنطوي على استخدام الخلايا الليمفاوية التائية حيث يمكنهم التخلص من مستضد.

يشار إلى هذه المواقع على أنها حواتم.

يتم استخدام المجال المتغير للتعرف على الحاتمة على الجسم المضاد.

إنه يمتلك شغفًا عاليًا مما يعني أن حدث ربط واحد يمكن أن يؤدي إلى حدث ارتباط آخر بين مولد الضد للحدث بسهولة أكبر.

على سبيل المثال ، منطقة Fab مع موقع واحد للتعرف على الحاتمة والربط لها تقارب معين.

في IgG مع موقعي ربط ، يكون له ارتباط أكبر بمقدار 100 ضعف.

لأن الجسم المضاد قد لا يكون فعالاً لخلية الورم على سبيل المثال ، لكننا نعلم أنه ينتقل مباشرة إلى الورم وإلى خلية الورم فقط

في الهيم الحر ، يمكن لـ Fe2 + ربط الأكسجين ولكن يمكن أيضًا تحويله إلى Fe 3+ (والذي لا يمكنه ربط O2) ، لذلك يجب علينا ربط الهيم بشيء ما.

تشكل نيتروجين الحلقات البيرولية 4 4 من أصل 6 روابط تنسيق محتملة يمكن أن يشكلها Fe2 +.

الهيستيدين القريب
تشارك في تكوين الرابطة مع الحديد مما يسمح لها بوضع الهيم / الحديد بطريقة معينة تساعد في الارتباط بالأكسجين

يجب أن تكون قادرة على إطلاق الأكسجين بتركيزات منخفضة من الأكسجين (أي تركيز الأكسجين في العضلات)

يجب أن يكون الميوغلوبين قادرًا على ربط الأكسجين بشكل فعال حتى في التركيزات المنخفضة (أي في العضلات)

إنه يطلق الأكسجين فقط عندما يكون التركيز منخفضًا جدًا (أي عندما يحتاج إليه ويكون عميقًا في الأنسجة حيث يكون تركيز الأكسجين منخفضًا بشكل ملحوظ)

هذا لأنه في حالة انخفاض تركيز الأكسجين ، لا يوجد ارتباط كبير جدًا لجزيء الأكسجين ، ولكن عند وجود تركيزات عالية جدًا من الأكسجين ، يكون هناك ارتباط كبير.


مراجع

جيروم الخامس ، مولر ر. عوامل النسخ الوهمي الخاصة بالأنسجة والمنظمة بدورة الخلية لاستهداف التعبير الجيني للخلايا السرطانية همهمة جين هناك 1998 9: 2653–2659

بوش إس جيه ، ساسون-كورسي ب. ديمرز وسحابات الليوسين ومجالات ربط الحمض النووي اتجاهات الجينات 1990 6: 36–40

م نويبيرج ، ي أدامكيويتش ، هانتر ج ب ، مولر ر. يشكل بروتين Fos الذي يحتوي على سحاب Jun leucine أداة homodimer التي ترتبط بموقع الربط AP1 طبيعة سجية 1989 341: 243–245

كوزاريدس تي ، زيف إي. سحابات Leucine من fos و jun و GCN4 تملي خصوصية dimerization وبالتالي التحكم في ارتباط DNA طبيعة سجية 1989 340: 568–571

شميت دور ت وآخرون. بناء وتنقية وتوصيف بروتين هجين يشتمل على مجال ربط الحمض النووي لمثبط LexA وسحاب Jun Leucine: دراسة ثنائية اللون دائرية وطفرات الكيمياء الحيوية 1991 30: 9657–9664

كوزاريدس تي ، زيف إي. دور سحاب الليوسين في تفاعل fos-jun طبيعة سجية 1988 336: 646–651

O'Shea EK، Rutkowski R، Stafford WFD، Kim PS. تكوين مغاير مغاير تفضيلي بواسطة سحابات لوسين معزولة من fos و jun علم 1989 245: 646–648

شويرمان م وآخرون. يتوسط نموذج تكرار الليوسين في بروتين Fos تشكيلًا معقدًا باستخدام Jun / AP-1 وهو مطلوب للتحول زنزانة 1989 56: 507–516

Oas TG وآخرون. الهيكل الثانوي لسحاب الليوسين يحدده التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي الكيمياء الحيوية 1990 29: 2891–2894

شورمان إم ، هانتر جي بي ، هينيغ جي ، مولر آر. تساهم البقايا غير الليوسينية في تكرار الليوسين لـ Fos و Jun في الاستقرار وتحديد خصوصية dimerization الدقة الأحماض النووية 1991 19: 739–746

O'Shea EK ، Rutkowski R ، Kim PS. آلية الخصوصية في Fos-Jun oncoprotein heterodimer زنزانة 1992 68: 699–708

جلوفر جيه إن ، هاريسون إس سي. التركيب البلوري لعامل نسخ bZIP غير المتجانسة المرتبط بالحمض النووي طبيعة سجية 1995 373: 257–261

Triezenberg SJ، Kingsbury RC، McKnight SL. تشريح وظيفي لـ VP16 ، المنشط العابر لفيروس الهربس البسيط التعبير الجيني المبكر الفوري تطوير الجينات 1988 2: 718–729

Chasman DI، Kornberg RD. بروتين GAL4: التنقية ، الارتباط مع بروتين GAL80 ، وهيكل المجال المحفوظ مول الخلية بيول 1990 10: 2916–2923

دانغ السيرة الذاتية وآخرون. تشير تفاعلات سحاب الليوسين داخل الخلايا إلى تباين قلة القلة غير المتجانسة c-Myc مول الخلية بيول 1991 11: 954–962

ديفيدسون ج وآخرون. التاريخ التطوري للأنزيمات الثلاثة الأولى في التخليق الحيوي للبيريميدين مقولات بيولوجية 1993 15: 157–164

جونترو ب وآخرون. الخصائص الهيكلية والوظيفية لمركب متعدد الإنزيمات من البلاستيدات الخضراء بالسبانخ. 2. تعديل الخواص الحركية للأنزيمات في الحالة المجمعة Eur J Biochem 1993 217: 1075–1082

Walczak H. وآخرون. نشاط مبيد الأورام ليجند يحفز موت الخلايا المبرمج المرتبط بعامل نخر الورم في الجسم الحي نيتشر ميد 1999 5: 157–163

كالديرون دي ، روبرتس بي إل ، ريتشاردسون دبليو دي ، سميث إيه إي. تسلسل قصير للأحماض الأمينية قادر على تحديد الموقع النووي زنزانة 1984 39: 499–509

رانسون إل جيه ، فيرما إم. الجينات المسرطنة النووية الأولية fos و jun Annu Rev Cell Biol 1990 6: 539–557

ماجستير الفول وآخرون. السمية الخلوية بوساطة الخلايا لسرطان المثانة: تقييم ورشة العمل الدقة السرطان 1975 35: 2902–2913

أوسوبيل الأول ، فريدريك م. البروتوكولات الحالية في البيولوجيا الجزيئية John Wiley & amp Sons: نيويورك 1991

كورنيل الأول ، مان س ، فرنانديز ب ، كيربيل رس. تعزيز الأورام ، وتكوين الميلانين ، والانبثاث من الورم الميلانيني الخبيث البشري بعد زرع تحت الجلد في الفئران العارية معهد السرطان ناتل ي 1989 81: 938–944

كول JL وآخرون. النشاط المضاد للأورام لنقل الجينات العارية bax و p53 في سرطان الرئة: في المختبر و في الجسم الحي التحليلات همهمة جين هناك 1998 9: 2063–2074


تكشف هياكل معقد مستقبلات HER2 / HER3 النشط عن ديناميكيات في واجهة dimerization الناتجة عن ارتباط يجند واحد

يشكل عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2) و HER3 مركبًا غير متجانس مؤيد للأورام عند ارتباط عامل النمو العصبي -1 (NRG1β) 1-3. تظل الآلية التي يتفاعل بها HER2 و HER3 غير معروفة في غياب أي هياكل للمجمع. قمنا بعزل ثنائي HER2 / HER3 المرتبط بـ NRG1β بالقرب من الطول الكامل وحصلنا على إعادة بناء بالمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) لوحدة المجال خارج الخلية والتي تكشف عن ديناميكيات غير متوقعة في واجهة HER2 / HER3 dimerization. لقد أظهرنا أن ذراع dimerization من HER3 المرتبط بـ NRG1β لم يتم حله على الأرجح لأن مونومر apo HER2 يفشل في الخضوع للتغيير المطابق الناجم عن الترابط اللازم لإنشاء جيب ربط ذراع ثنائي الأبعاد HER3. في البنية الثانية لطافرة المجال خارج الخلية السرطانية لـ HER2 ، S310F ، نلاحظ تفاعلًا تعويضيًا مع ذراع التباين HER3 الذي يعمل على استقرار واجهة dimerization. لقد أظهرنا أن كلاً من HER2 / HER3 و HER2-S310F / HER3 يحتفظان بالقدرة على الارتباط بالجسم المضاد العلاجي الموجه بـ HER2 ، تراستوزوماب ، لكن المركب الطافر لا يرتبط ببيرتوزوماب. يوضح هيكل 3.5 الخاص بنا لمركب HER2-S310F / HER3 / NRG1β / trastuzumab ربط مستضد شظية (Fab) أن ديمر المستقبل يخضع لتغييرات مطابقة لاستيعاب تراستوزوماب. وهكذا ، مثل الطفرات الورمية ، تستغل العلاجات الديناميكيات الجوهرية لمغاير HER2 / HER3. تؤكد الميزات الفريدة لمغير متغاير HER2 / HER3 المرتبط بشكل فردي على الاستشعار الخيفي لشغل ligand من خلال واجهة dimerization وتشرح سبب عدم ارتباط المجالات خارج الخلية لـ HER2 عبر واجهة dimer نشطة متعارف عليها.


تعمل الطفرات النقطية في الأشكال ثنائية الأبعاد في مجال الغشاء على استقرار الحالة النشطة أو غير النشطة لمستقبل EphA2 التيروزين كيناز

يلعب مستقبل EphA2 التيروزين كيناز دورًا رئيسيًا في تنظيم التصاق الخلايا والتوجيه في العديد من الأنسجة البشرية. يحدث تنشيط EphA2 بعد عملية ثنائية / قلة قلة مناسبة في غشاء البلازما ، والتي تحدث بمشاركة المجالات خارج الخلية والهيولي. كشفت دراستنا أن مجال الغشاء المعزول (TMD) الخاص بـ EphA2 المضمن في bicelle الشحمي يتضاءل عبر نموذج تكرار heptad L (535) X3G (539) X2A (542) X3V (546) X2L (549) بدلاً من الجلايسين البديل. عزر السوستة A (536) X3G (540) X3G (544) (نموذجي لضعف TMD في العديد من البروتينات). لتقييم أهمية تفاعلات TMD لـ EphA2 كامل الطول ، استبدلنا المخلفات الرئيسية في شكل تكرار سباعي (متغير HR: G539I ، A542I ، G553I) أو في شكل سحاب الجلايسين (متغير GZ: G540I ، G544I) وعبرنا عن YFP- تم وضع علامة على EphA2 (متغيرات WT و HR و GZ) في خلايا HEK293T. كشف الفحص المجهري متحد البؤر عن توزيع مشابه لجميع متغيرات EphA2-YFP في الخلايا. تم تحليل التعبير عن متغيرات EphA2-YFP ونشاطها كيناز (فسفرة Tyr (588) و / أو Tyr (594)) وربط ephrin-A3 باستخدام قياس التدفق الخلوي على أساس خلية واحدة. تم العثور على تنشيط أي متغير من EphA2 حتى بدون تحفيز الإيفرين عندما يكون محتوى EphA2 في الخلايا مرتفعًا بدرجة كافية. لا يتأثر ارتباط Ephrin-A3 في المتغيرات الطافرة. الطفرات في TMD لها تأثير كبير على نشاط EphA2. تم تحسين كل من الأنشطة المعتمدة على الترابط والمستقلة عن الترابط لمتغير الموارد البشرية وتقليلها لمتغير GZ مقارنةً بـ WT. تسمح لنا هذه النتائج باقتراح تبديل تباين TMD بين تكرار heptad وزخارف سحاب الجلايسين ، المقابلة لحالات المستقبل غير النشطة والنشطة ، على التوالي ، كآلية أساسية لتوصيل إشارة EphA2.

الكلمات الدالة: بديل خافض للخلية مستقبلات سطح الخلية Eph مستقبلات التدفق الخلوي غشاء بروتينات مجالات البروتين مستقبلات مجال انتقال التيروزين كينيز.

© 2014 من قبل الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية ، وشركة.


نقاش

استخدمت هذه الدراسة الفحص المجهري متحد البؤر جنبًا إلى جنب مع نظام نضح التبادل السريع للتحقيق في التفاعلات التعاونية الناتجة عن تجانس A1-ARs أو A.3-ار على سطح الخلايا الحية. على عكس أ1-AR ، لوحظت تفاعلات تعاونية عالية بين الروابط التنافسية في المنطقة A.3-ار. يمكن تقليل هذه التأثيرات بشكل كبير عند تعايش A3-AR GFP مع A غير ملزم ليجند3(N250A) -AR YFP ، مما يشير إلى أن التعاون بين الروابط التنافسية ينشأ نتيجة للتفاعلات بين A3-ARs على سطح الخلية. تلائم البيانات الحركية لاحقًا نموذجًا رياضيًا ديناميكيًا للتقسيم التأسيسي للسماح ، لأول مرة ، بالتقدير الكمي للتفاعلات بين الروابط التنافسية في GPCR المتماثل في الخلايا الحية.

في علم الصيدلة GPCR الكلاسيكي ، يتم تعريف الروابط بواسطة خاصيتين مستقلتين عن النظام ، التقارب والفعالية الجوهرية. ومع ذلك ، فقد حددت الدراسات الحديثة ملفات تعريف ارتباط وتشوير GPCR التي لا تتوافق مع هذا الإطار النظري. أدى اكتشاف الروابط الخيفية والرباطات التقويمية الانتقائية وظيفيًا إلى ظهور ظاهرة الاعتماد على المسبار ، وعلى هذا النحو ، فإن الحاجة إلى دراسة متأنية للروابط الترابطية والمقايسات الوظيفية المستخدمة عند فحص الأدوية المرشحة (6). يتم تقديم طبقات إضافية من التعقيد عند وصف أحداث الربط الترابطي والتشوير داخل الخلايا في ثنائيات GPCR أو أوليغومرات الرتبة الأعلى. التفاعلات المتجانسة وغير المتجانسة بين GPCRs لديها القدرة على الاعتماد على المسبار ، كثافة المستقبلات ، والأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذه الخصائص المعتمدة على النظام لتفاعلات GPCR-GPCR قد تمثل أيضًا طرقًا علاجية جديدة محتملة لتطوير الأدوية المرشحة التي تعدل الإشارات داخل الخلايا GPCR مع انتقائية وظيفية و / أو انتقائية مكانية أكبر (12).

حتى الآن ، استخدمت غالبية الدراسات التي تبحث في ثنائيات GPCR في الخلايا الحية تقنيات مثل نقل طاقة الرنين (RET) أو BiFC. داخل عائلة مستقبلات الأدينوزين ، يشير BiFC بين شظايا YFP إلى أن كلا من A1-AR و A3-يمكن أن تشكل AR مجمعات متجانسة (الشكل 2 والمرجع 38). على الرغم من أن BiFC و RET بين GPCRs يمكن أن تكون قوية جدًا في الكشف عن قرب المستقبل في الخلايا الحية ، عند استخدامها بمفردها ، لا يمكن لهذه الطرق تحديد النتائج الدوائية أو الفسيولوجية لتفاعلات GPCR-GPCR. يجب أن تكون التفاعلات التعاونية حاضرة لكي يكون لثنائي GPCR تأثير على ارتباط و / أو وظيفة الترابط ، ومع ذلك ، فقد بحثت دراسات قليلة في هذه الظاهرة في الخلايا الحية (11 ، 12). يمكن أن يوفر التحديد الكمي لعوامل التعاون التي تعتمد على المسبار إطارًا ميكانيكيًا يمكن من خلاله فهم تأثير dimerization على تفاعلات ligand-GPCR ، وعلى هذا النحو ، تطوير علاقات نشاط الهيكل لتفاعل الترابط عبر واجهة باهتة.

يمثل التحقيق في حركيات التفكك لرابط التتبع في غياب ووجود رابط ثانٍ طريقة حساسة للكشف عن التفاعلات التعاونية بين موقعي ارتباط طوبوغرافيين متميزين. تم وصف مشتق الأدينوزين الفلوريسنت ABA-X-BY630 المستخدم في هذه الدراسة بشكل جيد سابقًا (33 ، 39). في كل من CHO-A1 و CHO-A3 احتفظت خلايا ABA-X-BY630 بالقدرة على تحفيز تعبئة الكالسيوم و ERK1 / 2 الفسفرة بطريقة تعتمد على التركيز. تتبع حركيات الارتباط المحددة للارتباط والتفكك لتركيزات ABA-X-BY630 ضمن النطاق النانوي ترابطًا أحادي التكافؤ والانحلال على التوالي. تشير هذه النتائج معًا إلى أنه ، على غرار الأدينوزين الداخلي ، يعمل ABA-X-BY630 بمثابة ناهض تقويم العظام الكلاسيكي في كل من A1-AR و A3-ار. كان لمناهض مستقبلات الأدينوزين غير الانتقائي XAC ومضادات مستقبلات الأدينوزين غير الانتقائية NECA والأدينوزين تأثيرات متباينة على تفكك ABA-X-BY630 ، في A1-AR و A3-ار. في A3-AR ، توسطت كل من الروابط غير الانتقائية في تحسين تفكك ABA-X-BY630 (الشكل 5 أ). في المقابل ، في A1-AR ، توسط كل من الروابط الصغيرة ،

1.5 ضعف ، زيادة في تفكك ABA-X-BY630 (الشكل 5 ب). تأثير الروابط التنافسية على تفكك ABA-X-BY630 في منطقة A.3- لا يمكن أن يعكس AR إعادة ربط ABA-X-BY630 في ظل ظروف التخفيف اللانهائي أو A.3- عزل AR من سطح الخلية. وذلك لأن الجمع بين ارتباط ABA-X-BY630 وحده وتفكك ABA-X-BY630 في وجود تركيز مشبع للمضاد لا يتوافقان مع قواعد الفعل الجماعي البسيط ، أي أن معدل الارتباط المرصود أبطأ من معدل التفكك. علاوة على ذلك ، فإن الاختلاف الكبير بين A1-AR و A3- يجب أن يكون AR محددًا بالمستقبل ، حيث تظل الروابط الفلورية ، والروابط التنافسية ، وخلفية الخلية ثابتة. ومن المثير للاهتمام ، أنه من غير المحتمل أن تكون التفاعلات التعاونية نتيجة لكثافة المستقبل العالية ، لأن تعبير المستقبل هو

4 أضعاف أكبر في خلايا A1-CHO مقارنة بـ A.3خلايا -CHO.

التفاعلات التعاونية في A3يمكن تثبيط مستقبل -AR بين ABA-X-BY630 و NECA بطريقة تعتمد على التركيز من خلال وجود متحولة A غير مرتبطة بالرابط.3-AR على سطح الخلية. تضمنت هذه التجارب نقل العدوى من A3-AR GFP و A3(N250A) -AR YFP في خلايا CHO. يمثل الفك الطيفي للصور (كنفوكل) طريقة قوية لفصل الأسفار الناتج عن GFP و YFP متحمس في وقت واحد. في مجال الرؤية ، اختلفت نسب كثافة مضان GFP / YFP بشكل كبير من خلية إلى أخرى. على هذا النحو ، تم تحديد تحليل الخلية الواحدة للتفاعلات التعاونية للخلايا حيث كان المتغير الوحيد هو نسبة A.3AR GFP إلى A3(N250A) AR YFP. زيادة نسبة أ3(N250A) -AR YFP على سطح الخلية ، والذي من المحتمل أن يرتبط بزيادة A3-AR GFP / A3(N250A) -AR YFP dimers ، بوساطة انخفاض تدريجي في التعاون بين ABA-X-BY630 و NECA. لا ينبغي أن تتأثر التفاعلات الخيفية داخل مستقبل أحادي اللون بوجود مستقبل متحولة غير ملزمة. الانخفاض الملحوظ في التعاون في وجود A.3(N250A) -AR YFP يقترح وجود A.3-AR YFP / A3(N250A) -AR YFP dimers وليس هناك تأثير للبروتومر غير المرتبط بالليغند على protomer الرابط ليجند. تدعم هذه النتائج الاقتراح القائل في CHO-A3 الخلايا ، يتم التوسط في التفاعلات الخيفية الملحوظة عبر A3- مركب homomeric.

التأثيرات المماثلة للمنبهات والمناهضات فيما يتعلق بالزيادة في تفكك ABA-X-BY630 من A3- تتوافق AR مع عدد من الدراسات السابقة التي تصف التفاعلات المتجانسة وغير المتجانسة وتشير إلى أن التفاعلات التعاونية عبر واجهة GPCR باهتة لا تتطلب بالضرورة تنشيط المستقبل (11 ، 12). دراسة حديثة في الدوبامين د2 المستقبل ، الذي يحقق في عواقب إشارات المصب لتفاعلات GPCR-GPCR ، لاحظ تفاعلات تعاونية معارضة بين ناهض ناهض و ناهض عكسي ناهض للربط D2 homodimer مستقبلات (42). على عكس الدوبامين د2 homdimers المستقبل ، التعاون في الأدينوزين أ3 لا ترتبط متجانسات المستقبلات بفعالية الترابطية. ومع ذلك ، نظرًا للطبيعة الخيفية المعقدة لمتجانسات GPCR والمتجانسات ، فربما لا يكون من المستغرب أن تختلف التفاعلات الخيفية اعتمادًا على المستقبل والمسبار والأنسجة التي تم فحصها.

لتحديد التفاعلات الخيفية ، يلزم وجود إطار ميكانيكي. الهدف العام من النمذجة الرياضية في علم الصيدلة GPCR هو تطوير نموذج يمكنه وصف التفاعلات الخيفية بشكل مناسب باستخدام الحد الأدنى من عدد المعلمات. إن أبسط نموذج يصف التعديل الخيفي لألفة الترابط في المقاييس المتغايرة التأسيسية هو النموذج المركب الثلاثي. في حالة التجانس التأسيسي ، يجب تمديد نموذج المركب الثلاثي للسماح بالشغل المتزامن للمحايم المتماثل بمقدار جزيئين من نفس الرابط. ضمن هذا النموذج ، يعتمد الارتباط على تقارب اللجند لكل من homodimer الحرة والمشغولة بشكل فردي. عند وصف ارتباط 2 من الروابط المختلفة هيكليًا ، يتم توسيع النموذج البسيط للتحويل المتجانس التأسيسي لـ GPCR ، والذي يتم وصفه الآن بواسطة 2 من ثوابت التقارب و 3 عوامل تعاونية. تم اشتقاق نسخة حركية من تجانس GPCR التأسيسي ضمن هذه الدراسات لتحديد التفاعلات التعاونية بين الروابط التنافسية في A3المتجانسين -AR. ضمن هذا النموذج ، افتراض أن أ3- توجد AR مثل homodimers التأسيسية المتوافقة مع الدراسات السابقة التي تشير إلى أن GPCRs تولد وتعمل وتموت على شكل ثنائيات (43 ، 44). ينتج نموذج تجانس المستقبلات حلول تحليلية للكسور المرتبطة كوظائف لمعلمات الربط وتركيزات الترابط ، وكذلك الوقت للأنظمة الديناميكية. لذلك يمكن استخدام روتين تقدير المعلمات الحسابية غير المكلف نسبيًا للحصول على تقديرات ثابتة لمعدل الترابط وتعاونية. التفاعلات بين homodimeric مرتبط في وقت واحد3تم العثور على مواقع -AR بشكل عام لتكون متعاونة بشكل سلبي. يمثل تحليل البيانات الحركية نهجًا عالي المحتوى للتحقيق في تفاعلات GPCR-GPCR. علاوة على ذلك ، قد يمثل التحليل الحركي لعلم الصيدلة GPCR نهجًا أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية لفهم الأحداث المرتبطة بالرابطات الداخلية والتي نادرًا ما تكون في حالة توازن داخل الجسم.

ملاحظة غير متوقعة في هذه الدراسات هي التأثير المتناقض للروابط غير الانتقائية على حركية تفكك ABA-X-BY630 من A1-AR مقارنة بـ A.3-ار. ال3-AR هو سريع التحسس عند مقارنته بالأعضاء الآخرين في AR (45). تفكك معزز لجزيئين من الأدينوزين المرتبط بـ A.3- قد يعكس homodimer -AR آلية فسيولوجية إضافية لتقليل وقت مكوث الأدينوزين الداخلي بتركيزات عالية من الناحية الفيزيولوجية المرضية. فيما يتعلق باكتشاف الأدوية ، زادت A3تم اقتراح التعبير -AR في عدد من الأنواع المختلفة من الخلايا السرطانية ليكون له دور في تكاثر الخلايا وهجرتها. على هذا النحو ، إذا كان أ3- تجانس AR هو كثافة المستقبلات و / أو الأنسجة المعتمدة ، الروابط التي تميز بين A3- قد تمثل مونومرات AR و homomers استراتيجية علاجية جديدة للاستهداف الانتقائي للخلايا السرطانية في علاج السرطان (46).

ال3-AR هو هدف علاجي جديد محتمل لعدد من الحالات ، بما في ذلك الاضطرابات الالتهابية والسرطان (46 ، 47). حددت هذه الدراسة وقيمت التفاعلات المتجانسة الجديدة بين الأم أ3- ريال سعودي. يمثل النهج الحركي والرياضي المستخدم في هذه الدراسة طريقة قوية لاكتشاف وتفسير التفاعلات التعاونية بين الترابط الخيفي و / أو التقويمي. ميزة إضافية لهذا النهج هي أنه من السهل دراسة التفاعلات بين GPCRs المعبر عنها داخليًا في سياق فسيولوجي.


شاهد الفيديو: DNA البرنامج التدريبي التخصصي في مادة الأحياء - تضاعف الدي أن آي (شهر اكتوبر 2022).